大鼠双侧髌腱损伤模型中干细胞疗法的评估

摘要

本文描述了利用大鼠双侧髌腱缺损模型制备并评估脐带基质来源的间充质干细胞球体的方法。该模型具有可接受的发病率，并能够检测未治疗与治疗肌腱之间的差异，以及所测试的两种治疗方法之间的差异。

摘要

再生医学为传统治疗方法难以应对的疾病提供了新的替代方案。跨物种肌腱病的高发病率和致残性，加之该组织自身有限的愈合能力，促使人们探索细胞治疗策略，并推动了用于评估其疗效的实验模型的发展。脐带基质来源的间充质干细胞（UCM-MSC）是极具吸引力的候选细胞，因其来源丰富、易于采集、避免了伦理争议和畸胎瘤形成风险，且相较于成体组织来源的间充质干细胞，更接近原始胚胎干细胞。壳聚糖通过促进间充质干细胞形成球状体以增强其生物学特性，已引起广泛关注。本文详细描述了分离UCM-MSC、在壳聚糖膜上制备细胞球状体以及分析球状体形成对表面标志物表达影响的技术方法。随后，介绍了建立大鼠双侧髌腱损伤模型的方法，用于 体内 在壳聚糖膜上形成的脐带间充质干细胞球体的植入。研究中未观察到与发病率、应激升高效应或组织感染相关的并发症。术后7天，手术大鼠的总功能评分低于正常大鼠，但在术后28天恢复至正常水平。组织愈合的组织学评分显示，术后7天治疗缺损处存在血凝块，无异物反应；术后28天显示愈合进展良好。该双侧髌腱缺损模型通过在每只大鼠体内建立内部对照，控制了个体间差异，具有可接受的发病率，并能够检测未治疗肌腱与不同治疗之间的差异。

引言

肌腱损伤是跨物种导致显著疼痛和肌肉萎缩的最常见原因之一¹。在兽医学中，马的肌腱和韧带损伤尤为受到关注，因为赛马所有损伤中有82%涉及肌肉骨骼系统，其中46%影响肌腱和韧带^2,3。瘢痕组织的形成会影响愈合后肌腱的生物力学特性，这也解释了屈肌腱损伤后恢复运动功能的预后较差；在接受保守治疗的马匹中，高达67%在两年内发生再次损伤⁴。再生医学为这一传统治疗方法难以应对的病症提供了新的替代方案。自体干细胞治疗已取得一些令人鼓舞的结果^5,6，但其应用受限于组织采集带来的并发症、细胞处理与重编程导致的治疗延迟，以及患者健康状况（如年龄）对干细胞特性的影响^7,8。这些局限性促使人们探索异体干细胞作为即用型治疗手段的可行性。来源于胎儿附属结构的细胞是颇具吸引力的候选来源，因其避免了胚胎干细胞相关的伦理争议及畸胎瘤形成风险。在胎儿附属结构中，脐带基质（UCM），又称华通胶（Wharton's Jelly），资源丰富且易于采集。

无论细胞来源如何，增强干性....

方案

本文所述所有方法均已获得西部健康科学大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 从马脐带基质中分离和扩增间充质干细胞

1. 在观察到母马（怀孕）分娩后，无菌地从胎盘中分离脐带，并将脐带置于含1%青霉素-链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C保存并转移至处理场所。
2. 在50 mL离心管中，用室温下含1% P/S的PBS清洗脐带两次。在150 mm培养皿上将脐带切成约5 cm长的片段，再用含1% P/S的室温PBS在50 mL离心管中清洗两到三次，直至大部分血液被冲洗干净。
3. 沿纵轴切开脐带以暴露血管。使用镊子和剪刀将脐带中的两条动脉、一条静脉以及尿囊 stalk 移除。用手术刀刮取围绕血管的胶状基质（即华通胶，Wharton's Jelly），收集至150 mm培养皿中，并将其切碎成细小组织块。
4. 取2–3段脐带片段中的华通胶（约12–15 g）放入50 mL离心管中，加入15 mL含0.1%（w/v）I型胶原酶A的PBS溶液。于37 °C轻柔振荡孵育3–4小时，直至组织完全消化溶解。
5. 将消化后的组织在300 × g条件下离心15分钟，吸除上清液。用15 mL含1% P/S的室温PBS重悬组织，通过移液混匀后，在150 × g条件下离心5分钟，吸除上清液（洗涤步骤）。重复洗涤两次。
6. 将洗涤后的细胞用含1% P/S的室温PBS重悬，移液混匀....

