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方法文章

检测暴露于有机氯农药的肝细胞中线粒体功能的实验方案

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DOI：

10.3791/56800

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2020年9月16日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Institute of Toxicology, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Modern Toxicology of Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, 3Center of Gallbladder Disease, Shanghai East Hospital, Institute of Gallstone Disease, Tongji University School of Medicine

本文内容

摘要

了解环境有机氯农药（OCPs）对肝细胞线粒体功能的影响，对于探索OCPs导致代谢紊乱的机制具有重要意义。本文介绍了检测肝脏线粒体功能的详细方法。

摘要

本文介绍了检测肝细胞线粒体功能的详细方法，旨在更好地理解环境有机氯农药（OCPs）暴露导致肝细胞代谢紊乱的原因。将HepG2细胞暴露于β-六氯环己烷（β-HCH）中24小时，其剂量相当于普通人群体内的内暴露水平。通过透射电子显微镜（TEM）观察肝细胞的超微结构，以显示线粒体的损伤情况。进一步通过线粒体荧光强度、三磷酸腺苷（ATP）水平、氧耗率（OCR）以及线粒体膜电位（MMP）来评估β-HCH孵育后HepG2细胞中的线粒体功能。使用线粒体绿色荧光探针染色后，通过荧光显微镜观察线粒体荧光强度。采用荧光素-荧光素酶反应测定ATP水平。利用阳离子染料JC-1检测MMP，并通过流式细胞术进行分析。OCR则使用细胞外通量分析仪进行测定。综上所述，这些实验方案可用于检测肝细胞中线粒体功能，以研究线粒体损伤情况。

引言

有机氯农药（OCPs）对健康的影响， 例如 生殖干扰、免疫毒性、代谢变化此前已有研究1,2,3检测细胞代谢和发现线粒体功能障碍的方法使科学家能够理解线粒体功能的作用（即线粒体STAT3水平、乳酸、丙酮酸、乳酸/丙酮酸比值、辅酶Q10、线粒体质子漏、生物能量学、生物发生及动力学）在衰老、肥胖、糖尿病、心血管功能、癌症及安全性毒性等领域的研究4,5,6,7本文描述了评估有机氯农药（OCPs）引起线粒体功能障碍的方法。

我们将HepG2细胞暴露于一种典型的有机氯农药（OCPs）——β-六氯环己烷（β-HCH）中，处理24小时，剂量相当于人体内暴露水平。首先，采用透射电子显微镜（TEM）观察肝细胞的超微结构，如细胞核、线粒体和内质网8。与普通显微镜相比，TEM能够研究细胞及其组分（细胞系或组织）的二维和三维超微结构，以及天然或人工材料的形态、化学组成和功能，这些在现代科学技术中具有关键作用。进一步通过线粒体荧光强度、三磷酸腺苷（ATP）水平、氧消耗率（OCR）和线粒体膜电位（MMP）来评估β-HCH处理的HepG2细胞中线粒体功能。Mito-tracker green是一种绿色荧光探针，可用于活细胞中线粒体的特异性荧光染色。使用Mito-tracker green溶液对肝细胞中的线粒体进行染色，并通过共聚焦显微镜观察线粒体的荧光强度、数量和分布模式9。线粒体绿色荧光探针可用于活细胞染色。与罗丹明123或JC-1相比，该绿色荧光探针对线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。ATP水平采用荧光素酶-荧光素检测试剂盒测定，并以蛋白浓度进行标准化。ATP检测试剂盒可用于检测常见溶液、细胞或组织中的ATP水平。该试剂盒基于萤火虫荧光素酶在ATP提供能量的条件下催化荧光素产生荧光的原理。当萤火虫荧光素酶和荧光素过量时，在一定浓度范围内，荧光信号的生成量与ATP浓度成正比。此外，该试剂盒经过特殊设计以优化ATP的化学发光性能。ATP作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理或病理过程中发挥重要作用。ATP水平的变化可反映细胞功能缺陷，尤其是线粒体能量生成障碍。通常在细胞凋亡、坏死或某些毒性状态下，细胞内ATP水平会降低10。JC-1线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒是一种利用JC-1作为荧光探针快速、灵敏地检测细胞、组织或纯化线粒体膜电位的试剂盒，可用于细胞早期凋亡的检测。阳离子染料JC-1是一种用于检测MMP的荧光探针，可通过流式细胞术分析绿色和红色荧光比例的变化来判断MMP状态。当MMP较高时，JC-1在线粒体基质中聚集形成聚合物（J-聚集体），发出红色荧光；当MMP较低时，JC-1无法聚集，以单体形式存在，发出绿色荧光11。因此，红/绿荧光比值可反映MMP水平。细胞的OCR是衡量细胞正常功能的关键指标12，被广泛用作研究线粒体功能的参数。细胞线粒体应激检测试剂盒为分析线粒体功能的关键参数提供了稳定的方法，包含质量控制和预测性试剂，以及标准化的操作流程，可用于检测所有类型的细胞，包括原代细胞、细胞系、悬浮细胞，以及胰岛、线虫、酵母和分离的线粒体。

