本文提供了一种详细的实验方法，用于制备X染色体臂探针，并通过荧光原位杂交（FISH）技术检测处于前中期和中期 I 停滞状态的Drosophila卵母细胞中姐妹染色单体黏连的状态。该实验方案适用于判断不同基因型条件下减数分裂染色体臂部黏连是否保持完整或发生破坏。
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方法文章
使用荧光原位杂交技术可视化果蝇卵母细胞中染色体臂的黏连缺陷 原位 利用荧光原位杂交（FISH）监测早前期I和中期I染色体臂黏连状态 果蝇 卵母细胞
本文内容
摘要
摘要
在人类中，卵母细胞的染色体分离错误是导致大多数流产和出生缺陷的主要原因。此外，随着女性年龄增长，其怀有非整倍体胎儿的风险显著增加，这一现象被称为母龄效应。在减数分裂过程中实现准确染色体分离的一个前提是卵母细胞经历的长期前期阶段中维持姐妹染色单体的黏连。人类及模式生物的细胞学证据表明，减数分裂黏连在衰老过程中会逐渐衰退。此外，人类卵母细胞中的染色体分离错误主要发生在减数分裂I期，这与染色体臂部黏连的过早丢失一致。利用模式生物对于揭示黏连随年龄依赖性丢失的机制至关重要。 Drosophila melanogaster 在研究卵母细胞减数分裂黏连调控机制方面具有多项优势。然而，直到最近，仍仅有遗传学检测方法可用于评估不同基因型或不同实验条件下卵母细胞中染色体臂黏连的丧失情况。本文提供了一种利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）直接观察减数分裂前期I和中期I停滞的果蝇卵母细胞中染色体臂黏连缺陷的详细实验方案。 原位 杂交（FISH）直接观察前期I和中期I停滞的染色体臂黏连缺陷 果蝇 卵母细胞。通过构建一个与X染色体远端臂杂交的FISH探针，并采集共聚焦Z轴层扫图像， X 染色体并采集共聚焦Z轴层扫图像，研究人员可以在三维空间中观察单个FISH信号的数量，从而判断姐妹染色单体臂是否分离。该方案使得在数百个果蝇卵母细胞中定量分析染色体臂黏连缺陷成为可能。 果蝇 卵母细胞。因此，该方法为研究参与黏连维持的机制以及导致其在衰老过程中衰退的因素提供了重要的工具。
引言
有丝分裂和减数分裂过程中染色体的正确分离依赖于姐妹染色单体黏连的建立、维持和有序释放1,2。黏连在S期建立，由黏连蛋白复合物介导，该复合物形成物理连接以维持姐妹染色单体的结合。在减数分裂中，交换位点远端的黏连还起到将重组同源染色体连接在一起的作用，这种物理关联有助于确保二价体在减数第一次分裂中期纺锤体上的正确取向（图1）3,4,5。在后期I时，染色单体臂部黏连的释放使同源染色体分离至纺锤体两极。然而，若臂部黏连过早丢失，重组的同源染色体将失去物理连接而随机分离，从而导致非整倍体配子的产生（图1）。
在人类卵母细胞中，染色体分离错误是导致流产和出生缺陷（如唐氏综合征6）的主要原因，且其发生率随母亲年龄呈指数级增长7。姐妹染色单体黏连在胎儿期的卵母细胞中建立，减数分裂重组在出生前完成。随后，卵母细胞停滞在减数第一次分裂的中期前期，直至排卵；在此停滞期间，重组同源染色体....
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方案
1. 准备工作
- 配制荧光溶液 原位 杂交（FISH）。所有溶液均使用超纯水配制。
- 制备 5x 改良Robb缓冲液：275 mM醋酸钾，200 mM醋酸钠，500 mM蔗糖，50 mM葡萄糖，6 mM氯化镁，5 mM氯化钙，500 mM HEPES，pH = 7.4。用10 N NaOH调节pH至7.4。过滤除菌后于-20 ℃保存 °C. 解冻并稀释至1倍浓度 视需要添加并储存1x -20 保存的等份样本 °C.
- 制备10x 磷酸盐缓冲液（PBS），使用 1.3 M NaCl、70 mM Na2HPO4，30 mM NaH2PO4用10 N NaOH将pH调至7.0。通过高压灭菌或滤膜过滤除菌。
- 在需要使用的前一天制备多聚-L-赖氨酸盖玻片。
- 将含有1%盐酸的70%乙醇滴加到18 mm × 18 mm #1.5盖玻片表面，孵育5分钟。用真空抽吸法去除液体。用无菌超纯水重复操作。在盖玻片表面加入0.1 mg/mL多聚-L-赖氨酸，覆盖整个表面，孵育10分钟。
- 吸除液体，室温晾干10分钟。将盖玻片有聚-L-赖氨酸的一侧朝上，存放于带紧密盖子的塑料....
