CMAP扫描MUNE（MScan）——一种新型运动单位数量估计（MUNE）方法

摘要

本方案描述了一种通过拟合复合肌肉动作电位的详细刺激-反应曲线来估算肌肉中功能性运动单位数量的新方法。该方法操作简便、分析快速，且具有良好的可重复性。

摘要

与其他运动单位计数估计（MUNE）方法类似，复合肌肉动作电位（CMAP）扫描MUNE（MScan）是一种无创性电生理学方法，用于估计肌肉中功能性运动单位的数量。MUNE是评估神经病变和神经元病变的重要工具。与目前使用的大多数MUNE方法不同，MScan通过将模型拟合到详细的刺激-反应曲线（即CMAP扫描）来评估肌肉中的全部运动单位，从而避免了基于少量运动单位样本外推所固有的偏差。与“贝叶斯MUNE”类似，MScan分析通过构建包含不同幅度、阈值及阈值变异性运动单位的模型来进行拟合，但其拟合方法截然不同，且可在五分钟内完成，而非数小时。MScan的离线分析分为两个阶段：首先，基于扫描数据点的斜率和方差生成一个初步模型；其次，通过调整所有参数，优化模型生成的扫描曲线与原始扫描曲线之间的拟合度，从而对模型进行精细化修正。

该新方法已在22名肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者和20名健康对照者中进行了可重复性与记录时间的测试，每项测试均由两位不知情的医师各重复一次。MScan显示出色的组内和组间评定者可重复性，ICC值为 >0.98，变异系数平均为12.3 ± 1.6%。两名观察者之间的组内重复性无差异。平均记录时间为6.27 ± 0.27分钟。

本方案描述了如何记录复合肌肉动作电位（CMAP）扫描，以及如何使用MScan软件估算功能性运动单位的数量和大小。MScan是一种快速、便捷且可重复的方法，可能有助于神经肌肉疾病的诊断及疾病进展的监测。

引言

运动系统的运动依赖于运动单位，运动单位是指单个运动神经纤维及其所支配的肌纤维，而运动单位数量是指支配单块肌肉的前角细胞或轴突的数量¹。在失神经和再神经过程中，健康的轴突通过侧支芽生代偿已丧失功能的轴突。因此，复合肌肉动作电位（CMAP）波幅无法提供有关运动单位丢失程度的必要信息。只有当超过50%的运动单位丢失时，CMAP波幅才可能开始下降。同样，异常自发电活动或运动单位电位（MUP）改变的幅度也与失神经的程度无明确相关性。

总体而言，目前尚无一种电生理学技术能够简单、直接地测量运动单元数量。因此，通常采用运动单元数量估计值（MUNE）来评估下运动神经元的丢失情况²。自1971年McComas首次提出递增刺激MUNE法以来，已发展出多种MUNE方法³。大多数方法基于测量多个表面记录的运动单元电位（sMUP），并将最大复合肌肉动作电位（CMAP）幅值除以平均sMUP幅值。这类方法包括递增刺激法⁴、多点刺激法（MPS）⁵和峰电位触发平均法⁶。其他MUNE方法则采用基于运动单元对刺激反应的放电概率特性的统计学技术^7,8,9,10。这种变异性意味着不同运动单元组合的激活会导致CMAP反应幅度的波动。运动单元数量指数（Munix）是一种较新提出的方法，它利用自主收缩期间记录的表面干扰图型来估算sMUP的平均大小^11,12。

这些MUNE方法均存在一种或多种局限性，例如主观性、依赖于绝对的CMAP波幅、在单位选择上的偏差、需要较长时间采样足够数量的单位，或需要较长时间分析结果。最近开发出一种新的MUNE方法——“CMAP扫描MUNE”（MScan），旨在克服这些局限性。¹³该方法通过分析所有运动单元对复合肌肉动作电位（CMAP）的贡献（依据详细的刺激-反应曲线，即CMAP扫描结果进行测量），避免了传统单元选择方法中存在的固有缺陷。^14,15同时避免了类似模型拟合方法所需的较长分析时间^9,10，通过使用新算法¹⁶在最近的一项研究中，MScan在估算运动单元数量方面的可重复性优于两种更传统的检测方法，即MPS MUNE和Munix。¹³此外，MScan 能够比 MPS MUNE 和 Munix 更早地显示肌萎缩侧索硬化症（ALS）早期的运动单位丢失。MScan 的检测速度比 MPS MUNE 更快，与 Munix 相当。¹³.

