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方法文章

邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用

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DOI：

10.3791/56814

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2018年3月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

一种实验方案 体外 介绍了特异性结合邻苯二甲酸酯类化合物的DNA适配体的筛选与表征，并包含了所选适配体在电化学适体传感器中的应用。

摘要

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类主要的持久性有机污染物。由于同系物数量迅速增加，对PAEs进行基团特异性检测具有重要意义。DNA适配体 increasingly 被用作生物传感器平台中的识别元件，但针对高度疏水性小分子靶标（如PAEs）的适配体筛选报道较少。本研究描述了一种基于微珠的方法，用于筛选针对PAEs的基团特异性DNA适配体。通过合成带有氨基功能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH2）作为锚定靶标，并将其固定在环氧活化的琼脂糖微珠上，使邻苯二甲酸酯基团暴露于固定化基质表面，从而实现对基团特异性结合分子的筛选。我们采用定量聚合酶链式反应结合磁性分离技术测定适配体候选序列的解离常数。通过竞争性实验测定适配体对其他PAEs的相对亲和力和选择性，该实验中，适配体候选序列首先与连接DBP-NH2的磁性微珠结合，随后在与待测PAEs或其他潜在干扰物质孵育后释放至上清液中。由于该竞争性实验可简便地比较那些缺乏表面固定功能基团的PAEs之间的亲和力差异，因此被采用。最后，我们展示了电化学适配体传感器的构建，并将其用于对邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯的超灵敏和高选择性检测。本方案为其他疏水性小分子适配体的筛选提供了思路。

引言

随着经济的快速发展、工业化进程的加快以及城市建设的推进，环境污染问题比以往任何时候都更加严重。典型的环境污染物包括重金属离子、毒素、抗生素、农药、内分泌干扰物以及持久性有机污染物（POPs）。除金属离子和毒素外，其他污染物多为小分子，且通常包含多种同类物。例如，毒性最强的持久性有机污染物包括多氯联苯（PCBs）、多环芳烃（PAHs）、多溴联苯醚（PBDEs）、多氯二苯并二噁英（PCDDs）、多氯二苯并呋喃（PCDFs）以及邻苯二甲酸酯（PAEs）1,2，这些物质均包含大量同类物。由于应用范围广泛，小分子的检测主要依赖色谱/质谱联用技术3,4,5,6。对于现场检测，近年来已发展出基于抗体的检测方法7,8,9。然而，由于这些方法对特定同类物具有高度特异性，往往需要进行多次检测。更为严重的是，新型同类物不断涌现，其相应抗体难以及时制备。因此，开发能够一次性检测所有同类物总含量的族特异性生物传感器，可能为评估环境污染状况提供一种极为重要的量化指标。

近年来，核酸适配体因其能够识别多种目标物——从离子、小分子到蛋白质和细胞——而被广泛应用于各类生物传感平台中作为识别元件10,11,12. 通过以下方式鉴定适体 体外 指数富集配体系统进化法（SELEX）13,14SELEX 起始于随机合成的单链寡核苷酸文库，其包含约 1014-1015 序列。随机文库的规模可确保RNA或DNA候选结构的多样性。典型的SELEX过程包含多轮富集，直至文库中富含对靶标具有高亲和力和特异性的序列。最终富集的文库随后进行测序，并测定其解离常数（Kd以及通过滤膜结合、亲和层析、表面等离子共振（SPR）等不同技术测定对潜在干扰物质的选择性， 等等.15

由于持久性有机污染物（POPs）的水溶性极差，且缺乏可用于表面固定的官能团，理论上针对POPs的适配体筛选具有较大难度。尽管SELEX技术的显著进展已加快了适配体的发现速度，但目前尚未见报道针对POPs的基团特异性适配体的筛选。迄今为止，仅鉴定出对特定同系物具有高特异性的多氯联苯（PCB）结合DNA适配体16。邻苯二甲酸酯类（PAEs）主要应用于聚氯乙烯材料中，可将聚氯乙烯由硬质塑料转变为弹性塑料，因而作为增塑剂使用。部分PAEs已被确认为内分泌干扰物，可对肝肾功能造成严重损害，降低男性精子活力，并可能导致精子形态异常以及睾丸癌17。目前尚未见报道针对PAEs的化合物特异性或基团特异性结合适配体。