通过OCR测定可深入了解细胞的生理状态或变化情况。使用细胞外通量分析仪检测呼吸基础值、质子漏、最大呼吸、ATP转换速率及备用能力。简言之，在测定OCR基础值后，按顺序向每孔加入寡霉素（ATP偶联剂）、FCCP（线粒体氧化磷酸化解偶联剂）以及抗霉素A/鱼藤酮（氧消耗抑制剂），随后检测OCR。

为了促进开发更特异的体外检测肝细胞线粒体功能的实验方案，本文介绍了透射电子显微镜、共聚焦显微镜、化学发光仪、流式细胞术及细胞外通量分析仪的相关实验，未来可应用于研究线粒体损伤相关的不良结局。

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方案

所有实验及实验方案均遵循相关指南和规定，并经南京医科大学当地伦理委员会批准。

1. 透射电镜观察线粒体超微结构

  1. 收集 HepG2 细胞
    1. 将 HepG2 细胞接种于 100 mm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
    2. 使用含 0.25% EDTA 的溶液在 1.5 mL EP 管中消化细胞。
    3. 在室温（RT）下以 1000 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。
    4. 收集 4–6 × 105 个 HepG2 细胞。
  2. 用移液器加入 1 mL 5% 戊二醛（溶剂：双蒸水），在 4°C 下孵育 2 小时。
  3. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（含 Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和 KCl，pH 7.4）更换 4 次，每次 15 分钟。用移液器吸除磷酸盐缓冲液。
  4. 加入 200 µm 的 1% 锇酸（溶剂：双蒸水），在 4 °C 下孵育 2 小时，使样品变黑。
    注意： 锇酸为高毒性且易挥发物质，操作时应谨慎并在通风柜中进行。
  5. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液更换 2 次，每次 5 分钟。吸除磷酸盐缓冲液。
  6. 在 1.5 mL EP 管中用 2% 醋酸铀酰溶液（溶剂：双蒸水和乙酸）染色 2 小时。
  7. 依次用 50% 丙酮、70% 丙酮、90% 丙酮（溶剂：双蒸水）、两次纯丙酮进行脱水处理，每次 15 分钟。
  8. 在室温下用 2 滴丙酮（100%）与包埋剂（1:1）渗透 1.5 小时。Epon812 包埋剂配方如下：A 液：Epon812 62 mL 与 DDSA 100 mL；B 液：Epon812 100 mL 与 MNA 89 mL。A:B = 2:8（v:v，冬季），A:B = 1:9（v:v，夏季）。将样品包埋于包埋模具中（带方格网格的软塑料板）。
  9. 依次在 37 °C 孵育 12 小时，45 °C 孵育 12 小时，然后在 60 °C 孵育 48 小时。
  10. 使用超薄切片机制备并观察超薄切片（最大面积不得超过 0.5 mm × 0.3 mm），并通过透射电镜（TEM）观察（切片厚度为 2 µm 和 500 nm）。