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结果
图5 呈现了使用与细胞学区域6E-7B杂交的臂探针所获得的图像 X 染色体。该探针产生的信号与DAPI信号共定位，易于与背景区分，并已成功用于量化不同基因型中的染色体臂黏连缺陷19. 黏连缺陷的量化仅限于前期I和中期I阶段；核膜破裂之前的卵母细胞被排除在分析之外19在DAPI通道中扫描时，完整的核膜表现为卵母细胞染色体周围存在一个比周围细胞质更暗的清晰环形区域。
图5B 显示了去卷积和对比度增强后各个Z系列的最大强度投影。量化黏连缺陷需要确定每个探针与DAPI信号重叠的FISH信号数量。进行此类分析时，必须将合并后的图像在三维空间中可视化。只有在三个维度上均明显与DAPI信号相关联的FISH信号点才能纳入分析。
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讨论
Drosophila oocytes 在前期 I 和中期 I 使用 FISH 探针评估臂 cohesion 状态是 Drosophila 减数分裂领域的一项重要进展。传统上，Drosophila 研究人员仅能依赖遗传学检测来推断成熟卵母细胞中臂 cohesion 的过早丢失11,18,19。如今，通过本文介绍的方法，可直接利用 FISH 对臂 cohesion 状态进行检测。获得臂 cohesion 过早丢失的物理证据的能力，极大地拓展了可用于研究 Drosophila 卵母细胞中臂 cohesion 过早丢失及染色体错误分离机制的方法体系。
关键步骤
尽管我们尚未对在成熟的 Drosophila 卵母细胞中成功可视化染色体臂上单拷贝序列荧光探针所必需的关键参数进.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）授予Sharon E. Bickel的资助项目GM59354支持。我们感谢Huy Q. Nguyen在开发荧光染色体臂探针制备方案方面的协助，感谢Ann Lavanway在共聚焦显微镜方面的帮助，以及J. Emiliano Reed提供的技术支持。我们还感谢果蝇研究领域众多同行的有益讨论与建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂盒 | |||
| Midi Prep 试剂盒 | Qiagen | 12143 | 制备BAC克隆DNA |
| GenomePlex 完整全基因组扩增（WGA）试剂盒 | Sigma | WGA2 | 扩增BAC克隆DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA 标记试剂盒 | Invitrogen | A21676 | 标记BAC克隆DNA |
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | 去除BAC克隆DNA标记后未结合的染料 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 化学品 &与解决方案 | |||
| 注意： 所有溶液均使用无菌超纯水配制，并应通过高压灭菌或过滤除菌法进行灭菌。 | |||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Scientific | BP1600-100 | 配制10%的储备液 冻存分装样本 |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI（4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | Invitrogen | D1306 | 有毒的 穿戴适当的防护装备。配制100µg/ml 储液，溶于 100% 乙醇中，分装后于 -20 ℃ 保存 °C. 准备 1 µ使用前将溶液配制成 2X SSCT 中的 g/ml 溶液。 |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite 公司 | 23001 | |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | 制备 10 mM 储存液 |
| dTTP (10 µ摩尔，100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | 制备1 mM储备液 |
| EDTA（乙二胺四乙酸二钠） | Fisher Scientific | S311-500 | 制备 250 mM 储液 |
| 100% 乙醇（分子级，200 proof） | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris（超纯） | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸） | Sigma | E-3889 | |
| 16% 甲醛 | Ted Pella, Inc. | 18505 | 有毒的 穿戴适当的防护装备 |
| 甲酰胺 | Invitrogen | AM9342 | 有毒 穿戴适当的防护装备 |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-1 | |
| 糖原 | 罗氏 | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| 庚烷 | Fisher Scientific | H350-4 | 有毒的 穿戴适当的防护装备。 |
| 盐酸 | 默克密理博 | HX0603-4 | 有毒的 穿戴适当的防护装备。 |
| 羟胺 | Sigma | 438227 | 制备 3 M 储存液 |
| 4.9 M 氯化镁 | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| 聚-L-赖氨酸（0.1 mg/ml） | Sigma | P8920-100 | |
| 乙酸钾 | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| 乙酸钠 | Fisher Scientific | S209-500 | 制备3M储备液 |
| 二甲胂酸钠 | Polysciences, Inc. | 1131 | 有毒的 佩戴适当的防护装备。配制400 mM的储存液 |
| 柠檬酸钠 | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-3 | 氯化钠 |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | 赛默飞世尔科技 | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | 赛默飞世尔科技 | 28314 | Surfact-Amps |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 溶液 | |||