本研究旨在提供一种代表性方案，用于筛选针对高度疏水性小分子（如典型持久性有机污染物PAEs）的基团特异性DNA适配体。我们还展示了所筛选适配体在环境污染物检测中的应用。该方案为其他疏水性小分子的适配体筛选提供了指导和参考。

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方案

1. 文库与引物设计及合成

  1. 设计初始文库和引物。
    文库（Pool0）：5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    正向引物（FP）：5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    磷酸化反向引物（PO4-RP）：5'-PO4-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. 采用标准亚磷酰胺化学方法合成 Pool0、FP 和 PO4-RP18,19,20，并使用标准高效液相色谱法（HPLC）纯化所有 DNA21。
  3. 将 Pool0、FP 和 PO4-RP 用无核酸酶级水重悬至 100 µM，分装后于 -20 或 -80 °C 保存，有效期可达一年。
    注意：建议将 Pool0、FP 和 PO4-RP 分装为 10–20 µL，以避免可能的交叉污染。

2. 合成锚定靶标并将其固定到环氧活化琼脂糖珠上

  1. 合成氨基官能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH2）作为锚定目标分子。
    注意：DBP-NH2 的合成与表征实验细节已在文献中有所描述22。
  2. 根据目标分子的溶解性，选择合适的介质配制锚定目标分子的储备溶液。本研究中，将 DBP-NH2 溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 100 mM 的储备溶液，并于 4 或 -20 °C 保存，有效期可达一年。
  3. 根据生产商提供的改良方案，将 DBP-NH2 固定到环氧活化的琼脂糖微球上。
    1. 称取 0.1 g 冻干的环氧活化琼脂糖微球粉末，悬浮于蒸馏水中。分多次加入共 20 mL 蒸馏水，洗涤 1 小时。随后用 0.2 M Na2CO3（pH 12）溶液洗涤介质。
      注意：加水后介质会立即发生溶胀。
    2. 将 DBP-NH2（46.7 mg，0.15 mmol）溶于 500 µL 偶联缓冲液（0.2 M Na2CO3 缓冲液）中。
    3. 将含有配体的偶联溶液与介质混合，于室温下以 5 rpm 转速振荡反应 48 小时。
    4. 依次使用 0.1 M 醋酸盐缓冲液（含 0.5 M NaCl，pH 4.5）和 0.2 M 碳酸盐缓冲液（含 0.5 M NaCl，pH 12）对产物进行洗涤，每个缓冲液各洗一次，共重复三个循环。最后用蒸馏水洗涤并重悬产物，定容至 500 µL。
    5. 将产物于 4 °C 保存，待用。
    6. 通过元素分析确认目标分子固定是否成功。

