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方法文章

使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞

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DOI：

10.3791/56802

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2017年12月6日

 , 
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

本文内容

摘要

本文提供了一种详细的实验方法，用于制备X染色体臂探针，并通过荧光原位杂交（FISH）技术检测处于前中期和中期 I 停滞状态的Drosophila卵母细胞中姐妹染色单体黏连的状态。该实验方案适用于判断不同基因型条件下减数分裂染色体臂部黏连是否保持完整或发生破坏。

摘要

在人类中，卵母细胞的染色体分离错误是导致大多数流产和出生缺陷的主要原因。此外，随着女性年龄增长，其怀有非整倍体胎儿的风险显著增加，这一现象被称为母龄效应。在减数分裂过程中实现准确染色体分离的一个前提是卵母细胞经历的长期前期阶段中维持姐妹染色单体的黏连。人类及模式生物的细胞学证据表明，减数分裂黏连在衰老过程中会逐渐衰退。此外，人类卵母细胞中的染色体分离错误主要发生在减数分裂I期，这与染色体臂部黏连的过早丢失一致。利用模式生物对于揭示黏连随年龄依赖性丢失的机制至关重要。 Drosophila melanogaster 在研究卵母细胞减数分裂黏连调控机制方面具有多项优势。然而，直到最近，仍仅有遗传学检测方法可用于评估不同基因型或不同实验条件下卵母细胞中染色体臂黏连的丧失情况。本文提供了一种利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）直接观察减数分裂前期I和中期I停滞的果蝇卵母细胞中染色体臂黏连缺陷的详细实验方案。 原位 杂交（FISH）直接观察前期I和中期I停滞的染色体臂黏连缺陷 果蝇 卵母细胞。通过构建一个与X染色体远端臂杂交的FISH探针，并采集共聚焦Z轴层扫图像， X 染色体并采集共聚焦Z轴层扫图像，研究人员可以在三维空间中观察单个FISH信号的数量，从而判断姐妹染色单体臂是否分离。该方案使得在数百个果蝇卵母细胞中定量分析染色体臂黏连缺陷成为可能。 果蝇 卵母细胞。因此，该方法为研究参与黏连维持的机制以及导致其在衰老过程中衰退的因素提供了重要的工具。

引言

有丝分裂和减数分裂过程中染色体的正确分离依赖于姐妹染色单体黏连的建立、维持和有序释放1,2。黏连在S期建立，由黏连蛋白复合物介导，该复合物形成物理连接以维持姐妹染色单体的结合。在减数分裂中，交换位点远端的黏连还起到将重组同源染色体连接在一起的作用，这种物理关联有助于确保二价体在减数第一次分裂中期纺锤体上的正确取向（图1）3,4,5。在后期I时，染色单体臂部黏连的释放使同源染色体分离至纺锤体两极。然而，若臂部黏连过早丢失，重组的同源染色体将失去物理连接而随机分离，从而导致非整倍体配子的产生（图1）。

在人类卵母细胞中，染色体分离错误是导致流产和出生缺陷（如唐氏综合征6）的主要原因，且其发生率随母亲年龄呈指数级增长7。姐妹染色单体黏连在胎儿期的卵母细胞中建立，减数分裂重组在出生前完成。随后，卵母细胞停滞在减数第一次分裂的中期前期，直至排卵；在此停滞期间，重组同源染色体之间的持续物理连接依赖于姐妹染色单体黏连。因此，减数分裂过程中的准确分离以及正常的妊娠结局要求黏连结构在长达五十年的时间内保持完整。

在人类卵母细胞长期的减数分裂阻滞期间，黏连结构的过早丧失被认为与母龄效应有关，且多条证据支持这一假说8,9。然而，由于研究人类卵母细胞减数分裂黏连存在诸多挑战，目前对这一现象的理解在很大程度上依赖于模式生物的研究5,10,11,12,13,14,15。

黑腹果蝇 卵母细胞为研究减数分裂黏连和染色体分离提供了多种优势。一种简单的遗传检测方法可使研究者从非整倍体配子中获得后代，并测量其分离保真度 X- 大规模染色体分离11,16,17此外，还可以确定染色体分离错误是否源于重组的同源染色体在减数分裂Ⅰ期发生错误分离，这一表型与染色体臂间黏连的过早丢失一致。11,18,19. 直接观察减数分裂黏连状态在 果蝇 使用荧光技术对卵母细胞进行检测也是可行的 原位 杂交（FISH）。尽管荧光寡核苷酸已用于检测成熟卵母细胞中着丝粒周围黏连十余年，其靶向的是重复卫星序列 果蝇 卵母细胞4,20，对臂 cohesion 的分析一直更具挑战性。要可视化臂 cohesion 的状态，需要一种能够覆盖大片单拷贝序列区域且亮度足够高的探针，以便在臂 cohesion 缺失时仍能清晰显示各个姐妹染色单体的信号。此外，卵母细胞的固定条件以及标记 DNA 的大小必须有利于探针渗透21 进入大型成熟 果蝇 卵母细胞（200 µm 宽，500 µm 长）。最近，已成功利用臂部探针来观察 果蝇 减数分裂I后期的卵母细胞染色单体，但作者指出，在前中期I或中期I停滞的卵母细胞中无法检测到信号22. 本文提供了一种生成 X-染色体臂FISH探针及卵母细胞制备条件，使我们能够检测减数分裂前期I和中期I卵母细胞中姐妹染色单体黏连的过早丢失。这些技术帮助我们鉴定了维持减数分裂黏连所必需的基因产物，也将使其他研究者能够检测成熟卵母细胞中姐妹染色单体黏连缺陷 果蝇 不同基因型的卵母细胞

