需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量

6.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56795

⸱

2018年1月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们已成功建立了两种底物特异性的γ-分泌酶检测方法。本文介绍的两种基于细胞的检测方法均通过萤火虫荧光素酶报告基因的信号输出来定量γ-分泌酶的酶活性。

摘要

我们开发了一对基于细胞的报告基因检测方法，用于定量测量γ-分泌酶对不同底物的切割。本文描述了利用Gal4启动子驱动的萤光素酶报告系统，监测γ-分泌酶介导的APP-C99或Notch切割的实验流程。这些检测方法通过将Gal4驱动的萤光素酶报告基因与APP的C末端片段（APP-C99；CG细胞）或Notch-ΔE（NΔE；NG细胞）分别与Gal4/VP16标签稳定共转染至HEK293细胞中而建立。通过平行使用这两种报告基因检测，我们证明了ErbB2抑制剂CL-387,785可优先抑制CG细胞中APP-C99的γ-分泌酶切割，但对NG细胞中的NΔE切割无此作用。CG细胞与NG细胞在CL-387,785处理下表现出的差异性反应，正是γ-分泌酶调节剂所期望的特征，这与DAPT引起的γ-分泌酶广谱抑制形成鲜明对比。我们的研究为在细胞环境中区分γ-分泌酶对不同底物的活性提供了直接证据。因此，这些新检测方法可能成为药物研发中改进阿尔茨海默病（AD）疗法的有用工具。

引言

淀粉样蛋白-β（Aβ）的寡聚体形式被认为是阿尔茨海默病（AD）患者大脑中神经退行性变的主要原因1。Aβ肽是由淀粉样前体蛋白（APP）经逐步剪切产生的，首先由β-分泌酶剪切，然后由γ-分泌酶剪切2。在过去十年中，针对AD的治疗策略主要集中于抑制Aβ的生成3。大多数研究聚焦于增强α-分泌酶活性（可阻止γ-分泌酶对APP的剪切，从而减少Aβ的生成）或抑制β-和/或γ-分泌酶的活性4。然而，非选择性地抑制β-或γ-分泌酶会干扰这些酶对其他生理底物的正常功能，导致不可避免的副作用5,6。关于γ-分泌酶抑制剂，最近的研究报道发现了若干种化学和遗传调节因子，可在对Notch蛋白的必需γ-分泌酶介导加工过程影响极小的情况下调节Aβ的生成7,8,9,10,11,12，但目前尚未成功开发出有效的治疗药物。因此，有必要进一步开展系统性筛选，以发现能够选择性调节γ-分泌酶介导的APP加工过程的新型遗传和化学修饰因子。

γ-分泌酶已知可切割超过90种不同的膜锚定蛋白。这些底物中包括Notch，其活性在发育过程中对细胞命运决定和分化至关重要。13在不影响Notch剪切的前提下，选择性调控γ-分泌酶催化的APP加工过程，对于最小化γ-分泌酶抑制剂相关的Notch相关副作用至关重要。这种选择性被认为将决定潜在γ-分泌酶调节剂在阿尔茨海默病（AD）慢性治疗中生物疗效的主要因素。已有多种芳基磺酰胺类衍生物，如GSI-953（begacestat）和BMS-708163（avagacestat），被发现可有效且选择性地抑制γ-分泌酶。14,15先前的一项研究已证明，可通过基于定量ELISA的检测方法结合 在体内 使用斑马鱼进行验证16此外，已建立基于细胞的检测方法，以研究γ-分泌酶对APP和Notch的潜在底物选择性。17,18采用与本文所述相似的实验方案，我们近期发现了一类新型的(D)-亮氨酰胺化合物，其可有效调节APP的γ-分泌酶切割，并具有选择性保留Notch功能的特性19综上所述，这一系列研究提供了概念验证，支持γ-分泌酶的底物选择性/可及性可受到化学调控并进行实验验证的观点。然而，这些检测平台通常依赖于通量相对较低的检测方法和劳动密集型的操作流程，可能难以满足工业级药物发现项目的要求。

