邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

摘要

一种实验方案 体外 介绍了特异性结合邻苯二甲酸酯类化合物的DNA适配体的筛选与表征，并包含了所选适配体在电化学适体传感器中的应用。

摘要

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类主要的持久性有机污染物。由于同系物数量迅速增加，对PAEs进行基团特异性检测具有重要意义。DNA适配体 increasingly 被用作生物传感器平台中的识别元件，但针对高度疏水性小分子靶标（如PAEs）的适配体筛选报道较少。本研究描述了一种基于微珠的方法，用于筛选针对PAEs的基团特异性DNA适配体。通过合成带有氨基功能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH₂）作为锚定靶标，并将其固定在环氧活化的琼脂糖微珠上，使邻苯二甲酸酯基团暴露于固定化基质表面，从而实现对基团特异性结合分子的筛选。我们采用定量聚合酶链式反应结合磁性分离技术测定适配体候选序列的解离常数。通过竞争性实验测定适配体对其他PAEs的相对亲和力和选择性，该实验中，适配体候选序列首先与连接DBP-NH₂的磁性微珠结合，随后在与待测PAEs或其他潜在干扰物质孵育后释放至上清液中。由于该竞争性实验可简便地比较那些缺乏表面固定功能基团的PAEs之间的亲和力差异，因此被采用。最后，我们展示了电化学适配体传感器的构建，并将其用于对邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯的超灵敏和高选择性检测。本方案为其他疏水性小分子适配体的筛选提供了思路。

引言

随着经济的快速发展、工业化进程的加快以及城市建设的推进，环境污染问题比以往任何时候都更加严重。典型的环境污染物包括重金属离子、毒素、抗生素、农药、内分泌干扰物以及持久性有机污染物（POPs）。除金属离子和毒素外，其他污染物多为小分子，且通常包含多种同类物。例如，毒性最强的持久性有机污染物包括多氯联苯（PCBs）、多环芳烃（PAHs）、多溴联苯醚（PBDEs）、多氯二苯并二噁英（PCDDs）、多氯二苯并呋喃（PCDFs）以及邻苯二甲酸酯（PAEs）^1,2，这些物质均包含大量同类物。由于应用范围广泛，小分子的检测主要依赖色谱/质谱联用技术^3,4,5,6。对于现场检测，近年来已发展出基于抗体的检测方法^7,8,9。然而，由于这些方法对特定同类物具有高度特异性，往往需要进行多次检测。更为严重的是，新型同类物不断涌现，其相应抗体难以及时制备。因此，开发能够一次性检测所有同类物总含量的族特异....

方案

1. 文库与引物设计及合成

1. 设计初始文库和引物。
   文库（Pool₀）：5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
   正向引物（FP）：5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   磷酸化反向引物（PO₄-RP）：5'-PO₄-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
2. 采用标准亚磷酰胺化学方法合成 Pool₀、FP 和 PO₄-RP^18,19,20，并使用标准高效液相色谱法（HPLC）纯化所有 DNA²¹。
3. 将 Pool₀、FP 和 PO₄-RP 用无核酸酶级水重悬至 100 µM，分装后于 -20 或 -80 °C 保存，有效期可达一年。
   注意：建议将 Pool₀、FP 和 PO₄-RP 分装为 10–20 µL，以避免可能的交叉污染。

结果

我们设计并合成了氨基功能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH₂）作为锚定靶标（图1F）。随后，以DBP-NH₂为锚定靶标，采用经典的基于靶标固定的筛选方法，对邻苯二甲酸酯类（PAEs）进行DNA适配体筛选（图2）。在每一轮筛选中，均使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行预实验PCR，以优化PCR循环次数（图3）。强烈建议使用变性PAGE而非天然PAGE，因为我们及其他研究人员发现，在较高循环数下，天然凝胶上出现的疑似高分子量副产物，实际上是正确大小序列之间形成的交联复合物。因此，变性PAGE的条带强度才能真实反映正确产物的量。单链DNA的制备是另一个关键步骤，已有多种方法被报道²⁸。其中，λ外切酶消化法成本最低。该步骤是否成功可通过天然PAGE方便地检测：PCR产物在天然PAGE上表现为单一条带（SEL.......

讨论

适配体的一个显著优势在于，它们是通过体外筛选过程确定的 体外 方法SELEX，而抗体则通过 体内 免疫反应。因此，在精心设计的实验条件下，可筛选出具有理想靶标特异性的适配体，而抗体则受限于生理条件。

为了促进结合序列与游离序列的分离，近年来已报道了多种改进的SELEX技术，其中采用了毛细管电泳³⁰微流控技术³¹磁珠/丙烯酸珠/琼脂糖珠¹⁴, 等等。已采用微珠法等技术取代硝酸纤维素滤膜或亲和柱，以实现更高效的分离。在这些技术中，基于微珠的方法因其装置简单、操作便捷，且适用于小分子分析，已成为小分子靶标适配体筛选应用最广泛的技术。

目前常用于小分子靶标适配体筛选的方法分为两类：靶标固定化方法¹³和文库固定化方法¹⁴。在前一类方法中，小分子靶标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
UV-2550	Shimadzu，日本		方案，第 3.8.2 节
DNA Engine 热循环仪，PTC0200	BIO-RAD		第 3.5.1.2 节和第 3.5.2 节
C1000 Touch	BIO-RAD		第 5.3.6 节和第 6.3 节
VMP3 多通道恒电位仪	Bio-Logic Science，Claix，法国		第 7.4、7.8 和 7.11 节
Epoxy-activated Sepharose 6B	GE Healthcare（Piscataway，NJ，美国）	10220020	琼脂糖微珠，第 2.3 和 3.3 节
Dynabeads M-270 羧酸磁珠	Invitrogen，美国	420420	磁珠，第 5.2 和 5.3 节
Premix Taq Hot Start Version	Takara，大连，中国	R028A	DNA 聚合酶，第 3.5.1.1 节
PARAFILM 密封膜	Bemis，美国	PM-996	第 3.6.5 节
Lambda 外切酶	Invitrogen，美国	EN0561	第 3.7.1.2 节。供应商提供 ×10 反应缓冲液与 λ 外切酶。
Dr. GenTLE 沉淀载体	Takara，大连，中国	9094	第 3.6.2 节和第 3.8.1 节
UNIQ-10 PAGE DNA 回收试剂盒	Sangon Biotech（上海）	B511135	第 4.2 节
SYBR Gold 核酸凝胶染料	Invitrogen，美国	1811838	核酸染色剂，第 3.5.1.5 节
SYBR Premix Ex Taq II	Takara，大连，中国	RR820A	含 DNA 聚合酶和 dNTPs 的聚合酶混合液，第 5.3.5 节
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）	Sigma-Aldrich	CAS: 1132-61-2	第 5.2.1 节
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）	Invitrogen，美国	CAS: 25952-53-8	第 5.2.2 节
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	Sigma-Aldrich	6066-82-6	第 5.2.3 节
巯基己醇（MCH）	Sigma-Aldrich	CAS: 1633-78-9	第 7.7 节
金电极	上海辰华	CHI101	第 7.4 至 7.11 节
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）	Sigma-Aldrich	CAS: 51805-45-9	第 7.5 节
O-(2-巯基乙基)-O'-甲基-六(乙二醇)	Sigma-Aldrich	CAS: 651042-82-9	第 7.7 节
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）	中国计量科学研究院	CAS: 117-81-7	第 7.11 节
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS: 9005-64-5	聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS: 9002-93-1	非离子型表面活性剂
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	含 1 M NaCl 的 10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4