本文描述了在培养的上皮细胞单层上制造类似切口的损伤，可便捷地模拟伤口愈合过程 体外，可用于共聚焦或激光扫描显微镜成像，能够为研究细胞行为及迁移相关机制提供高质量的定性和定量数据。
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本文内容
摘要
摘要
细胞迁移是伤口愈合过程中必不可少的环节。在实验动物模型上制造人工伤口通常会导致实验过程昂贵且复杂，同时可能缺乏精确性。体外培养上皮细胞系为研究上皮细胞在伤口愈合中的迁移行为以及治疗手段对这些细胞的影响提供了合适的平台。上皮细胞的生理特性通常在非汇合状态下进行研究；然而，这种方法可能无法真实模拟自然伤口愈合的条件。通过机械方式破坏上皮层的完整性虽可建立较为真实的模型，但可能妨碍分子技术的应用。因此，基于显微镜的技术是体外研究上皮细胞迁移的最佳选择。本文详细描述两种特定方法：人工划痕伤口实验和人工迁移前沿实验，它们可分别获得上皮细胞迁移能力的定量和定性数据。
引言
细胞迁移对于伤口愈合至关重要，因为它负责上皮缺损的最终闭合以及受损表面的修复1。在动物模型中制造人工伤口，可在接近生理条件的情况下重现这一复杂过程2。然而，这种方法往往导致实验操作成本高昂且过程复杂，同时由于伤口愈合过程本身具有高度复杂性，可能难以精确研究特定的生物学过程。
体外培养上皮细胞系为研究这些细胞在伤口愈合中的作用以及治疗对细胞迁移行为的影响，提供了一种有益的动物模型替代方案。上皮细胞的生理特性通常通过分子技术利用非融合培养的细胞进行研究3,4,5,6；然而，上皮完整性的破坏通常通过精细的机械划痕来实现。在细胞培养中，这意味着仅有极少数细胞暴露于伤口间隙，其数量不足以满足分子生物学技术所需的样本量。然而，这些损伤可在显微镜水平下进行研究，利用某些上皮细胞系固有的迁移特性，例如水貂肺上皮细胞（Mv1Lu）或自发 immortalized 的人角质形成细胞（HaCaT）细胞系。
本文介绍了一种显微镜方法，适用于在伤口愈合背景下获取上皮细胞迁移的定量数据3,4,7,8。此外，我们还提供了其他一些方法，有助于定性研究上皮单层细胞在迁移过程中发生的分子和形态学变化。总体而言，这些方法为研究上皮细胞在伤口愈合过程中对处理措施的行为反应及其动态变化和形态学改变提供了框架。
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方案
1. 用于定量研究的人工划痕伤口实验
- 细胞单层制备
- 在无菌条件下，使用含血清的培养基在培养瓶中接种并培养 Mv1Lu 或 HaCaT 上皮细胞。每 24–48 小时更换一次培养基。当细胞达到 80% 汇合度时，采用适当方法将细胞消化下来。 即，胰蛋白酶消化9.
注意：Mv1Lu 和 HaCaT 上皮细胞系分别使用 EMEM 和 DEMEM 培养基培养，培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺，并在 37 °C、5% CO₂ 的可控气氛条件下孵育。2每种细胞系都必须经过充分测定，以确定达到完全汇合所需的细胞浓度和时间。通常对于 Mv1Lu 或 HaCaT 细胞，需要 2-4 x 104 或 4-6 × 104 细胞/孔，分别接种于175 cm²培养瓶中2 培养瓶，在80%汇合度时可收获多达35 x 106 Mv1Lu 或 1 × 107 HaCaT 细胞 - 在12孔或24孔培养板中，每孔接种2 mL细胞悬液。每24–48小时更换一次培养基。确保接种细胞数量足够，使其在2至3天后达到100%汇合度。
- 细胞达到汇合后，移除含血清的培养基，用新鲜的无血清培养基洗涤两次。划痕前将细胞在无血清培养基中继续培养 24 h。
注意：Mv1Lu 或 HaCaT 细胞对培养基质无特殊要求；然而，对于在无血清条件下易发生自发脱落的细胞系，应考虑使用多聚-L-赖氨酸溶液预先包被培养板表面。10.