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方案

1. 准备工作

  1. 配制荧光溶液 原位 杂交（FISH）。所有溶液均使用超纯水配制。
    1. 制备 5x 改良Robb缓冲液：275 mM醋酸钾，200 mM醋酸钠，500 mM蔗糖，50 mM葡萄糖，6 mM氯化镁，5 mM氯化钙，500 mM HEPES，pH = 7.4。用10 N NaOH调节pH至7.4。过滤除菌后于-20 ℃保存 °C. 解冻并稀释至1倍浓度 视需要添加并储存1x -20 保存的等份样本 °C.
    2. 制备10x 磷酸盐缓冲液（PBS），使用 1.3 M NaCl、70 mM Na2HPO4，30 mM NaH2PO4用10 N NaOH将pH调至7.0。通过高压灭菌或滤膜过滤除菌。
  2. 在需要使用的前一天制备多聚-L-赖氨酸盖玻片。
    1. 将含有1%盐酸的70%乙醇滴加到18 mm × 18 mm #1.5盖玻片表面，孵育5分钟。用真空抽吸法去除液体。用无菌超纯水重复操作。在盖玻片表面加入0.1 mg/mL多聚-L-赖氨酸，覆盖整个表面，孵育10分钟。
    2. 吸除液体，室温晾干10分钟。将盖玻片有聚-L-赖氨酸的一侧朝上，存放于带紧密盖子的塑料容器中，以防灰尘污染。
  3. 准备拉制的巴斯德吸管，用于移除液体溶液而不移走卵母细胞。在本生灯火焰上加热长玻璃巴斯德吸管的中部，同时轻轻拉伸两端，直至玻璃熔化并拉断。

2. FISH 臂探针的制备

注意：所有离心步骤均在约 16,000 - 21,000 x g（大多数台式微量离心机的最大转速）下进行。短暂离心指离心 5 - 15 秒。涡旋混匀指在未特别说明的情况下，以最高速度涡旋约 15 秒。

注意：用于臂区探针的BAC可从BAC PAC资源中心获取。两种 X 染色体常染色质臂探针已在此方法中成功应用。其中一条臂探针由六个BAC克隆组成，对应于细胞学区带6E-7B（BACR17C09、BACR06J12、BACR35J16、BACR20K01、BACR35A18、BACR26L11）。另一条臂探针由六个BAC克隆组成，对应于细胞学区带2F-3C（BACR13K19、BACR21G11、BACR09H13、BACR30B01、BACR34O03、BACR03D13）。其他区域的BAC克隆也可用于 果蝇 染色体区域可在以下网址浏览：http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html。 两个识别359 bp着丝粒卫星重复序列的探针 X 染色体已成功使用该方法。一种22个核苷酸的探针已被广泛使用且效果良好（5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT）19,23一种28个核苷酸的探针最近经过测试，效果良好（5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC）24. 从商业来源订购了经HPLC纯化并用特定荧光染料在5'端标记的寡核苷酸（例如，Integrated DNA Technologies）。