本文详细描述了MScan的方法学。同时总结了既往报道的MScan在肌萎缩侧索硬化症患者及健康对照受试者中的研究者内部和研究者间重复性结果¹³，以帮助读者判断该方法是否适用于计划开展的研究。

方案

所有受试者必须在检查前签署书面知情同意书，且记录方案必须获得相应的地方伦理审查委员会批准。本文所述所有方法均经地区科学伦理委员会和丹麦数据保护局批准。

注意：记录是使用以下设备进行的 “TRONDNF” 记录协议是软件的一部分（参见材料表）。所使用的其他设备包括双极刺激器、50 Hz 噪声消除器、放大器和模数转换（A/D）板（建议配备音频放大器以反馈肌电图（EMG）活动，以及静音盒用于在电刺激期间切断声音）。采用 MScan 方法进行运动单元数量估计包含三个阶段：1）受试者准备（与神经兴奋性研究相同），2）记录复合肌肉动作电位（CMAP）扫描，3）使用 MScan 软件分析结果。以下所述的记录程序针对我们所使用的软件和仪器（参见 材料表）；这些参数需要根据其他软件和硬件进行调整。

1. 受试者的准备

1. 筛选受试者，确保其除将要研究的疾病组外，无神经系统疾病史（特别是神经病变和腕管综合征）。
2. 详细向受试者说明检查过程，并签署书面知情同意书。
   1. 告知受试者，记录开始后，功率将逐渐增加至最大值，随后逐步降低，检查过程大约需要5至6分钟。
   2. 说明受试者的手部和手指会产生瘙痒感。
   3. 告知受试者，若感到明显不适，可在记录过程中的任何时刻立即关闭电源。
3. 清洁受试者’用皮肤准备凝胶和酒精清洁手部和前臂。
4. 将有源记录电极置于拇短展肌上方，参考电极置于拇指掌指关节处图1).
5. 将接地电极放置在手背。
6. 将这些电极连接到前置放大器（图1).
7. 用胶带将手指绑在一起，以消除因自主运动引起的噪声和伪影图1).
8. 使用加热灯将皮肤温度维持在32 °C至36 °C之间。

2. 记录 CMAP 扫描

注意：下文所述的所有软件操作均针对我们所使用的软件和仪器（参见材料表）；若使用其他软件或硬件，需相应调整操作步骤。

1. 启动半自动计算机系统。
2. 选择 ‘MScan-R’ 从“选择记录方案”表单中选择记录方案。
3. 接受前置放大器和刺激器的默认设置。
4. 在“选择记录参数”表单中，于“输出文件”框内输入2至3个字母的操作员前缀，然后单击 "O.K." 按钮。
5. 当程序显示原始肌电（Raw EMG）输入时，选择以下任意一项 ‘MScan 参数’ （扫描步长、刺激间隔和刺激宽度）手动设置，或接受默认参数：刺激宽度 0.2 ms，扫描步长 0.2%，刺激间隔 0.5 s。点击 "好的" 或按下 “逃离” 继续按键。
   注意：本研究中采用默认参数设置，滤波器设定为3 Hz - 3 kHz。
6. 在腕部正中神经上放置一个可调节的双极刺激电极，以确定阈值最低的刺激位点。点击 “好的” 开始刺激。
7. 下一个显示界面展示刺激（初始为最大输出的15%）和肌电图（EMG）反应；调整电极位置以找到阈值最低的部位（即 最大反应）。如有必要，调整记录电极的位置，以确保复合肌肉动作电位（CMAP）呈双相且具有单一峰形。如需要，调整刺激强度以 ‘插入’ 和 ‘删除’ 键，然后单击 “好的” 继续.
8. “修改后”的反应出现，并显示一个“窗口”，其中以水平品红色线条标示出反应的测量区间。确保窗口前的短绿色线条（表示基线）位于刺激伪迹与反应之间，呈一条水平直线。如有必要，可通过按住鼠标右键设定窗口起点，向右拖动光标，然后松开按钮以确定窗口终点。
   注意：CMAP波幅峰值高度是在时间窗内从基线到向上波峰进行测量，并以垂直蓝色线条标示。
   点击 "好的" 继续。
9. 将可移动电极替换为非极化粘性刺激阴极电极，并在正中神经走行方向近端2 cm处放置阳极；此时下方波形显示高增益肌电图。指导受试者调整手部至最放松的位置，以尽量减少自发性电活动。点击 "好的" 继续。
10. 手动按压以逐步增加刺激强度 “插入” 按键直至刺激电流超过CMAP最大波幅所需的水平；首先以3%的刺激强度梯度递增，随后进行精细调节时使用1%的梯度。
11. 在单击之前检查窗口和峰值测量 “好的” 单击按钮以开始 CMAP 扫描。
12. 注意，在记录完20次超最大刺激（预扫描）的反应后，刺激强度会自动逐步降低，从超最大刺激水平逐渐减小直至不再出现可辨别的运动反应，随后再记录另一组20次复合肌肉动作电位（后扫描）。
    注意：数据以折线图形式呈现 ‘CMAP扫描’，或绘制一条详细的刺激-反应曲线，其中纵轴表示运动反应的幅度，横轴表示刺激强度。在健康受试者中，该曲线呈S形；而在运动单位数量减少的患者中（如肌萎缩侧索硬化症患者），曲线则呈现阶梯状外观（图2).
13. 请注意，除了从静音盒中获得的反馈外，还可以通过左侧中间面板检查受试者是否处于放松状态。观察左上方面板中的复合肌肉动作电位（CMAP，改良版），以及左下方面板中刺激强度（阈值）的下降情况。同时跟踪右侧的 CMAP 扫描结果。
14. 通过点击完成录制 “好的” 右下角的按钮，除非需要重复扫描，否则请保存数据。
    注意：填写“图注和比例尺”表单时，必须替换所有问号。