3. SELEX

  1. 在超纯水或无核酸酶级水中配制 500 mL PAE 结合缓冲液，含 20 mM Tris·HCl、100 mM NaCl、2 mM MgCl2，5 mM KCl，1 mM CaCl2，1% 聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯，以及 0.03% 非离子型表面活性剂（pH 7.9）。将缓冲液经无菌 0.22 µm 硝酸纤维素滤膜过滤后，于高于 20 °C 的环境中可保存数月。
    注意：在PAE结合缓冲液中，保持PAEs良好的分散状态至关重要。需要多种类型的表面活性剂以增强PAEs在水溶液中的溶解度。然而，应尽量减少表面活性剂的种类，以避免形成包裹PAE分子的表面活性剂胶束。非离子型表面活性剂在低于20 °C的温度下容易析出，因此缓冲液应储存在高于20 °C的环境中。
  2. 将10 µL的100 µM Pool稀释0（约10个的1.0 nmol）14-1015 在490 µL PAE结合缓冲液中进行序列反应。加热反应池0 将等分试样（5 × 100 µL）置于薄壁离心管中，于95 °C水浴中孵育10 min。将离心管置于冰上5 min，随后在室温（本研究中约为25 °C）孵育5 min。
  3. 第一轮筛选：文库的孵育0 和 DBP−NH2-包被的培养基
    1. 洗涤 200 µL DBP−NH2用 500 µL PAE 结合缓冲液将包被的培养基洗涤三次。混合 DBP−NH2-包被的培养基与Pool0 在室温下轻轻振荡孵育混合物1小时。
    2. 分离 DBP−NH2使用截留分子量为100 kDa的超滤管，通过超滤法从未结合的DNA中分离出与适配体结合的包被培养基。用500 µL PAE结合缓冲液洗涤培养基3次，每次在4 °C下以9,168× g离心10 min。
  4. 第一轮筛选：从DBP−NH洗脱适配体2-包被的培养基
    1. 向洗涤后的中等孔板中加入50 µL PAE结合缓冲液，于90 °C振荡加热9 min。
    2. 通过超滤收集含有洗脱DNA的上清液。重复此洗脱步骤三次，以回收更多结合的DNA。
  5. 第一轮筛选：PCR
    1. 小规模 PCR
      1. 进行小规模 PCR 反应23 （4 × 20 µL 分装）使用约15–30个循环。配制PCR反应24 如下：6.5 µL 无RNase水，每种引物（FP、PO）1 µL（10 µM）4-RP，各0.01 nmol）、1.5 µL 第3.4节洗脱的文库（或无RN酶水作为阴性对照），以及10 µL预混反应体系（包含dNTPs、热启动DNA聚合酶和2 × PCR反应缓冲液（20 mM Tris·HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl₂））2，pH 8.3。
      2. 使用PCR仪进行PCR扩增，程序设置如下：95 °C预变性1分钟，1个循环；95 °C变性30秒、56 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，30个循环；72 °C终延伸2分钟，1个循环；最后于4 °C保存。当仪器运行至第20个循环时th 在第15、20、25和30个循环的延伸步骤期间，按下暂停键，打开仪器盖，取出一个反应管，然后再次按下暂停键以继续PCR反应。
      3. 制备12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）25,26将4.8 g尿素、6 mL超纯水、1 mL 10 × 三羟甲基氨基甲烷/硼酸/乙二胺四乙酸（TBE）、3 mL 40%丙烯酰胺、10 µL四甲基乙二胺（TEMED）和100 µL 10%过硫酸铵（APS）依次混合。充分搅拌后，静置1.5–2 h，以确保凝胶完全凝固。
      4. 分析循环优化结果：取每种PCR产物1 µL，加入5 µL RNA上样缓冲液（62.5% 甲酰胺，0.4 M 甲醛，1.25×3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液，0.02% 焦油紫FF，0.02% 溴酚蓝）和4 µL 无RNase水；于95 °C加热10分钟，迅速置于冰上冷却至0 °C；室温孵育5分钟；将样品分别上样至12% 变性PAGE凝胶的5个独立加样孔中；在垂直电泳系统中，以1 × TBE缓冲液于170 V恒压电泳45分钟。
      5. 电泳结束后，将凝胶置于30 mL 1 × TBE缓冲液中，加入3 µL 1×核酸凝胶染料，染色10分钟，然后拍摄凝胶图像。