  1. 按照试剂盒说明书指示制备BAC克隆DNA 材料表. 将从 100 mL 培养液中获得的 DNA 沉淀重悬于 200 µL TE；最终DNA浓度应在5 - 40 ng/µL 取决于 BAC 克隆。
  2. 使用材料表中指定的扩增试剂盒以及以下方案，对每个BAC进行DNA扩增。每个克隆的BAC DNA需单独处理。在步骤2.2.1至2.2.3中使用试剂盒提供的酶和缓冲液。
    1. BAC DNA的随机片段化：针对每个BAC，使用TE缓冲液配制10 µ1 纳克/微升的 LµL DNA溶液置于200 µL PCR管。加入1 µL 的 10X 破片段缓冲液。将离心管置于 PCR 仪中，95 ℃ °精确孵育4分钟。立即在冰水中冷却样本，并短暂离心。该孵育步骤对时间敏感，任何偏差均可能影响实验结果。
    2. 文库制备
      注意：该方法使用随机引物扩增可扩增的片段文库。
      1. 向含有 DNA 的离心管中加入以下成分：2 µ1x文库构建缓冲液，L µL 的文库稳定溶液。充分涡旋混匀，短暂离心，将试管放入 PCR 仪中，95 °2分钟内冷却至室温，立即将样品置于冰水中冷却，并短暂离心。
      2. 加入1 µ将 L 的文库制备酶加入 PCR 管中，混匀并短暂离心。将 PCR 管放入 PCR 仪中，按以下条件孵育：16 °C，20 分钟，24 °C，20 分钟，37 °C，20 分钟，75 °C，5 分钟后，于 4 ℃ 保存 °C.
      3. 从PCR仪中取出样品并短暂离心。样品可立即进行扩增，或在-20℃保存。 °C，最长可达三天。
    3. BAC DNA文库的扩增
      1. 将以下试剂加入全部15 µL 随机片段反应：7.5 µL 10x 扩增主混合液，47.5 µ5 L 无核酸酶水 µL WGA DNA聚合酶。充分涡旋混匀，短暂离心。
      2. 将PCR管放入PCR仪中，按以下条件孵育：初始变性95 °C，3 分钟，14 个循环的 94 °C，15 秒，随后在 65 °C 进行退火/延伸 °C，5 分钟后，于 4 ℃ 保存 °C.
      3. 循环完成后，测定DNA浓度。DNA浓度应至少为800 ng/µL. 将样品置于 4 °C 或在 -20 保存 °C，直至准备进行消化。可选步骤：取 400 ng DNA 在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，以评估 DNA 片段大小。片段长度应在 200 bp 至 3 kb 之间（图2).
  3. 扩增DNA的限制性内切酶消化
    1. 放置20 µg 上一步骤扩增的DNA置于1.5 mL离心管中。加入20单位的Alul、Haelll、Msel、Mspl、Rsal，25单位的BfuCl，0.5 µL 100x BSA，5 µL 10x 限制性内切酶消化缓冲液，并调整体积至50 µL，通过添加适量的超纯H2O.
    2. 在 37℃ 下孵育消化液过夜 °在孵育器中以防止盖子上产生冷凝。乙醇沉淀消化后的DNA。向消化产物中加入：1 µL 甘氨酸，1/10 体积 3M 醋酸钠，2.5 体积 100% 分子生物学级乙醇。在 -80 ℃ 孵育 °C下1小时或过夜。
    3. 4℃下离心30分钟 °C. 用1体积室温70%乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下离心5分钟 °C. 去除上清液，让DNA沉淀物自然风干或用稳定气流轻轻吹干。
    4. 将 DNA 沉淀重悬于 36 µL 无菌超纯 H2O 和使用 1 µL 的 DNA 用于测定 DNA 浓度，其值应约为 285 ng/µL. 将 DNA 储存于 -20 °C.
    5. 可选步骤：取400 ng DNA在2%琼脂糖凝胶上电泳，以评估DNA片段大小。大多数片段应在100–200 bp范围内，至多有微弱信号延伸至500 bp（图2).
  4. 3' 加尾反应
    1. 将消化后的 DNA 在 100 ℃ 下变性 °C，1 分钟，立即置于冰水中冷却。向 35 µL 的 DNA 中加入以下成分：50 µL 400 mM 醋酸镉钠，1 µL 10 mM DTT，并充分涡旋振荡。加入4 µL 25 mM CoCl2, 2.5 µL 2 mM 5-(3-氨基烯基)-dUTP，来自试剂盒材料表中指定的ARES标记试剂盒，5 µ1 mM dTTP，18 µL 5x TdT缓冲液，和1 µ末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）400 U/μLµL. 涡旋并短暂离心。
      警告：CoCl2 有毒，需佩戴适当的防护装备。
    2. 在37℃孵育2小时 °C 的培养箱中以防止冷凝。加入 1 µL的250 mM EDTA终止反应，短暂涡旋混匀。按照上述方法（步骤2.3.2 - 2.3.4）对加尾DNA进行乙醇沉淀。将干燥后的DNA沉淀溶于10 µL 无菌超纯 H2O. 将 DNA 储存于 -20 °C，直至准备继续操作。
  5. 使用材料表中指定的DNA标记试剂盒进行荧光染料偶联。
    注意：加入染料后，需将样品置于避光环境中。
    1. 将带有尾部的 DNA 在 95 ℃ 变性 °在热块中于 65 °C 孵育 5 分钟。立即在冰水中冷却 DNA 并短暂离心。根据试剂盒说明书配制标记缓冲液，并加入 6 µL 至每个 DNA 样本中。将每管染料重悬于 4 µ来自试剂盒的 L DMSO。涡旋并短暂离心。
    2. 每个标记反应使用一管染料。将染料溶液加入DNA中，涡旋混匀，短暂离心。在避光条件下室温孵育标记反应2小时。加入3 µ加入 3M 盐酸羟胺溶液 L 以终止反应，随后加入 77 µ无核酸酶水的 L2来自试剂盒的O。涡旋并短暂离心。
  6. 使用材料表中指定的PCR纯化试剂盒去除未结合的染料。按照制造商说明书操作。用40 μL洗脱液分两次从柱子中洗脱DNA。 µ每次加入 L 洗脱缓冲液。
  7. 乙醇沉淀标记的DNA，具体步骤如前所述（步骤2.3.2 - 2.3.4）。将干燥的DNA沉淀溶于10 µL 洗脱缓冲液。
  8. 制备探针混合物
    1. 对于标记的DNA，测定荧光染料的浓度（单位为pmol/）µL. 荧光染料的浓度范围可为 30 - 100 pmol/µL，具体取决于BAC。DNA浓度范围可能为300 - 800 ng/µL.
      注意：微阵列设置适用于微量分光光度计，例如材料表中指定的仪器。在微阵列窗口中，选择 DNA-50，并指定荧光染料。
    2. 通过将每种BAC探针以等摩尔量（pmol荧光）混合来制备主混合液。混合前涡旋振荡30秒。为避免反复冻融，将主混合液分装成小份，用石蜡膜封住管口以防止蒸发，并于-20℃避光保存。 °C.
      注意：主混合液包含6种单独BAC探针中的每种250 pmol，总体积为30 - 50 µL 效果良好。每个 BAC 取含 25 pmol（荧光标记）的等分试样，足以用于两次 40 µL 杂交反应，最终探针浓度为 0.31 pmol fluor/µ每条BAC的L