| 注意： 所有溶液均使用无菌超纯水配制，并应通过高压灭菌或过滤除菌进行灭菌处理。 | |||
| TE缓冲液 | 10 mM Tris，1 mM EDTA，pH = 8.0 | ||
| 20X SSC（氯化钠柠檬酸钠） | 3 M NaCl，300 mM 柠檬酸钠 | ||
| 2X 卡考基酸盐固定液 | 有毒的： 佩戴适当的防护装备。200 mM 二甲胂酸钠，200 mM 蔗糖，80 mM 醋酸钠，20 mM EGTA | ||
| 1.1X 杂交缓冲液 | 3.3X SSC，55% 甲酰胺，11% 硫酸葡聚糖 | ||
| 固定液 | 有毒的 佩戴适当的防护装备。4% 甲醛，1X 卡可基酸盐固定液 | ||
| PBSBTx | 1X PBS，0.5% BSA，0.1% Triton X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS，1% Triton X-100 | ||
| 提取缓冲液（PBSTx + Rnase） | 1× PBS，1% Triton X-100，100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC，0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% 甲酰胺 | 有毒的 佩戴适当的防护装备。2X SSC，0.1% Tween 20，20% 甲酰胺 | ||
| 2X SSCT + 40% 甲酰胺 | 有毒的 佩戴适当的防护装备。2X SSC，0.1% Tween 20，40% 甲酰胺 | ||
| 2X SSCT + 50% 甲酰胺 | 有毒的 佩戴适当的防护装备。2X SSC，0.1% Tween 20，50% 甲酰胺 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 酶 | |||
| AluI | 新英格兰生物实验室 | R0137S | |
| HaeIII | 新英格兰生物实验室 | R0108S | |
| MseI | 新英格兰生物实验室 | R0525S | |
| MspI | 新英格兰生物实验室 | R0106S | |
| RsaI | 新英格兰生物实验室 | R0167S | |
| BfuCI | 新英格兰生物实验室 | R0636S | |
| 100X BSA | 新英格兰生物实验室 | 附带 NEB 酶 | |
| 10X NEB缓冲液#2 | 新英格兰生物实验室 | 限制性内切酶消化缓冲液。随NEB酶提供 | |
| 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）400 U/µl | 罗氏/西格玛 | 3333566001 | |
| TdT缓冲液 | 罗氏/西格玛 | 附带 TdT 酶 | |
| 氯化钴 | 罗氏/西格玛 | 有毒 佩戴适当的防护装备。随附TdT酶 | |
| RNase A（10 mg/mL） | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 细胞学工具等 | |||
| 镊子 | Dumont | #5 INOX，生物学 | |
| 9” 一次性玻璃巴斯德吸管 | Fisher | 13-678-20C | 高压灭菌 |
| 浅层玻璃解剖皿 | 定制制作 | ||
| 深孔培养皿（3 孔） | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest 品牌显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 22-038-104 | 用于覆盖深孔培养皿 |
| 磨砂玻璃载玻片，25 × 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| 载玻片，3 英寸 × 1 英寸，厚度 1 mm | 赛默飞世尔科技 | 3051 | |
| 盖玻片，10 × 10 mm，1.5号 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| 钨针 | 自制的 | ||
| Prolong GOLD 封片剂 | 分子探针 | P36930 | |
| 罐装压缩空气 | 多种 | ||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 设备 | |||
| PCR仪 | 多种 | ||
| Nanodrop 2000，分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 微量分光光度计 | |
| 涡旋振荡器 | 多种 | ||
| 室温下的台式微型离心机 | 多种 | ||
| 4°C 台式微型离心机 °C | 多种 | ||
| 加热块 | 多种 | ||
| 带有旋转器的杂交炉或培养箱 | 多种 | ||
| 摇床 | 多种 | ||
| A1RSi 激光扫描共聚焦显微镜 | 尼康 | 40倍油镜平场荧光微分干涉差（DIC，数值孔径1.3） | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 耗材等 | |||
| 50 mL 圆底离心管 | 多种 | ||
| 15 mL 圆锥形试管 | 多种 | ||
| 1.5 mL 微量离心管 | 多种 | ||
| 500 µl 微量离心管 | 多种 | ||
| 200 µl PCR 管 | 多种 | ||
| 带紧密盖子的塑料容器 | 多种 | 用于盛放Drierite | |
| Kimwipes | 多种 | 一次性湿巾 | |
| Parafilm | 多种 | 石蜡膜 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 其他 | |||
| HPLC 纯化的 5'-标记寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | 识别359 bp卫星重复序列的Cy3标记探针 X 染色体 | |
| Volocity 3D 图像分析软件 | PerkinElmer | 版本 6.3 |
参考文献
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al.
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