寨卡病毒特异性诊断表位发现

摘要

在本实验方案中，我们描述了一种利用高密度肽微阵列发现寨卡病毒特异性诊断肽的技术。该方案可 readily 适用于其他新发传染病的研究。

摘要

高密度肽微阵列可在单个标准显微镜载玻片上同时筛选六千多种以上的肽。该方法可用于药物发现、治疗靶点鉴定以及诊断技术的开发。本文介绍了一种利用高密度肽微阵列发现特异性寨卡病毒（ZIKV）诊断肽的实验方案。将经确认感染寨卡病毒（ZIKV）的人血清样本与高密度肽微阵列共同孵育，该微阵列包含由整个ZIKV蛋白序列转化而来的3,423种独特的15个线性氨基酸（aa）残基肽段，相邻肽段间具有14个氨基酸残基的重叠，并以双份形式点样。在同一微阵列上使用不同的二抗进行染色，检测到可与血清中存在的免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗体结合的肽段。这些肽段被选中用于后续验证实验。本方案中，我们详细描述了高密度肽微阵列的设计、处理及分析策略。

引言

基于临床症状诊断寨卡病毒（ZIKV）感染具有挑战性，因为其传播媒介、地理分布和症状与登革病毒和基孔肯雅病毒感染相似¹。鉴于孕妇在妊娠期间感染ZIKV可能导致不良妊娠结局，区分这三种病毒尤为重要。尽管现有的分子诊断检测具有特异性，但仅在急性感染期相对较短的时间内对血液或唾液样本有效^2,3。因此，在感染初期之后，血清学检测对于诊断至关重要⁴。

开发针对寨卡病毒（ZIKV）的特异性血清学检测方法面临两个挑战：第一，目前尚不清楚人类免疫系统所识别的寨卡病毒抗原；第二，黄病毒属中保守的氨基酸序列会引发抗体交叉反应。我们的目标是发现可用于诊断的ZIKV特异性多肽。已有多种方法被用于筛选覆盖整个蛋白质的多肽文库，包括噬菌体、细菌和酵母表面展示技术^5,6,7,8,9,10。我们的策略是采用高密度多肽微阵列，该技术可实现快速、低成本的高通量血清学筛查^11,12，随后可将鉴定出的多肽用于改进现有的ZIKV感染血清学检测方法。

该方案利用高密度肽微阵列技术，实现寨卡病毒特异性诊断肽的发现图1）。高密度肽微阵列采用肽激光打印技术制备。基于法属波利尼西亚毒株（GenBank: KJ776791.2）的ZIKV全长蛋白序列，共包含3,423个氨基酸残基，以每段15个线性氨基酸残基为单位，相邻肽段间重叠14个氨基酸残基，重复打印于标准玻片上，共形成6,846个肽点。除Zika病毒全长蛋白序列肽段外，该微阵列还包含流感病毒血凝素（Influenza hemagglutinin） （HA）肽作为内参对照。

使用来自瓦兹沃思中心（纽约州奥尔巴尼）的经验证为寨卡病毒阳性的血清样本，以鉴定特异性的免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）反应性肽段。将微阵列与样本在4℃孵育过夜后，用荧光染料标记的二抗（抗人IgM或抗人IgG）进行染色，并在微阵列扫描仪上进行分析。斑点信号强度的定量及肽段注释采用微阵列制造商提供的专用软件完成。

方案

这些数据来自纽约大学牙医学院开展的一项正在进行的研究，已获得纽约大学医学院机构审查委员会（IRB # H10-01894）的批准。本研究使用的临床样本为去标识化的样本，此前已用于诊断，并获得了纽约州卫生部沃兹沃思中心（位于纽约州奥尔巴尼）的使用许可。

1. 将寨卡病毒高密度肽微阵列芯片安装至特定孵育托盘中

1. 使用无粉手套仅触碰载玻片边缘进行操作。载玻片尺寸为 75.4 mm × 25.0 mm，厚度为 1 mm。将载玻片放入孵育盘中，确保微阵列表面朝上。
2. 将密封垫的光面朝下，覆盖在微阵列表面。为确保位置准确，需使密封垫上的螺孔与底板上的螺孔对齐重合。
3. 将孵育盘上部置于密封垫上，形成微阵列反应室。
4. 用手以对角交替顺序依次均匀拧紧螺钉，起始于左上方，随后为右下方，逐个旋紧以固定载玻片。盖上孵育盘的盖子。