2. 线粒体荧光强度检测

  1. 在6孔板中接种2×104个HepG2细胞，加入β-HCH处理24小时。
  2. 加入无水DMSO，配制终浓度为1 mM的线粒体绿色荧光探针。
  3. 向6孔板每孔加入1 mL线粒体绿色荧光探针溶液（终浓度：200 nM），于37 °C孵育45分钟。
  4. 移除线粒体绿色荧光探针溶液，成像前加入新鲜配制的细胞培养基（DMEM），并保持在37 °C。
  5. 使用荧光显微镜（10倍物镜）观察线粒体绿色荧光。检测时最大激发波长为490 nm，最大发射波长为516 nm。

3. 细胞ATP水平的检测

  1. 在6孔板中接种HepG2细胞，加入β-HCH处理24小时。
  2. 向6孔板每孔加入200 µL荧光素酶-荧光素ATP检测试剂盒中的裂解缓冲液，在4 °C条件下以12,000 × g 离心5分钟，用移液器收集上清液至新管中。
  3. 按1:5的比例将ATP检测试剂与ATP稀释液混合，配制成ATP检测缓冲液。
  4. 制备标准曲线：使用ATP裂解缓冲液将0.5 mM的ATP标准溶液稀释为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 µM浓度梯度。
  5. 在96孔板中每孔加入100 µL ATP检测缓冲液 ，室温孵育5分钟，再加入100 µL细胞上清液，使用化学发光仪（发光检测仪）进行检测。根据标准曲线计算ATP浓度（nmol/L）。
  6. 使用BCA蛋白定量检测试剂盒和多功能酶标仪检测蛋白浓度。
    1. 制备标准曲线：使用双蒸水将5 mg/mL的蛋白标准品溶液稀释为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL浓度梯度。
    2. 在96孔板中每孔加入1 µL细胞上清液，并加入19 µL双蒸水。
    3. 每孔加入200 µL BCA检测溶液，37 °C孵育30分钟，使用多功能酶标仪在562 nm波长下检测吸光度（OD值）。根据标准曲线计算蛋白浓度（mg/mL）。
  7. 校正每毫克蛋白所含ATP含量（单位：ATP浓度/蛋白浓度，nmol/mg）。

4. 使用 JC-1 评估线粒体膜电位（MMP）

  1. 收集接种于6孔板中的HepG2细胞，用0.25% EDTA消化后转移至1.5 mL EP管中，在1000 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液并收集细胞。
  2. 将50 µL JC-1（200倍稀释）加入8 mL蒸馏水中，涡旋混匀。再加入2 mL JC-1（5倍稀释）染色缓冲液，配制成JC-1检测溶液。
  3. 将细胞与0.5 mL细胞培养基和0.5 mL JC-1检测溶液的混合液在37 °C孵育20分钟。
  4. 在4 °C、600 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液。
  5. 用1 mL JC-1（1倍稀释）染色缓冲液洗涤两次，每次在4 °C、600 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液。
  6. 将细胞重悬于0.5 mL JC-1（1倍稀释）染色缓冲液中，通过流式细胞术检测绿色和红色荧光。检测JC-1单体时，激发光设为490 nm，发射光设为530 nm；检测JC-1聚合物时，激发光设为525 nm，发射光设为590 nm。