3. MScan 分析

注意：下文所述的所有软件操作均针对我们所使用的软件和仪器（参见材料表）；若使用其他软件或硬件，需相应调整操作步骤。

1. 将模型拟合到 CMAP 扫描数据
   1. 要进行离线分析，请启动分析程序并点击 "O.K." 选择最后一次记录进行分析.
   2. 点击 “选择 ‘拟合 MScan QZD 文件” 来自 “MScanFit“ 菜单
      注意：也可选择 “在 MEM 文件上拟合 MScan”也有可能进行选择 “拟合 MScan 数据文件（mA mV）” 如果CMAP扫描所使用的设备与本文所用设备不同，请参见下文如何创建DAT文件。
   3. 注意，程序首先生成一个初步模型，然后继续优化拟合。在“优化”框中的多色进度条完成之前，无需用户干预，且 "停止" 按钮呈灰色不可用状态。
   4. 初步模型根据扫描序列中各部分的斜率和方差提供了一个初始的模型估计。请注意，原始扫描数据（黑色）与由模型生成的扫描数据（洋红色）可并列显示。通过文本显示及其他替代显示方式，跟踪模型及其改进过程。
      注意：可根据“要绘制的数据”、“振幅绘制方式”和“图型类型”选项框中的设置，在任何时候选择其他显示方式。
   5. 通过连续调整以最小化模拟与记录的CMAP扫描之间的差异，进行优化以改善对记录CMAP的拟合效果¹⁶.
      注意：此步骤将依次运行多个优化程序，起始于此前详细描述的初步模型¹⁵如果优化过程增加了单元数量，则下一次拟合扫描将从生成包含更多单元的模型开始；而如果首次优化减少了单元数量，则第二次尝试将从包含较少单元的模型开始。若一切顺利，优化程序将逐步收敛于最适单元数量，以实现对扫描数据的最佳拟合。
   6. 请注意，在运行优化程序时，优化面板还会显示一个彩色进度条。
   7. 使用不同的绘图选项在 “绘图类型” 盒 即，轮廓图，误差与N单位，模型单位，累积振幅，用于跟踪优化过程。
      注意：模型在优化过程中的变化将根据最新模型持续更新，且可通过不同的绘图选项和文本显示来跟踪模型的改进情况。
      1. 轮廓图
         1. 利用等高线图通过模糊化点位并根据x-y分布的差异生成误差评分，以评估模型的准确性¹⁵选择 “差异” 和 “轮廓图” 通过等高线图显示记录的与模型CMAP扫描之间的差异。优化过程旨在最小化这些差异。
            注意：“等高线图”可显示在给定刺激下获得特定反应的概率密度。误差评分取决于原始等高线图与模型等高线图之间的差异，通过选择可将该差异可视化 ‘差异’ 顶部面板中的选项和 ‘轮廓图’ 在“图类型”面板中，红线表示原始扫描中点的密度更高，绿线表示模型扫描中点的密度更高。顶部的差异图显示了误差最大的刺激强度所在的位置。
      2. 误差 v N 单位
         1. 按照优化流程，选择对数-对数 ‘误差与 N 单位’ 图。优化过程的每个阶段均以不同颜色绘制，与下方柱状图中的色块相对应。 ‘优化’ 面板
      3. 模型单元
         1. 使用此方法可观察模型中不同轴突的募集如何构成平均 CMAP 振幅；上部显示各个运动单元的峰值振幅及其阈值分布。
      4. 累积振幅
         1. 注意，此处的单位按尺寸递增的顺序排列，而非按阈值排列。黑色曲线表示累积的单位数量，而红色曲线表示累积的幅度。
2. 当优化过程完成后，在“MScanFit 文本显示”中查看分析结果。可用的 MScan 参数包括， 即，单位数量、中位振幅、最大单位尺寸显示在文本显示区域。
3. 点击 “好的” 单击“将拟合结果保存到MEM文件”框中的按钮，将模型保存至MEM文件，以供进一步分析。