- 在无菌条件下，使用含血清的培养基在培养瓶中接种并培养 Mv1Lu 或 HaCaT 上皮细胞。每 24–48 小时更换一次培养基。当细胞达到 80% 汇合度时，采用适当方法将细胞消化下来。 即，胰蛋白酶消化9.
- 单层细胞划痕
- 在无菌环境中操作，使用20 µL或200 µL无菌移液器吸头的窄端，根据所需的划痕宽度，用力沿培养单层表面拖动以形成划痕。保持移液器吸头与培养表面垂直，以最大限度保证划痕间隙的均一性。
- 将培养板置于深色背景上，以清晰观察细胞单层。必要时，在每个孔内进行两条相互垂直的划痕（呈十字形），以研究最多4个迁移区域。
- 轻轻吸去培养基，加入新鲜的无血清培养基以清洗悬浮细胞。重复操作两次，或直至大部分未贴壁细胞被去除。
- 在无菌环境中操作，使用20 µL或200 µL无菌移液器吸头的窄端，根据所需的划痕宽度，用力沿培养单层表面拖动以形成划痕。保持移液器吸头与培养表面垂直，以最大限度保证划痕间隙的均一性。
- 实验步骤与数据采集
- 使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，从每个孔中获取最多4张以划痕间隙为中心的治疗前参考图像。通过将显微镜视野边缘与划痕的相邻交叉点对齐，来确定感兴趣区域。
注意：通常使用10倍放大倍数和1280 × 1024像素的图像尺寸进行成像。如上所述选择感兴趣区域有助于在一个孔内快速定位和验证最多4个测量位点。 - 所有图像采集完成后，指定处理孔；将孔中的培养基更换为含有选定处理物的新鲜培养基。
注意：或者，对于不破坏培养基均一性的化学物质或化合物，可直接将其加入培养基中进行处理。 - 将划痕后的培养板置于37 °C、含5% CO₂的控制气氛中孵育2直至观察条件下的划痕间隙闭合达到90%，避免完全闭合。
注意：完全闭合会导致治疗后无法采集图像，因为无法检测到参考区域，且无法确定闭合时间点。对于 Mv1Lu 或 HaCaT 细胞，需要 16–19 小时才能达到 90% 汇合度。 - 通过固定细胞来终止细胞迁移；轻轻将实验培养基替换为1 mL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育15分钟。
- 洗涤细胞以去除过量的甲醛；轻柔地用新鲜的PBS替换孔中的溶液，重复至少两次。
注意：此步骤密封后，酶标板可在 4 °C 下长期保存。 - 从划痕后采集的原始参考区域获取每个孔的治疗后参考图像。使用相同的设备（配备CCD相机的倒置光学相差显微镜）以及相同的图像设置（放大倍数和数字分辨率/密度）。
注意：对于以单个细胞形式迁移、且不依赖于连续前沿形成而独立填补空隙的细胞（例如，MDA-MB-231 乳腺癌人源细胞），时间序列图像可用于计算单个细胞的迁移速度。
- 使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，从每个孔中获取最多4张以划痕间隙为中心的治疗前参考图像。通过将显微镜视野边缘与划痕的相邻交叉点对齐，来确定感兴趣区域。
- 迁移的图像分析与定量
- 使用图像处理软件（例如，ImageJ），定义划痕间隙边界，并在处理前图像中最多进行四次测量以确定间隙面积。记录数据为 "预处理间隙表面" （预处理）。对治疗后的图片重复相同的步骤。记录数据为 "治疗后间隙表面" （POSTGAP）
- 使用 ImageJ 打开已记录的图像。在 "图像" 菜单中，将图像类型设置为 8 位。在 "过程" 菜单，前往 "滤光片" 子菜单并应用 "方差" 过滤。
- 在 "图像" 菜单，输入 "调节" 子菜单并将阈值设置为黑白（B&W），确保 "暗背景" 未被选中。在 "过程" 菜单，前往 "二元的" 子菜单， 并选择 "填补孔洞".
