检测暴露于有机氯农药的肝细胞线粒体功能的实验方案

Summary

了解环境有机氯农药（OCPs）对肝细胞线粒体功能的影响，对于探讨OCP引起代谢紊乱的机理十分重要。本文提出了检测肝线粒体功能的详细方法。

Abstract

本文提出了检测肝线粒体功能的详细方法，以便更好地了解肝细胞中环境有机氯农药（OCPs）引起的代谢紊乱的原因。HepG2细胞在同等剂量的内部接触下，在24小时内暴露在β-六氯环丙烷（+-六氯环丙烷）中。通过透射电子显微镜（TEM）对肝细胞的超结构进行了检查，以显示线粒体的损伤。线粒体功能通过线粒体荧光强度、腺苷5'-三磷酸（ATP）水平、氧消耗率（OCR）和线粒体膜电位（MMP）进一步评估，这些细胞在使用β-HCH孵育的HpG2细胞中。线粒体荧光强度后染色线粒体绿色荧光探针观察到荧光显微镜。荧光素-荧光酶反应用于确定ATP水平。在流式细胞学下检测出MMP。使用细胞外通量分析仪测量OCR。总之，这些协议用于检测肝细胞中的线粒体功能，以调查线粒体损伤。

Introduction

有机氯农药（OCPs）对健康的影响，如生殖干扰、免疫毒性、代谢变化等，此前已研究^{过1、2、3。,2,3}检测细胞代谢和发现线粒体功能障碍的方法使科学家能够理解线粒体功能的作用（即:，线粒体STAT3水平，乳酸，丙酮酸盐，乳酸与丙酮酸盐比，共酶Q10，线粒体质子泄漏，生物能量，生物发生和动力学）在老化，肥胖，糖尿病，心血管功能，癌症和安全毒性^4,54，5，6，7^,6等领域7。本文介绍了评估OCPs引起的线粒体功能障碍的方法。

我们向+-六氯环氧烷（+-H环环）暴露，一种具有代表性的OCPs，剂量相当于人体内部接触24小时。首先，TEM用于观察肝细胞的超结构，如核、线粒体和内质电^8。与普通显微镜相比，TEM能够探索细胞和细胞成分（细胞系或组织）的二、三D超结构、形态、化学成分以及在现代科学技术中起关键作用的自然或人工材料的功能。线粒体功能通过线粒体荧光强度、腺苷....

Protocol

所有实验和实验规程都按照有关准则和规定进行，并经南京医科大学地方伦理委员会批准。

1. TEM 的线粒体超结构

1. 收集 HepG2 细胞
   1. 种子 HepG2 细胞在 100 毫米的菜肴。储存在37°C和5%CO2₂。
   2. 1.5 mLEP 管中具有 0.25% EDTA 的消化细胞。
   3. 在室温 （RT） 下以 1000 x g 的离心机 3 分钟。丢弃上一杯。
   4. 收集 4-6 x 10⁵ HepG2 细胞。
2. 加入1 mL的5%谷胱甘肽（溶剂:双蒸馏水）与移液器和孵育在4°C2小时。
3. 添加和洗涤4个变化1 mL的磷酸盐缓冲液（含_{Na 2}HPO_4，KH2PO_4，NaCl和KCl，pH 7.4），各15分钟。用移液器吸出磷酸盐缓冲液。
4. 加入200μm的1%的1%的硅（溶剂:双蒸馏水），在4°C下孵育2小时到黑色样品中。
   注意: Osmium 是剧毒和挥发性物质。应在药柜中小心操作。
5. 加入并洗涤2个1mL磷酸盐缓冲液，每个5分钟。吸出磷酸盐缓冲液。
6. 在 1.5 mL EP 管中染色 2....

Results

HepG2细胞暴露在+-六氯上细胞中的线粒体受到明显损伤。散落的线粒体有轻微扩张，形状不规则，线粒体脊消失，线粒体结构相对异常（图1）。

平均线粒体绿色荧光强度，代表线粒体，在接触+-HCH的 HepG2 细胞（图2）和ATP水平（图3） 中下降。荧光强度和ATP水平随着暴露浓度的增加而逐渐减少。潜在的，线粒体数量的减少，或受损的线粒体，导致观察到的线粒体荧光强度，从而减少ATP的产量。

流式细胞学结果表明，+-六氯环线组红/绿JC-1荧光比明显低于控制值（图4）。HepG2细胞的OCR在+-HC.......

Discussion

检测协议成功的关键是使用各种实验方法，这些实验方法涵盖了从表型到机制的研究。在这项研究中，HepG2细胞在DMEM中培养青霉素和链霉素和10%胎儿牛血清。当细胞达到40-50%汇合时，添加+-HCH（0，10，100纳克/mL）并孵育24小时。我们首先使用TEM，它显示了代表性的OCPs引起的肝细胞的超结构变化，+-HCH，显示了线粒体结构的损伤（图1）。)此外，还进行了荧光染色测定((（(图2），)荧光酶-荧光素ATP检测(（图3），JC-1测定（图4）和细胞线粒体应激检测（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
透射电子显微镜	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	高对比度、高分辨率成像、低剂量观察和成像、低温观察、出色的分析性能、便利性和高性能的自动化
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green 是一种线粒体绿色荧光探针，可用于活细胞线粒体特异性荧光染色。
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	700B	设计紧凑、稳定、光程最短、光度高、光精度高、创新技术和精密扫描技术相结合，可产生完美的三维标本图像。
增强型 ATP 检测试剂盒	Beyotime	S0027	增强型 ATP 检测试剂盒可用于检测常见溶液、细胞或组织中的 ATP（5'-三磷酸腺苷）水平。细胞和组织样品可分液完成样品制备，检测灵敏度可达0.1nmol/L，化学发光可维持30分钟。
光度计	Berthold	Centro LB 960	光度计是化学发光检测器，测试样品本身可以很轻，不需要刺激。光度计是检测化学发光的仪器。
BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime	P0012	BCA 蛋白检测试剂盒是检测蛋白浓度最常用的方法之一。
多功能微孔板检测	TECAN	InfiniteM200	多功能微孔板检测仪用于检测蛋白质一致性。