3. 卵母细胞的解剖与固定

  1. 收集30只具有合适基因型的成年处女雌蝇。为了富集晚期卵母细胞，将雌蝇在含有果蝇食物和干酵母的培养瓶中单独饲养3至5天后再进行解剖25。解剖前一天，将雌蝇转移到含有酵母的新鲜培养瓶中，且不使用麻醉气体。
  2. 进行解剖。
    注：所需工具见图3。除非另有说明，所有溶液均使用拉制的巴斯德移液管去除。转移卵巢时，始终使用涂有10% BSA溶液的移液枪头。
    1. 在含有改良Robb's缓冲液的浅解剖皿中，用镊子从单只雌蝇中取出卵巢。用镊子或钨针轻轻展开每一对卵巢，使溶液能够接触内部的卵泡。将展开的一对卵巢转移至含有1 mL改良Robb's缓冲液的1.5 mL微量离心管中。
    2. 重复步骤3.2.1，将20至25只雌蝇的卵巢收集至同一1.5 mL微量离心管中。在10分钟内完成这20至25只雌蝇的解剖。
  3. 按以下步骤进行固定。
    1. 用拉制的巴斯德移液管吸除微量离心管中的液体，使用P1000迅速加入500 µL 37 °C的固定液，然后立即加入500 µL室温的正庚烷。
    2. 轻轻振荡微量离心管以混匀，并将其置于振荡仪上固定3分钟。将微量离心管从振荡仪上取下，放入试管架中静置1分钟，使卵母细胞沉降至管底。总固定时间为4分钟。
      注意：固定液和正庚烷具有毒性，操作时需佩戴适当的防护装备。
    3. 去除固定液，并用含0.5% BSA和0.1% Triton X-100的PBS（PBSBTx）清洗卵巢3次，每次500 µL。
  4. 对剩余的不同基因型样本重复上述步骤。