- 在 "分析" 菜单，选择 "设置测量参数" 并激活 "面积"然后沿迁移边缘的轮廓勾画可测量区域，从而界定出间隙。
- 在 "分析" 菜单，选择 "分析颗粒" 并记录 "总面积" 所选区域表面的数值。
- 在电子表格中输入PREGAP和POSTGAP的总面积值，通过计算间隙面积测量值的差值（PREGAP − POSTGAP [任意单位]）来量化每组独立样本的绝对迁移量。此外，将每种实验条件下的绝对迁移数据相对于对照样本进行归一化处理：(SAMPLE / CONTROL) × 100 [%]。
注意：对于以单个细胞形式迁移、且不依赖于连续前沿形成而独立填充空隙的细胞，（例如，MDA-MB-231 人乳腺癌细胞），可通过计数对照组或处理组样本中侵袭中央条带的细胞数量来计算绝对迁移率。 - 绘图量化结果（参见 图1）。必要时进行统计分析。比较两种条件时可采用学生t检验，条件数量较多时则采用方差分析（ANOVA）。
- 使用图像处理软件（例如，ImageJ），定义划痕间隙边界，并在处理前图像中最多进行四次测量以确定间隙面积。记录数据为 "预处理间隙表面" （预处理）。对治疗后的图片重复相同的步骤。记录数据为 "治疗后间隙表面" （POSTGAP）
2. 用于地形研究的人工迁移前沿实验
- 单层细胞制备
- 在无菌条件下，将一层灭菌的圆形盖玻片放入空的培养皿中，直至培养皿表面完全覆盖。
注：直径为5 cm和10 cm的培养皿分别最多可容纳12片和33片盖玻片。 - 在培养皿中，轻柔地接种适量体积的细胞，使其浓度能够在2至3天后达到100%汇合。确保盖玻片之间无重叠，并使用无菌移液器吸头轻轻按压以防止盖玻片漂浮。每24–48小时更换一次培养基。
注：每种细胞系均需经过充分测试，以确定达到完全汇合所需的细胞浓度和时间。通常情况下，Mv1Lu或HaCaT细胞在直径10 cm的培养皿中分别接种2–3 × 106或2.5–4 × 106个细胞。对于较小的培养皿，应按比例减少细胞数量。 - 当细胞达到汇合状态后，移除含血清的培养基，并更换为新鲜的无血清培养基。在进行人工划痕前，将细胞在无血清培养基中维持24小时。
注：Mv1Lu或HaCaT细胞对基质无特殊要求；然而，对于在无血清条件下容易自发脱落的细胞系，应考虑使用多聚-L-赖氨酸溶液预先包被培养表面10。
- 在无菌条件下，将一层灭菌的圆形盖玻片放入空的培养皿中，直至培养皿表面完全覆盖。
- 单层细胞划痕
- 使用无菌镊子，将盖玻片轻柔转移至含有新鲜无血清培养基的洁净10 cm培养皿中。用镊子夹持盖玻片边缘，避免损伤单层细胞。避免施加过大压力，以防盖玻片破裂。
- 使用灭菌的剃刀刀片在盖玻片中心横向拖动，制造人工划痕。前后拖动3–4 mm，以完全去除中央的单层细胞条带。确保划痕边缘无残留的细胞碎片。
注：在直径为12 mm的圆形盖玻片上，切口应位于盖玻片正中央。需确保在划痕对侧保留足够宽（至少2 mm）的细胞条带，以避免后续步骤中盖玻片发生倾斜。 - 将带有细胞面朝上的划痕盖玻片转移至含有至少2 mL新鲜无血清培养基的洁净6孔板中。每孔最多可放置4片划痕盖玻片。
- 使用新鲜无血清培养基轻柔清洗两次，以去除脱落的细胞。
- 实验操作与取样
- 轻柔更换孔中的培养基，加入含有选定处理因素的新鲜培养基。
注：对于不影响培养基均一性的化学物质或化合物，也可直接将处理物接种到培养基中。操作时需谨慎，避免引起细胞脱落。 - 将培养板置于细胞培养箱内（37 °C，5% CO2），按照所需的实验时间进行培养。
- 通过固定细胞来终止细胞迁移；轻柔地将实验用培养基替换为1 mL含4%甲醛的PBS溶液，在室温下孵育15分钟。
注：对于时间序列实验，应将样品从原培养板中取出并在独立的培养板中固定，以避免甲醛蒸气影响其他正在进行的实验条件。 - 清洗细胞以去除多余的甲醛；轻柔地将孔中液体替换为新鲜PBS溶液，重复至少两次。
注：此步骤完成后，密封后培养板可在4 °C长期保存。
- 轻柔更换孔中的培养基，加入含有选定处理因素的新鲜培养基。
- 免疫荧光（IF）与拓扑学分析
- 按照已有文献所述方法3,4,11，对单个盖玻片进行免疫荧光染色和成像。
- 将盖玻片浸入含0.3% Triton X-100的PBS溶液中，透化处理10分钟。