2. 背景相互作用检测：用二抗染色微阵列

注意：使用移液器将溶液（标准缓冲液和封闭缓冲液、稀释的二抗）滴加到芯片室的角落。

1. 将微阵列置于标准缓冲液（1×磷酸盐缓冲液（PBS），0.05% Tween 20，pH 7.4，经0.45 µm滤膜过滤）中孵育，每张微阵列总体积为2,000 µL，在室温（RT）下以140 rpm转速于摇床上孵育15分钟。
2. 用移液器从微阵列腔室的角落吸除标准缓冲液。在空的载片架中放入空白载片，以防止微阵列载片破损。
3. 用封闭缓冲液（每张微阵列总体积为2,000 µL）在室温（RT）下以140 rpm转速于摇床上封闭微阵列60分钟。
4. 用移液器从微阵列腔室的角落吸除封闭缓冲液。
5. 将微阵列与二抗（抗人IgM荧光染料偶联抗体）在染色缓冲液（标准缓冲液中含10%封闭缓冲液）中按1:5,000稀释后孵育，每张微阵列总体积为2,000 µL，在室温（RT）避光条件下以140 rpm转速于摇床上孵育30分钟。
6. 用移液器从微阵列腔室的角落吸除二抗溶液。
7. 用标准缓冲液洗涤微阵列3次，每次1分钟，每次洗涤使用2,000 µL缓冲液，在室温下以140 rpm转速于摇床上进行。每次洗涤后，用移液器从微阵列腔室的角落吸除标准缓冲液。
8. 将载片浸入新配制的浸洗缓冲液（1 mM Tris，pH 7.4）中两次，每次浸洗总体积为200 mL。
9. 小心吸除载片表面多余的液体，从载片顶部到底部进行操作，避免接触载片表面，轻柔干燥约1分钟。随后将载片放入微阵列扫描仪中进行分析。

3. 将微阵列暴露于宿主血清中

注意：由于血清样本可能具有传染性，该步骤必须在实验室安全条件下于生物安全二级（BSL-2）环境中进行，并在II级生物安全柜（BSC）内操作。

1. 在56 °C下灭活血清样本30分钟，并在4 °C下以16,000 rcf离心5分钟¹³。
   注意：使用移液器将溶液（染色液、标准缓冲液和稀释后的血清）从微阵列腔室的角落加入。
2. 用染色缓冲液稀释血清样本，起始稀释比例为1:1,000（总体积为2,000 μL/微阵列）。稀释后保存于4 °C，待用。
3. 将微阵列在室温下置于染色缓冲液中孵育15分钟，置于140 rpm的旋转摇床上（总体积为2,000 μL/微阵列）。
4. 用移液器从微阵列腔室的角落吸出染色缓冲液以去除。
5. 将微阵列与稀释后的血清样本在4 °C下孵育过夜，置于140 rpm的旋转摇床上（总体积为2,000 μL/微阵列）。
6. 用移液器从微阵列腔室的角落吸出稀释后的血清样本以去除。
7. 用标准缓冲液清洗微阵列3次，每次1分钟（每次使用2,000 μL/微阵列，室温下置于140 rpm的旋转摇床上）。每次清洗后，用移液器从微阵列腔室的角落吸出标准缓冲液。

4. 使用二抗和标记对照抗体进行染色

注意：使用移液器将溶液（标准缓冲液、稀释的二抗和标记抗体）滴加到微阵列腔室的角落。

1. 用染色缓冲液稀释二抗。
   注意：使用荧光染料标记的抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，按1:5,000稀释（每张微阵列总体积为2,000 µL）加入染色缓冲液中。
2. 将对照标记抗体（单克隆荧光染料标记抗HA抗体）按1:1,000稀释（每张微阵列总体积为2,000 µL）加入染色缓冲液中，并与先前用染色缓冲液稀释的二抗混合。
3. 在室温避光条件下，于140 rpm的振荡器上孵育30分钟。
4. 用移液器从微阵列腔室的角落吸出已稀释的二抗和标记抗体混合液。
5. 用标准缓冲液洗涤3次（每张微阵列每次总体积为2,000 µL），每次在140 rpm振荡器上洗涤1分钟。每次洗涤后，用移液器从微阵列腔室的角落吸出标准缓冲液。