我们近期开发了基于细胞的荧光素酶报告基因检测方法，可定量测定γ-分泌酶对两种不同底物的催化活性，这两种底物分别为淀粉样前体蛋白（APP）的99个氨基酸组成的C端片段（APP-C99）以及细胞外结构域缺失的Notch肽段（NΔE）。APP-C99和NΔE已被广泛用作多种检测中γ-分泌酶的直接底物。为了建立均一且稳定的针对γ-分泌酶切割APP-C99或NΔE的荧光素酶报告基因检测体系，我们构建了一种来源于HEK细胞的稳定细胞系（CG），该细胞系持续表达由Gal4启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因（Gal4-Luc）以及Gal4/VP16标记的APP-C99融合蛋白（C99-GV）。此外，我们还构建了另一种来源于HEK细胞的稳定细胞系（NG），该细胞系持续表达Gal4-Luc和Gal4/VP16标记的NΔE（NΔE-GV）。利用这些新型的底物特异性γ-分泌酶检测方法，我们现在提供了一种可定量并区分γ-分泌酶对不同底物催化活性的技术（在CG细胞中针对APP-C99，或在NG细胞中针对NΔE）。此外，这些底物特异性的γ-分泌酶检测体系被设计为适用于高内涵筛选平台。这些新建立的γ-分泌酶检测方法有望推动新型γ-分泌酶调节剂的发现，从而在不引发不良Notch信号抑制的前提下抑制Aβ生成，为下一代阿尔茨海默病（AD）治疗中改善认知功能开辟新途径。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 测量与APP-C99或NΔE的γ-分泌酶切割相对应的荧光素酶报告信号

注意：有关 CG 和 NG 细胞生成的详细描述，请参见之前发表的文献20,21。

  1. 将 NG 或 CG 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种至 96 孔微孔板中，每孔终体积为 200 μL，培养基为含 10% 胎牛血清（FBS）、5 μg/mL 杀稻瘟菌素（blasticidin）和 250 μg/mL 抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）例如，zeocin）和 200 μg/mL 潮霉素B。
    1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    2. 将微孔板转移至加湿的 CO₂ 培养箱中2 培养箱中37 °C过夜培养。
  2. 从每个孔中移除 100 μL 培养基。
  3. 每孔加入100 μL含2 μg/mL四环素的生长培养基，培养基中分别含有0.2%二甲基亚砜（DMSO）、2 μM CL-387,785、2 μM N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）或其他相关的ErbB1/ErbB2抑制剂。
  4. 将处理后的CG或NG细胞在微孔板中于37 °C孵育24 h。
  5. 从微孔板中每孔移除 150 μL 培养基。
  6. 加入50 μL/孔的荧光素酶检测试剂（详见 材料表).
  7. 将微孔板转移至化学发光微孔板读数仪。
    1. 将微孔板置于室温下，轻轻振荡孵育5分钟。
  8. 确定 萤火虫 使用存储在发光微孔板读数仪中的预设程序检测荧光素酶（FL）发出的发光信号。
    1. 打开仪器控制软件（参见 材料表 有关仪器详情）。
    2. 从“工具”菜单中选择“发光测量”。
      1. 在“参数”设置中，选择“无滤光片”作为发射滤光片，勾选“正常”作为发射孔径，输入“1”作为计数时间，然后点击“确定”以设置发光读数。
    3. 在“仪器控制”选项卡下，浏览活动程序列表，并选择预存的发光检测程序。
    4. 在“实时显示”选项卡中，从下拉列表中定义尺度，并为类型选择“对数”或“线性”。
    5. 在“温度”选项卡中，将“板加热”选择为“关闭”。
    6. 点击“开始”按钮以进行发光读数。
    7. 根据需要，使用控制软件内嵌的“Explorer”将结果导出为电子表格格式。