5. 氧消耗速率（OCR）测量

  1. 以每孔 4500 个细胞/100 μL 的密度，将 HepG2 细胞接种于 96 孔细胞培养微孔板中。确保接种 24 小时后细胞覆盖每个孔底。
  2. 根据先前文献13，将配制好的试剂加入相应的进样口。A 口：25 µL 1 µM 寡霉素（ATP 偶联剂）；B 口：25 µL 0.75 µM FCCP（电子节流控制器，ETC 加速剂）；C 口：25 µL 0.5 µM 抗霉素 A/鱼藤酮（线粒体抑制剂 A 和线粒体抑制剂 B）。
  3. 将试剂盒 cartridge 置于 37 °C 无 CO2 的培养箱中保存，直至使用。
  4. 通过吸去每孔中的原有培养基，并加入新的 DMEM 培养基，更换细胞板的培养液。每孔终体积为 180 µL。
  5. 在检测前，将细胞板置于 37 °C 无 CO2 的培养箱中孵育 1 小时。
  6. 通过软件自动记录耗氧率（OCR）。
    1. 打开 OCR 检测软件。
    2. 在 Apps 下拉菜单中选择 Cell Mito Stress Test Kit。
    3. 点击“启动应用”（Start App）按钮。
    4. 点击“运行应激测试”（Run Stress Test）按钮，出现细胞应激测试设置界面。
    5. 执行以下步骤：
      1. 在“细胞接种数”（Cell seeding #）框中输入每孔接种的细胞数量。
      2. 在“平均基础 OCR”（Average basal OCR）框中输入平均基础耗氧率值。
      3. 输入每种试剂的最终工作浓度，并注入试剂。
        注：在优化细胞接种密度时，应在运行优化实验前已检测获得该细胞的平均基础 OCR 值。
      4. 点击“下一步”（Next）按钮，出现分组信息界面。
      5. 通过选择颜色并命名，为未分组的孔分配组别，然后点击相应的孔进行分配。
        注：不同组别定义为在运行细胞线粒体应激测试前施加的不同处理。运行应激测试时，微孔板上所有孔将接受相同的试剂注射。
      6. 点击“下一步”（Next）按钮，出现应激测试注射布局界面。
      7. 点击“开始”（Start），分析仪将开始运行应激测试。运行结束后，按照软件提示操作，取出并丢弃试剂盒 cartridge 和细胞板。

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结果

暴露于β-HCH的HepG2细胞线粒体嵴明显受损。线粒体散在分布，轻度至明显扩张，形态不规则，线粒体嵴消失，线粒体结构相对异常（图1）。

暴露于β-HCH的HepG2细胞中，代表线粒体的平均线粒体绿色荧光强度（图2）以及ATP水平（图3）均有所下降。荧光强度和ATP水平随暴露浓度的增加而逐渐降低。线粒体数量减少或线粒体受损可能导致观察到的线粒体荧光强度下降，进而引起ATP生成减少。

流式细胞术结果显示，β-HCH组中JC-1红色/绿色荧光比值显著低于对照组（图4）。HepG2细胞的耗氧率（OCR）...

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讨论

检测方案成功的关键在于采用多种实验方法，涵盖从表型到机制的研究。本研究中，HepG2细胞在含有青霉素、链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。当细胞融合度达到40-50%时，加入β-HCH（0、10、100 ng/mL），并孵育24小时。我们首先使用透射电子显微镜（TEM），结果显示代表性有机氯农药β-HCH引起肝细胞超微结构改变，特别是线粒体结构受损(图1)。此外，还进行了荧光染色实验(图2)、荧光素酶-荧光素ATP检测(图3)、JC-1实验(图4)以及细胞线粒体应激测试实验(

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：81573174、81570574）；江苏省杰出青年基金（SBK2014010296）；教育部研究项目（213015A）；江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）；江苏省高校品牌专业建设工程；以及环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放课题项目（KF2015-01）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
透射电子显微镜 FEITecnai G2 Spirit Bio TWIN高对比度、高分辨率成像，低剂量观察与成像，低温观察，卓越的分析性能，自动化设计以提升便捷性与性能
Mito-Tracker Green碧云天C1048Mito-Tracker Green 是一种线粒体绿色荧光探针，可用于活细胞中线粒体的特异性荧光染色。
激光扫描共聚焦显微镜蔡司700B结构紧凑、稳定，光路最短，光路精度高，创新技术与精密扫描技术相结合，可 生成完美的三维样本图像。
增强型ATP检测试剂盒碧云天S0027增强型ATP检测试剂盒可用于检测常见溶液、细胞或组织中的ATP（腺苷5'-三磷酸）水平。细胞和组织样本可通过裂解完成样本制备，检测灵敏度可达0.1 nmol/L，化学发光信号可持续30分钟。
发光仪贝托尔德Centro LB 960发光仪是一种化学发光检测器，可检测样本自身发出的光，无需激发光源。发光仪是用于检测化学发光的仪器。
BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天P0012BCA蛋白浓度测定试剂盒是检测蛋白质浓度最常用的方法之一。
多功能酶标仪帝肯InfiniteM200多功能酶标仪可用于检测蛋白质浓度。

参考文献

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