- 使用以下封闭液在室温下封闭30分钟：0.3%牛血清白蛋白；10%胎牛血清；5%脱脂奶粉；0.3% Triton X-100的PBS溶液。
注：不含奶粉的封闭液可预先配制并储存在-20 °C。 - 在湿润盒中，室温孵育1小时，加入用无奶粉封闭液稀释的一抗。将盖玻片倒置置于15 µL抗体溶液中，以确保抗体均匀分布。
注：一抗的工作稀释度因抗体种类而异。例如，兔抗c-Jun抗体需按1/100稀释。 - 将盖玻片在含0.1% Triton X-100的PBS溶液中浸洗三次。
- 将盖玻片在含二抗的无奶粉封闭缓冲液中孵育30分钟。
注：二抗的工作稀释度因抗体种类而异。例如， Goat-anti-Rabbit（488）抗体为获得最佳分辨效果需按1/400稀释。此时可在孵育缓冲液中加入其他标记试剂，如鬼笔环肽和Hoechst-33258。 - 将盖玻片在含0.1% Triton X-100的PBS溶液中浸洗三次。
- 将盖玻片倒置，置于载玻片上的一滴10 µL封片介质（例如，Vectashield）中。将载玻片置于室温避光环境中过夜，使封片介质充分固化。之后可长期避光保存于4 °C。
- 获取迁移前沿区域结构变化的落射荧光或共聚焦显微图像。
注：可通过拼接从迁移前沿至单层内部的图像进行拓扑学研究。通过软件对局部荧光强度进行分析，可实现半定量研究。
- 按照已有文献所述方法3,4,11，对单个盖玻片进行免疫荧光染色和成像。
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结果
用于定量研究的人工划痕伤口实验：评估表皮生长因子（EGF）对细胞迁移的促进作用：
EGF 是上皮细胞增殖和迁移的已知诱导剂，因此可作为量化迁移促进作用的阳性对照。在划痕实验中使用 Mv1Lu 和 HaCaT 细胞单层，并获取处理前图像。接种 10 ng/mL EGF 后，细胞培养 19 小时，随后固定并获取处理后图像。通过维持无血清饥饿条件，将细胞增殖控制在最低水平。使用 ImageJ 分析处理前后两组图像，并测定中央空白区域面积。实验重复两次，每孔记录四次测量值。绝对迁移量通过面积差计算：（PREGAP − POSTGAP）。经刺激的 Mv1Lu 细胞（图 1A）比经刺激的 HaCaT 细胞（图 1B）表现出更强的迁移潜能。这种差异可归因于细胞来源不同，分别为黏膜上皮细胞和皮肤角质形成细胞。
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讨论
皮肤或黏膜屏障受损后，成纤维细胞、上皮细胞及免疫细胞等多种细胞共同作用，恢复其屏障功能。这些细胞协同经历一系列复杂过程，包括凋亡、增殖、分化，尤其是成纤维细胞和上皮细胞的迁移，后者是修复受损组织、闭合表皮缺损的最终机制1,12。因此，研究细胞迁移不仅有助于准确描述上皮细胞的生理行为，还可评估促进伤口愈合治疗手段的调节潜力。
在不同实验动物模型上制造人工伤口，可于接近生理条件下复制这一复杂过程2，从而评估某些病理状况或药物治疗的效果13然而，这种方法通常会导致昂贵且复杂的后勤工作，以及繁琐的实验流程，可能使数据的获取延迟13相反， 体外 细胞培养为研究参与伤口愈合过程的细胞行为提供了更为便捷的体系。尽管上皮细胞的原代细胞培养是一种可行的选择，但原代细胞的获取和操作较为困难，可能增加数据收集的复杂性。例如，除了...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们谨向实验室中帮助改进和完善这些技术直至目前水平的资深成员表示感谢：Celia Martinez-Mora博士、Anna Mrowiec博士、Catalina Ruiz-Cañada博士以及Antonia Alcaraz-García博士。我们衷心感谢中国台湾维珍·德·拉·阿里萨卡大学临床医院对这些技术发展的大力支持，以及西班牙卡洛斯三世健康研究所、卫生研究基金、国家研发创新计划和卡洛斯三世健康研究所-研究评估与促进总局（项目编号：PI13/00794；www.isciii.es）的资助。同时感谢欧洲区域发展基金（FEDER）“构建欧洲之路”计划的支持。