结果

本研究中，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。细胞来源于6匹母马的脐带，采用Friedman检验（一种用于重复测量的非参数方差分析）比较标准培养条件与壳聚糖诱导条件下各细胞系表达每种细胞表面标志物的百分比。为建立肌腱缺损模型，术后7天评估使用8只大鼠，术后28天评估使用12只大鼠。功能学结果以均值 ± 均值标准误（SEM）表示，并采用t检验进行比较。选择脐带基质（UCM）作为细胞来源，因其来源丰富、采集方便，且增殖能力优于其他胎儿附属组织来源⁴⁰。在标准培养皿中培养的UCM来源细胞在整个扩增过程中保持成纤维细胞样形态。当在壳聚糖培养皿中培养时，细胞形成球状体（图8）。

在标准培养条件下，大多数细胞表达CD44（98.6 ± 1.62%）、CD90（88.7 ± 3.04%）和CD105（77.9 ± 6.84%），而CD34（0.07 ± 0.1.......

讨论

本研究选择马源细胞，是因为我们最终希望在马匹自然发生的腱病治疗中测试候选方案。实际上，马的肌腱损伤作为人类腱病的天然模型具有吸引力，这是因为马的浅表数字屈肌腱与人类的跟腱在生物学上具有相似性⁴¹。根据国际细胞治疗学会推荐的标准，我们选择了细胞表面标志物 CD44、CD90、CD105、CD34 和 MHC II 用于细胞的免疫表型分析⁴²。在最近的一项研究中，无论培养条件如何，eqUCM-MSCs 均表现为 CD44 阳性，CD34 和 MHC II 阴性；在标准条件下培养的细胞还表现为 CD90 和 CD105 阳性，因此符合间充质干细胞（MSCs）在表面标志物表达方面的鉴定标准。此外，本研究首次报道了当 eqUCM-MSCs 在壳聚糖薄膜上培养时可形成细胞球体，这一结果也印证了既往关于人源 MSCs 的研究发现^19,20。三维细胞培养技术数十年来已被广泛研究，旨在构建一个类似于生理微环境的培养体系。本研究显示，三维培养条件.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS 10x	Hyclone	SH30258.01	耗材
胶原酶 IA 型	Worthington	LS004197	耗材
DMEM 低糖培养基	Hyclone	SH30021.FS	耗材
胎牛血清	Hyclone	SH30910.03	耗材
青霉素/链霉素 100x	Hyclone	SV30010	耗材
0.25% 胰蛋白酶	Hyclone	SH30042.01	耗材
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	耗材
台盼蓝	Hyclone	SV30084.01	耗材
二甲基亚砜	Sigma	D2650	耗材
壳聚糖	Sigma	C3646	耗材
氢氧化钠	Sigma	S8045	耗材
牛血清白蛋白	Hyclone	SH30574.01	耗材
圆底聚苯乙烯管	Corning	149591A	耗材
小鼠抗马 CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	耗材
小鼠抗大鼠 CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	耗材
小鼠抗马 MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	耗材
小鼠 IgG1 (FITC) - 同型对照	AbD serotec	MCA928F	耗材
小鼠单克隆抗体 [SN6] 抗 CD105 (FITC)	abcam	ab11415	耗材
小鼠 IgG1 (FITC) - 同型对照	abcam	ab91356	耗材
小鼠抗人 CD34 (FITC)	BD	BDB560942	耗材
小鼠 IgG1 κ (FITC)	BD	BDB555748	耗材
7-AAD	BD	BDB559925	耗材
BD Accuri C6 流式细胞仪	BD		设备
5 mL 真空采血管	Med Vet International	RED5.0	耗材
酸性枸橼酸葡萄糖溶液	Sigma	C3821	耗材
氯化钙	Sigma	C5670	耗材
七氟烷	JD Medical	60307-320-25	耗材
大鼠	Charles River	品系编号：400	实验动物
大鼠手术器械包	Harvard apparatus	728942	设备
15 号手术刀片	MEDLINE	MDS15115	耗材
大鼠用 Baytril（2 mg/片）， Rimadyl（2 mg/片）	Bio Serv	F06801	耗材
聚乙醇酸 910，5-0	Ethicon	J436G	耗材
伊红醇溶液（Shandon）	Thermo scientific	6766007	耗材
哈里斯苏木精	Thermo scientific	143907	耗材