4. 去除卵壳和卵黄膜

注意：所需工具见图3。

  1. 分离晚期卵母细胞
    1. 加入 1 mL PBSBTx 至浅层解剖皿中。使用带有经 BSA 包被的吸头的 P200 移液器，将固定后的卵巢（约 150 μL）转移至解剖皿中 µ将 L）加入浅皿中。用经 BSA 包被的移液吸头将卵巢反复吹打，使成熟卵母细胞与未成熟卵母细胞分离。
    2. 当晚期卵母细胞充分分离后，将所有组织转移至500 µL 微量离心管。用拉细的巴斯德移液管吸除多余液体，保留约 150 - 200 µ将 L 加入管中。对剩余的基因型重复步骤 4.1。
  2. 准备滚压
    1. 用200 μL预湿深孔培养皿 µPBSBTx 溶液中。盖好并放置一旁。取 3 张磨砂载玻片，将第 3 张载玻片放置一旁备用。轻轻摩擦第 1 和第 2 张载玻片的磨砂区域，使其相互摩擦。用去离子水冲洗以去除玻璃碎屑，并用一次性擦拭纸擦干。
    2. 用 PBSBTx 涂覆第 1 号和第 2 号载玻片的磨砂区域，每片加入 50 µ用一次性擦拭纸将 PBSBTx 液体从一张载玻片上擦到另一张载玻片的指定区域，然后用一次性擦拭纸去除多余液体。
    3. 将载玻片置于解剖显微镜下，按照图示配置摆放 图 4A保持载玻片#1和#2的磨砂区域相互接触，载玻片#3用于支撑载玻片#2。
  3. 滚动卵母细胞；确保滚动方向始终为直线运动，切勿采用环形运动。
    1. 用 PBSBTx 预润湿 P200 移液器吸头，通过上下吹打将微离心管中的卵母细胞分散。转移 50 µ将含有卵母细胞的液体 L 滴加至载玻片 #1 的磨砂玻璃区域中央。抬起载玻片 #2 以进行此操作。
    2. 缓慢降低载玻片#2，直至液体的表面张力在两块磨砂玻璃区域之间形成密封。液体应足以覆盖磨砂区域，但不应有液体渗出。若液体溢出，可用拉细的巴斯德移液管吸除多余液体。
    3. 用一只手固定底部载玻片（#1），另一只手将顶部载玻片（#2）在水平方向来回移动，保持载玻片#2与载玻片#3接触并处于水平状态。操作过程应在显微镜下进行，以便于观察卵母细胞的移动情况和操作进展。
      注意：此操作将产生摩擦，导致卵母细胞 "卷起" 并失去其卵丘。应使用最小压力，动作应短促而迅速。
    4. 在水平方向移动几次后，略微改变移动角度（图4B。以多个增量逐步将此角度增加至90° 直到顶片（#2）的移动方向与起始方向垂直（图4B注意，空的卵壳将在液体中可见，而缺失卵壳的卵母细胞则显得更长且更细。
    5. 重复步骤 4.3.3 - 4.3.4 约 7 - 10 次，直至溶液略微浑浊。当大多数卵母细胞（75 - 85%）似乎已失去其卵黄膜时，停止滚动。
      注意：缺乏卵黄膜的卵母细胞通常可见一个明显的尖端。卵黄膜比绒毛膜更难去除。在滚动时可对顶部载玻片（载玻片#2）施加轻微压力，以帮助去除卵黄膜。试图去除所有卵母细胞的卵黄膜通常会导致其他卵母细胞破坏。
    6. 轻轻抬起顶部载玻片（#2），将其一个角拖向底部载玻片（#1）磨砂区域的中心，使卷曲的卵母细胞聚集在磨砂区域的中央。用 PBSBTx 将两片载玻片上的卵母细胞冲洗至含有 PBSBTx 的深孔培养皿中。
    7. 用超纯水清洁载玻片 #1 和 #2，用一次性擦拭纸擦干，并重新放置。重复步骤 4.3.1 - 4.3.6，直至完成同基因型所有卵母细胞的滚动。每种基因型通常需要滚动 3 - 4 轮。
  4. 去除滚动后残留的碎屑
    1. 向一个15 mL锥形管中加入1 mL PBSBTx，轻轻旋转液体以润湿管壁。
    2. 使用经 PBSBTx 包被的 P1000 移液枪头，将深孔培养皿中的卷曲卵母细胞转移至含有 1 mL PBSBTx 的离心管中。向含有卵母细胞的离心管中再加入 2 mL PBSBTx。
    3. 让卵母细胞开始沉降到管底，然后移除上层含有碎片（卵丘、卵黄层）的2 mL溶液 等等。用 P1000 吸取并弃去。如有需要，可将锥形管靠在深色背景上，以便观察不透光的卵母细胞下沉。
    4. 加入额外的 2 mL PBSBTx 至卵母细胞中，并重复步骤 4.4.3。共重复步骤 4.4.3 三次，完成总计三轮的碎片去除。
    5. 使用 PBSBTx 包被的 P1000 移液枪头，将卵母细胞转移回原始的 500 µL 微离心管。20 - 25 只雌蝇应可获得约 50 个 µL 的卷曲成熟卵母细胞。
  5. 对剩余的基因型重复第4节操作，每种基因型均使用新的磨砂载玻片、洁净的深孔培养皿和新的锥形管。
  6. 若需储存，将卵母细胞转移至1x 含0.1% Triton X-100的PBS，4℃过夜保存 °C. 不建议长期储存，因为甲醛交联可被非离子型去污剂逆转。

5. 荧光原位杂交（FISH）

注意：除非另有说明，所有洗涤步骤均在室温下于摇床上进行。经过滚动处理的卵母细胞在微量离心管底部沉降所需时间较长，尤其是在含有甲酰胺的溶液中。更换溶液时需保持耐心，以免丢失卵母细胞，此过程可能需要在漂洗和洗涤后静置 5 - 15 分钟，以使卵母细胞充分沉降。另需注意，含甲酰胺溶液中的卵母细胞透明度较低。