4. 使用.DAT文件进行CMAP扫描MUNE

注意：该软件的一个替代免费版本可用来分析由其他设备记录的 CMAP 扫描数据。

1. 生成一个包含待分析CMAP扫描数据的.DAT文件。
   注意：该文件必须是标准的两列文本文件，其中一列为刺激强度（单位：mA），另一列为CMAP波幅（单位：mV）。
2. 通过将电子表格文件中的两列数据复制到文本编辑软件中，并将文件扩展名指定为.DAT而非.TXT，来生成合适的.DAT文件。
   1. 启动独立运行程序并选择.DAT文件后，按照先前所述方法完成MScan分析的所有其他步骤。
3. 在伦敦大学学院FTP网站上获取免费软件程序、使用手册及示例数据（主机地址：144.82.46.62，用户名：QtracW，密码：Hg32wK5e）。

结果

最近的一项研究获得了以下结果，该研究将MScan方法与两种已建立的技术进行了比较：多点刺激运动单位计数法（MPS）和运动单位数量指数（Munix）¹³。结果表明，采用本方案所述技术可获得一致性高且重复性极佳的结果。该方法比复合肌肉动作电位（CMAP）能更早地区分肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者与健康对照者，且操作快速简便¹³。这表明该方法可能适用于临床应用。

患者与健康对照组比较：共对22例患者和20名健康受试者进行了168次MScan记录，每位受试者由两名不同观察者各进行两次记录。患者的运动单元中位数（32.4，范围：1 - 123.5）显著低于健康对照组（111.1，范围：71.75 - 166.8），p = 1.2 × 10^-6。

讨论

方案中的关键步骤：MScan 是一种高度自动化的操作流程，但与所有肌电图方法一样，需谨慎操作以获得一致的结果。在准备阶段，必须确保受试者充分放松，因为在复合肌肉动作电位（CMAP）扫描期间，自发性活动或运动伪迹会引入 CMAP 中的虚假变异，干扰初步模型的建立。

修改与故障排除：我们发现，将手指进行固定，并使用听觉肌电图反馈来帮助找到最佳的肢体位置，有助于避免某些变异。

该技术的局限性：由于CMAP扫描的采样点数量有限，以及反应和建模具有随机性，因此每次对同一记录进行分析后，无法期望得到完全相同的运动单元数量。即使在理想的记录条件下，MUNE值也难免存在约7%的绝对误差¹⁶。使用快速拟合程序时，结果的这种不确定性是不可避免的。MScan的另一个局限性在于其不适用于股四头肌和三角肌等近端肌肉。迄今为止，仅在拇短展肌中进行了应用¹³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QtracW 软件	Digitimer Ltd（版权归属：伦敦大学学院神经病学研究所）	QtracW
MScanFit	Digitimer Ltd（版权归属：伦敦大学学院神经病学研究所）	QtracW
DS5 双极刺激器	Digitimer Ltd	DS5
D440 放大器	Digitimer Ltd	D440-2（双通道）或 D440-4（四通道）
HumBug 噪声消除器	Digitimer Ltd	Humbug
模数转换（A/D）板卡	National Instruments	NI-6221