5. 芯片扫描

1. 将载玻片浸入新配制的浸渍缓冲液（1 mM Tris，pH 7.4）中两次（总体积为 200 mL）。
2. 小心干燥微阵列，时间约为 1 分钟，从载玻片顶部到底部极其轻柔地抽吸液体，避免接触载玻片表面。
3. 按照扫描仪的说明对微阵列进行扫描。将载玻片放置在扫描仪上时，确保打印面朝上。
4. 创建一个新项目并选择扫描区域。设置扫描仪参数如下：分辨率为 21 µm，700 nm 和 800 nm 两个通道的强度均为 7.0，扫描质量为中等，偏移量为 0.8。
5. 获取扫描原始图像，并将其保存为 16 位灰度 TIFF 文件格式。

6. 使用特定软件进行微阵列分析

1. 打开原始图像（TIFF 图像）。打开阵列网格文件。
2. 使用计算机的鼠标或键盘方向键将阵列网格与扫描图像对齐。
3. 在特定软件中选择 "定量分析选中区域"，该操作将生成一个读出文件，其中包含每个点的信号强度、背景值以及对应的肽序列。
   注意：此输出文件也可导入电子表格程序，用于进一步分析和绘图。

7. 微阵列储存

1. 将微阵列在无氧氮气或氩气环境中密封，避光保存于 4 °C。

结果

使用所述方案获得的结果如图2 和图3所示。在使用抗人IgM二抗对微阵列进行预染色时，未观察到背景相互作用（数据未显示）。使用抗人IgM偶联物染色后，多个区域的绿色荧光强度高于背景，表明这些肽段与宿主血清样本中的IgM发生了结合（图2）。IgG检测（红色荧光信号）仅显示出少数几个肽段（图2）。

由同一微阵列制造商提供的专用软件在扫描后对微阵列进行分析。生成的读出文件包含每个点的信号强度、背景值以及对应的肽序列。通过绘制从原始值中减去背景后获得的绿色前景中位数值，可将每种对IgM产生强反应的肽的点荧光强度可视化（图3）。

...

讨论

我们设计了一项实验方案，利用包含寨卡病毒全蛋白序列（法属波利尼西亚株）的高密度肽微阵列。该微阵列通过点样3,423种不同的重叠线性肽制备而成，每种肽段长度为15个氨基酸，相邻肽段在序列上仅有一个氨基酸残基的差异。即，14个残基重叠）。尽管可以打印较短的重叠片段，但较长的重叠片段可使表位定位更加精确。每种多肽均打印两次以提高可靠性。

实验开始前，必须先用二抗对微阵列进行预染色，以检测可能存在的背景信号，并将其与样本特异性信号区分开来。使用特定的封闭缓冲液也至关重要，因为其他封闭剂（如牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉）可能导致信号强度降低。一份经验证含有ZIKV IgM抗体的血清样本最初以1:1,000稀释度与微阵列孵育，但未检测到信号。随后将稀释度降低至1:500，结果在与样本中IgM抗体发生反应的肽段上观察到微弱信号。当经验证的寨卡病毒（Zika）血清样本稀释至1:250时，获得了最佳结果。为避免背景信号增强，未再使用更高浓度的血清样本进行重复测试。操作微阵列时需格外小心，以防刮伤其表面。因此，稀释后的血清和标准缓冲液等溶液应从微阵列反应室的角落加入和移除。另一个...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PEPperCHIP 定制多肽微阵列	PEPperPRINT	PPC.001.001	定制多肽微阵列：我们的微阵列包含完整的寨卡病毒蛋白序列
PEPperCHIP 孵育槽 3/1	PEPperPRINT	PPC.004.001
PEPperCHIP 染色试剂盒（680 nm）（抗 HA，DyLight 标记）	PEPperPRINT	PPC.037.002
PepSLide 分析仪	PEPperPRINT	PSA.004.001	14 天免费 Windows 许可证
Rockland 封闭缓冲液	Rockland	MB-070
抗人 IgM（μ 链）DyLight 800	Rockland	609-145-007
抗人 IgG Fc DyLight 680	Thermo Scientific	SA5-10138
LI-COR Odyssey 成像系统	LI-COR
轨道摇床设备	IKA	MTS 2/4 数字微孔板摇床
Adobe Illustrator	Adobe
Deltagraph	Redrocks