  1. 提取与RNA酶处理
    1. 用500 µL含1% Triton X-100的PBS（PBSTx）冲洗卵母细胞。移除液体后加入500 µL提取缓冲液（含RNA酶的PBSTx）。在室温下于振荡器上孵育2小时。
  2. 预杂交洗涤
    1. 用500 µL含Tween 20的2x 柠檬酸钠盐水（SSCT）将卵母细胞冲洗3次。预热一份（约500 µL/基因型）含50%甲酰胺的2x SSCT至37 °C。
      注意：甲酰胺具有毒性，操作时应穿戴适当的防护装备。
    2. 在500 µL的2x SSCT中每次洗涤10分钟，共洗涤3次。在500 µL的2x SSCT + 20%甲酰胺中洗涤10分钟。在500 µL的2x SSCT + 40%甲酰胺中洗涤10分钟。在500 µL的2x SSCT + 50%甲酰胺中洗涤10分钟。
    3. 移除液体，加入步骤5.2.1中预热至37 °C的500 µL 2x SSCT + 50%甲酰胺至样品中，在37 °C下旋转孵育2小时。
      注：使用配备旋转器的杂交炉效果良好。可将连接在旋转器上的泡沫微量离心管“浮子”用于固定试管。
  3. 变性与杂交
    1. 对每管卵母细胞，使用40 µL含2.5 ng/µL着丝粒探针和每种BAC探针0.31 pmol fluor/µL的1x 杂交缓冲液。配制足够用于所有基因型的探针杂交缓冲液混合液。加入前涡旋震荡探针混合物30秒。
    2. 使用BSA包被的P200移液枪头，将卵母细胞转移至200 µL PCR管中。保持样品在37 °C，待卵母细胞沉降至管底后，用拉制的巴斯德移液管尽可能移除液体。
    3. 向卵母细胞中加入40 µL含探针的杂交溶液（按第2节配制）。将含有卵母细胞的PCR管放入PCR仪中，按以下程序孵育：37 °C 5分钟，92 °C 3分钟，然后37 °C过夜。探针加入卵母细胞后，应尽可能避光保存。
  4. 杂交后洗涤
    1. 将含50%甲酰胺的2x SSCT预热至37 °C，并置于杂交孵育器中保温。使用BSA包被的P200移液枪头，向含卵母细胞的PCR管中加入100 µL 37 °C的2x SSCT + 50%甲酰胺，然后将卵母细胞转移至新的500 µL微量离心管中。
    2. 向同一管中再加入400 µL 37 °C的2x SSCT + 50%甲酰胺，在孵育器中37 °C静置使卵母细胞沉降。
      注：此步骤中沉降时间通常较长，耗时15分钟或更久属正常现象。缺乏耐心会导致卵母细胞大量丢失。
    3. 在37 °C下，用500 µL 37 °C的2x SSCT + 50%甲酰胺以旋转方式洗涤卵母细胞，每次20分钟，共3次。卵母细胞沉降过程中保持其处于37 °C。
    4. 在37 °C下，用500 µL 37 °C的2x SSCT + 50%甲酰胺以旋转方式洗涤卵母细胞，每次10分钟，共3次。卵母细胞沉降过程中保持其处于37 °C。
    5. 在室温下，于振荡器上用500 µL 2x SSCT + 40%甲酰胺洗涤卵母细胞10分钟。再用500 µL 2x SSCT + 20%甲酰胺洗涤10分钟。最后用500 µL 2x SSCT洗涤10分钟。
  5. DAPI染色
    注意：DAPI具有毒性，操作时应穿戴适当的防护装备。
    1. 在振荡器上用500 µL含DAPI（1 µg/ml）的2x SSCT溶液染色20分钟。用500 µL 2x SSCT冲洗卵母细胞3次。再在振荡器上用500 µL 2x SSCT洗涤2次，每次10分钟。样品可在避光条件下于室温保存最多4小时，直至准备封片。
  6. 封片
    注：所需工具见图3。
    1. 将经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片置于解剖显微镜下。移除卵母细胞管中的液体，调整总体积至约150 µL。使用BSA包被的P200移液枪头反复吹打使卵母细胞均匀分散于溶液中，然后取40 µL卵母细胞悬液转移至经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上。
    2. 用拉制的巴斯德移液管吸除部分液体，直至卵母细胞粘附于盖玻片但仍被液体包围。用镊子固定盖玻片一侧，用钨针轻轻分离卵母细胞团块，并将其移动至形成单层、无重叠的分布。
    3. 用拉制的巴斯德移液管吸除卵母细胞周围的剩余液体。取一张洁净的载玻片，用压缩气体吹去表面灰尘。在载玻片中央加入22 µL封片剂（例如，Prolong-GOLD）。缓慢将载玻片朝向盖玻片放下，使封片剂面向样品，直至接触样品。表面张力将使盖玻片牢固粘附于载玻片上。
    4. 将载玻片放入带有紧密盖子的塑料容器中，容器内放置一层新鲜干燥剂（例如，Drierite）。在避光条件下干燥3至5天后再进行成像。干燥时间可能因环境湿度而异。

6. 成像

  1. 从干燥剂盒中取出干燥载玻片后，清洁其表面以去除任何灰尘颗粒。用指甲油封固盖玻片。密封后的载玻片可于 -20 °C 长期保存。
  2. 使用高数值孔径 40X 油镜并配合 6X 数字变焦，获取激光扫描共聚焦图像。
    注意：理想情况下，系统软件应允许研究人员在使用落射荧光观察多个卵母细胞的染色体时，定位并标记其 X-Y 位置。该功能可显著缩短成像过程所需时间。使用高数值孔径 60X 物镜时因快速漂白问题，导致其在所选共聚焦系统中不适用，但可能适用于其他系统。
  3. 对每个卵母细胞采集 Z 轴系列图像，利用 DAPI 信号确定 Z 系列的顶部和底部位置。
    注意：增益、偏移和激光功率需通过部分卵母细胞样本进行经验性优化。一旦确定合适参数，后续仅需进行微小调整。
    若需更改采集设置，应参考先前采集的图像堆栈来估计必要的调整幅度。为避免漂白，在采集 Z 系列图像前，不应预先对染色体臂探针进行成像。当步长为 0.25 µm 时，Z 系列通常包含 25 至 30 步，具体取决于染色体的方向和位置。减小步长可能提高在轴向维度上判断两个 FISH 信号是否分离的能力，但会增加采集时间，并因漂白导致信号强度下降。使用 40X 物镜配合 6X 数字变焦及 1,024 x 512 成像区域，可获得像素尺寸为 0.05 µm 的图像。