我们还感谢穆尔西亚大学、IMIB-Arrixaca和FFIS在行政管理和协助方面提供的支持。最后，我们特别感谢Isabel Martínez-Argudo博士以及托莱多卡斯蒂利亚-拉曼查大学兵器工厂科技园环境科学与生物化学学院，感谢他们慷慨出借生物医学与生物技术实验室，使得本文拍摄部分得以顺利完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基（DMEM） | Biowest，Nuaillé法国 | L0102-500 | 可选的 10% FBS 补充剂 |
| 鹰’最小必需培养基（EMEM） | Lonza | BE12-662F | 可选的 10% FBS 补充剂 |
| L-谷氨酰胺 | Lonza | BE17-605E | 使用浓度为 2 mM |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | DE17603A | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | T4049 | 根据需要进行适当稀释 |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | P9155 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）（10倍浓缩） | Gibco（生命技术公司） | 14200-067 | 稀释至1倍浓度 |
| 24孔培养板 | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
| 6孔培养板 | SARSTEDT | 83-3920 | |
| 表皮生长因子（EGF） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | E9644 | 使用 10 ng/mL |
| 圆形盖玻片 | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | 景深较浅 |
| 加强型手术刀片编号743 | Martor（通过 VWR） | MARO743.50 | |
| 200 µl 无菌气溶胶吸头 | VWR | 732-0541 | |
| 20 µl 无菌气溶胶吸头 | VWR | 732-0528 | |
| 配备数码相机的相差显微镜 | Motic 西班牙 | Moticam 2300 相机，300万像素，USB 2.0；Motic Optic AE31 | |
| 共聚焦显微镜 | 德国蔡司显微成像公司 | LSM 510 META | |
| 10 cm 培养皿 | BD FALCON | 353003 | |
| 兔多克隆抗 c-Jun 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | 使用比例为1:100 |
| 抗兔IgG（多克隆山羊）AF 488 | Invitrogen | A11008 | 使用比例为1:400 |
| Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 14530 | 使用比例为1:1000 |
| Alexa Fluor 594 鬼笔环肽（甲醇溶液）（红色） | Invitrogen | A12381 | 使用比例为1:100 |
| 牛血清白蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | T9284 | |
| 脱脂牛奶 | BD DIFCO | 232100 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | 版本 1.50i | |
| Zen LSM 510 图像处理软件 | 德国 ZEISS 显微成像 | 版本 5.0 SP 1.1 |
参考文献
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