2. γ-分泌酶活性的定量分析

  1. 将CG或NG细胞在含有1 μg/mL四环素的生长培养基中用0.1% DMSO处理后发出的发光信号定义为100%相对γ-分泌酶活性。
    1. 通过用不含四环素的生长培养基处理CG或NG细胞，估算其背景发光信号。
  2. 将CG或NG细胞在含有1 μg/mL四环素以及1 μM CL-387,785或1 μM DAPT的生长培养基中培养后测得的荧光素酶信号，与经DMSO处理的CG或NG细胞的荧光素酶信号（即步骤2.1中定义的100%相对γ-分泌酶活性）进行归一化处理。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

CL-387,785 对 ErbB2 的抑制可选择性促进 γ-分泌酶对 APP-C99 的加工，而不影响 Notch 的切割
为了建立一种能够定量检测特定 γ-分泌酶底物蛋白水解切割的细胞实验体系，我们通过将四环素诱导型C端Gal4/VP16标记的APP-C99与Gal4启动子驱动的萤光素酶报告基因稳定共转染，构建了来源于HEK293的CG细胞系。同时建立了平行的NG细胞系，用于检测γ-分泌酶对NΔE的切割。在NG细胞中，将四环素诱导型C端Gal4/VP16标记的NΔE和Gal4启动子驱动的萤光素酶报告基因稳定共转染至HEK293细胞中。首先通过用不同浓度的DAPT（一种广谱γ-分泌酶抑制剂，可阻断所有γ-分泌酶底物的切割）处理CG和NG细胞，验证了CG细胞中APP-C99以及NG细胞中NΔE的γ-分泌酶依赖性切割（图1）。实验结果还表明，CG细胞和NG细胞中的γ-分泌酶具有相当的催化活性水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

aducanumab 免疫疗法治疗阿尔茨海默病（AD）的1b期临床试验所取得的积极结果，已明确确立了 Aβ 在 AD 发病机制中的关键作用22，并表明抗 Aβ 策略仍是开发抗 AD 药物的有效途径。本文中，我们描述了基于细胞的检测方法，利用萤火虫荧光素酶报告系统定量分析 γ-分泌酶催化的 APP-C99 和 NΔE 蛋白水解过程。APP-C99 和 NΔE 是目前研究最为深入的两种 γ-分泌酶底物，共同代表了 γ-分泌酶的致病性与生理性活性13。本研究中所述的 γ-分泌酶底物特异性细胞检测方法，进一步证实了我们此前发现的 CL-387,785 通过下调 ErbB2 优先降低 APP-C99 稳态水平及分泌型 Aβ 水平的现象。因此，本实验方案为发现新型 γ-分泌酶调节剂提供了一种高效的方法。

该γ-分泌酶底物特异性检测方法的优势是多方面的。例如，这些底物特异性的γ-分泌酶检测可用于初步筛选，以排除潜在的非选择性γ-分泌酶抑制剂，避免其进入后续开发阶段，并提供与最小化潜在副作用相关的定量评...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢中国台湾中央研究院细胞与个体生物学研究所核心设施提供的技术支持。本研究由中国台湾科技部（MOST 103-2320-B-001-016-MY3，授予 Y.-F. L.）、生物制药发展转化创新计划——技术支撑平台轴心方案（NP7，授予 Y.-F. L.）以及中央研究院（授予 Y.-F. L.）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
VictorLight 发光酶标仪PerkinElmer2030-0010
II 级，2 型生物安全柜Thermo Scientific1300 系列 A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)Thermo Fisher12100046生长培养基的主要成分
胎牛血清 (FBS)Thermo Fisher16000044
杀稻瘟菌素 (Blasticidin)Thermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
潮霉素 B (Hygromycin B)Gibco10687010
血细胞计数板 (Hemocytometer)Sigma-AldrichBR717805 Aldrich
96 孔微孔板Nunc156545
四环素 (Tetracycline)SigmaT7660
二甲基亚砜 (DMSO)SigmaD2650
Steady-Glo 荧光素酶检测试剂PromegaE2510
加湿 CO2 培养箱RevcoUltima II
T-REx293 细胞系InvitrogenR71007
Wallac 1420 软件版本 3.0PerkinElmer发光微孔板读板仪的仪器控制软件

参考文献

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

APP Notch HEK293 CL 387 785 DAPT
基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。