7. 图像分析与黏连缺陷评分

  1. 对Z系列图像进行去卷积处理，以优化每个卵母细胞的信噪比19。
    注意：使用如材料表中指定的软件包，可实现基于积分恢复法的去卷积，并对图像进行裁剪和对比度增强。重要的是，必须使用能够以三维方式查看图像并评估黏连缺陷的软件包。
  2. 针对每个卵母细胞，统计与DAPI信号共定位的染色体臂和着丝粒焦点数量。黏连丧失会导致某一特定探针出现三个或四个明显分离的信号。有时可观察到两个焦点之间由一条细丝连接，根据最严格的标准，此类焦点不应被视为“分离”。

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结果

图5 呈现了使用与细胞学区域6E-7B杂交的臂探针所获得的图像 X 染色体。该探针产生的信号与DAPI信号共定位，易于与背景区分，并已成功用于量化不同基因型中的染色体臂黏连缺陷19. 黏连缺陷的量化仅限于前期I和中期I阶段；核膜破裂之前的卵母细胞被排除在分析之外19在DAPI通道中扫描时，完整的核膜表现为卵母细胞染色体周围存在一个比周围细胞质更暗的清晰环形区域。

图5B 显示了去卷积和对比度增强后各个Z系列的最大强度投影。量化黏连缺陷需要确定每个探针与DAPI信号重叠的FISH信号数量。进行此类分析时，必须将合并后的图像在三维空间中可视化。只有在三个维度上均明显与DAPI信号相关联的FISH信号点才能纳入分析。

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讨论

Drosophila oocytes 在前期 I 和中期 I 使用 FISH 探针评估臂 cohesion 状态是 Drosophila 减数分裂领域的一项重要进展。传统上，Drosophila 研究人员仅能依赖遗传学检测来推断成熟卵母细胞中臂 cohesion 的过早丢失11,18,19。如今，通过本文介绍的方法，可直接利用 FISH 对臂 cohesion 状态进行检测。获得臂 cohesion 过早丢失的物理证据的能力，极大地拓展了可用于研究 Drosophila 卵母细胞中臂 cohesion 过早丢失及染色体错误分离机制的方法体系。

关键步骤
尽管我们尚未对在成熟的 Drosophila 卵母细胞中成功可视化染色体臂上单拷贝序列荧光探针所必需的关键参数进...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）授予Sharon E. Bickel的资助项目GM59354支持。我们感谢Huy Q. Nguyen在开发荧光染色体臂探针制备方案方面的协助，感谢Ann Lavanway在共聚焦显微镜方面的帮助，以及J. Emiliano Reed提供的技术支持。我们还感谢果蝇研究领域众多同行的有益讨论与建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂盒
Midi Prep 试剂盒Qiagen12143制备BAC克隆DNA
GenomePlex 完整全基因组扩增（WGA）试剂盒SigmaWGA2扩增BAC克隆DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA 标记试剂盒InvitrogenA21676标记BAC克隆DNA
PCR 纯化试剂盒Qiagen28104去除BAC克隆DNA标记后未结合的染料
名称公司目录编号评论
化学品 &与解决方案
注意： 所有溶液均使用无菌超纯水配制，并应通过高压灭菌或过滤除菌法进行灭菌。
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP1600-100配制10%的储备液
冻存分装样本
氯化钙Fisher ScientificC75-500
DAPI（4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐InvitrogenD1306有毒的 穿戴适当的防护装备。配制100µg/ml 储液，溶于 100% 乙醇中，分装后于 -20 ℃ 保存 °C. 准备 1 µ使用前将溶液配制成 2X SSCT 中的 g/ml 溶液。
硫酸葡聚糖SigmaD-8906
DrieriteDrierite 公司23001
二硫苏糖醇 (DTT)Invitrogen15508-013制备 10 mM 储存液
dTTP (10 µ摩尔，100 µl)Boehringer Mannheim1277049制备1 mM储备液
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）Fisher ScientificS311-500制备 250 mM 储液
100% 乙醇（分子级，200 proof）Decon Laboratories2716
Tris（超纯）Invitrogen15504-020
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）SigmaE-3889
16% 甲醛Ted Pella, Inc.18505有毒的 穿戴适当的防护装备
甲酰胺InvitrogenAM9342有毒 穿戴适当的防护装备
葡萄糖Fisher ScientificD16-1
糖原罗氏901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
庚烷Fisher ScientificH350-4有毒的 穿戴适当的防护装备。
盐酸默克密理博HX0603-4有毒的 穿戴适当的防护装备。
羟胺Sigma438227制备 3 M 储存液
4.9 M 氯化镁Sigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
聚-L-赖氨酸（0.1 mg/ml）SigmaP8920-100
乙酸钾Fisher ScientificBP364-500
乙酸钠Fisher ScientificS209-500制备3M储备液
二甲胂酸钠Polysciences, Inc.1131有毒的 佩戴适当的防护装备。配制400 mM的储存液
柠檬酸钠Fisher ScientificBP327-1
氯化钠Fisher ScientificS271-3氯化钠
蔗糖Fisher ScientificS5-500
10% Tween 20赛默飞世尔科技28320Surfact-Amps
10% Triton X-100赛默飞世尔科技28314Surfact-Amps
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溶液
注意： 所有溶液均使用无菌超纯水配制，并应通过高压灭菌或过滤除菌进行灭菌处理。
TE缓冲液10 mM Tris，1 mM EDTA，pH = 8.0
20X SSC（氯化钠柠檬酸钠）3 M NaCl，300 mM 柠檬酸钠
2X 卡考基酸盐固定液有毒的： 佩戴适当的防护装备。200 mM 二甲胂酸钠，200 mM 蔗糖，80 mM 醋酸钠，20 mM EGTA
1.1X 杂交缓冲液3.3X SSC，55% 甲酰胺，11% 硫酸葡聚糖
固定液有毒的 佩戴适当的防护装备。4% 甲醛，1X 卡可基酸盐固定液
PBSBTx1X PBS，0.5% BSA，0.1% Triton X-100
PBSTx1X PBS，1% Triton X-100
提取缓冲液（PBSTx + Rnase）1× PBS，1% Triton X-100，100 µg/mL RNase
2X SSCT2X SSC，0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% 甲酰胺有毒的 佩戴适当的防护装备。2X SSC，0.1% Tween 20，20% 甲酰胺
2X SSCT + 40% 甲酰胺有毒的 佩戴适当的防护装备。2X SSC，0.1% Tween 20，40% 甲酰胺
2X SSCT + 50% 甲酰胺有毒的 佩戴适当的防护装备。2X SSC，0.1% Tween 20，50% 甲酰胺
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酶
AluI新英格兰生物实验室R0137S
HaeIII新英格兰生物实验室R0108S
MseI新英格兰生物实验室R0525S
MspI新英格兰生物实验室R0106S
RsaI新英格兰生物实验室R0167S
BfuCI新英格兰生物实验室R0636S
100X BSA新英格兰生物实验室附带 NEB 酶
10X NEB缓冲液#2新英格兰生物实验室限制性内切酶消化缓冲液。随NEB酶提供
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）400 U/µl罗氏/西格玛3333566001
TdT缓冲液罗氏/西格玛附带 TdT 酶
氯化钴罗氏/西格玛有毒 佩戴适当的防护装备。随附TdT酶
RNase A（10 mg/mL）Thermo-ScientificEN0531
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细胞学工具等
镊子Dumont#5 INOX，生物学
9” 一次性玻璃巴斯德吸管Fisher13-678-20C高压灭菌
浅层玻璃解剖皿定制制作
深孔培养皿（3 孔）Pyrex7223-34
Fisherfinest 品牌显微镜载玻片Fisher Scientific22-038-104用于覆盖深孔培养皿
磨砂玻璃载玻片，25 × 75 mmVWR Scientific48312-002
载玻片，3 英寸 × 1 英寸，厚度 1 mm赛默飞世尔科技3051
盖玻片，10 × 10 mm，1.5号Thermo-Scientific3405
钨针自制的
Prolong GOLD 封片剂分子探针P36930
罐装压缩空气多种
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设备
PCR仪多种
Nanodrop 2000，分光光度计赛默飞世尔科技微量分光光度计
涡旋振荡器多种
室温下的台式微型离心机多种
4°C 台式微型离心机 °C多种
加热块多种
带有旋转器的杂交炉或培养箱多种
摇床多种
A1RSi 激光扫描共聚焦显微镜尼康40倍油镜平场荧光微分干涉差（DIC，数值孔径1.3）
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耗材等
50 mL 圆底离心管多种
15 mL 圆锥形试管多种
1.5 mL 微量离心管多种
500 µl 微量离心管多种
200 µl PCR 管多种
带紧密盖子的塑料容器多种用于盛放Drierite
Kimwipes多种一次性湿巾
Parafilm多种石蜡膜
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其他
HPLC 纯化的 5'-标记寡核苷酸Integrated DNA Technologies识别359 bp卫星重复序列的Cy3标记探针 X 染色体
Volocity 3D 图像分析软件PerkinElmer版本 6.3

参考文献

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710(2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

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FISH探针减数分裂染色体臂黏连前期I共聚焦显微镜卵母细胞滚动染色体分离
使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞
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