    2. 大规模PCR： 选择适当的循环次数，以在正确大小标记处产生最强条带，同时避免产生非特异性副产物。根据第3.5.1节确定的条件和适当的循环次数，进行大规模PCR反应（20 × 100 µL等份）。
      注意：最终可获得的单链文库总量与PCR的总体积成正比，而非与模板浓度成正比。通常，为获得1 nmol文库，单链文库池需要进行2 mL的PCR反应。PCR反应极为敏感，易受外源DNA污染。应采取措施降低污染风险，例如佩戴手套、使用灭菌枪头、避免向管内吐气，以及在离心前不得打开PCR管盖。
  6. 第一轮筛选：通过乙醇沉淀法纯化PCR产物。
    1. 将两管PCR混合液合并为一管（每管200 µL），对所有管重复此步骤。
    2. 向每管中加入15 µL醋酸钠溶液（3 M，pH 5.2）、4 µL DNA/RNA沉淀载体溶液以及2.5倍体积的预冷乙醇（-20 °C）。充分混匀。
      注意：DNA/RNA沉淀载体在乙醇沉淀实验中被广泛使用，可显著提高低浓度DNA/RNA的回收率。该载体不会干扰后续应用，如PCR和测序。
    3. 在 4 °C 条件下以 20,627 × g 离心 20 分钟，小心弃去上清液，保留白色沉淀。
    4. 向每管中加入400 µL预冷至-20 °C的70%乙醇溶液，洗涤沉淀。在4 °C条件下，以20,627 × g离心5 min，小心弃去上清液，保留白色沉淀。重复洗涤步骤两次。
    5. 打开管盖；刺穿密封膜；将乙醇在40 °C加热块上挥发，直至白色沉淀变为透明。将沉淀物于-20 °C保存。
      注意：纯化的PCR产物可在-20 °C保存。
  7. 第一轮筛选：单链DNA的制备（富集文库的生成）1通过λ外切酶反应消化磷酸化的反向链。
    1. 小规模λ外切酶反应
      1. 向一个含有第3.6节中纯化的PCR产物的离心管中加入100 µL无RNase的水。充分涡旋振荡该离心管，以完全溶解管中的沉淀物。
      2. 准备五个离心管，每管加入5 µL上述溶液、11 µL无RNase水和2 µL 10 ×反应缓冲液（670 mM甘氨酸-KOH，25 mM MgCl₂）2 ，每管加入0.1% (v/v) Triton X-100，pH 9.4。
      3. 分别向这些试管中加入 2 µL 水或含有 2 U、5 U、8 U 和 10 U λ 外切酶的稀释液。用移液器轻轻吹打充分混匀。10 × 反应缓冲液由 λ 外切酶供应商提供。
      4. 将试管在 37 °C 孵育 35 分钟，80 °C 孵育 15 分钟，然后置于 4 °C 保存。
      5. 制备12%非变性PAGE凝胶。按顺序加入6 mL超纯水、1 mL 10 × TBE、3 mL 40%丙烯酰胺、10 µL TEMED和100 µL 10% APS，充分混匀，室温静置60–90分钟，确保凝胶完全凝固。
      6. 通过将每个反应产物各取5 µL，与1 µL上样染料和4 µL无RNase水混合，将这些混合物分别加入12%非变性PAGE凝胶的5个独立加样孔中（150 V，电泳45 min），以分析反应结果。
        注意：也可在凝胶上加样20 bp的双链DNA ladders，但由于PCR产物的条带以及生成的单链文库在凝胶上均能清晰显现，因此可能无需加样。
        注意：λ外切酶反应具有优异的结构选择性。在λ外切酶存在下，双链PCR产物（反义链5'端标记有磷酸基团）可在较宽的浓度范围内被完全消化为单链文库图4λ外切酶在小规模反应中能够完全生成单链DNA的最低用量同样适用于大规模反应。也可使用更高浓度的λ外切酶，因为该酶在较宽的浓度范围内均能保持良好的结构选择性和产物得率。高浓度盐会抑制λ外切酶反应。PCR产物消化不完全通常表明其中含有过多盐分。通过乙醇沉淀法（第3.6节）纯化的PCR产物通常适用于此步骤，而经异丙醇沉淀法纯化的PCR产物则常常残留过多盐分。
    2. 大规模λ外切酶反应： 选择能够完全生成单链DNA的λ外切酶的最小用量，用于大规模λ外切酶反应。根据此条件按比例放大反应体系。例如：若所需λ外切酶的最小用量为2 U，则加入38 µL无RNase水、10 µL 10×缓冲液和50 µL DNA文库1 2 µL 的 10 U/µL λ 外切酶。
  8. 第一轮筛选： 单链文库的纯化1 通过乙醇沉淀法。
    1. 按照步骤 3.6 的说明进行操作。
    2. 测定纯化池的浓度1 通过260 nm处的紫外吸收测定。
    3. 重悬90%纯化的样品池1 在适量的PAE结合缓冲液中。如果获得的DNA量不足以进行下一轮筛选，则重复步骤3.5–3.8.2。
      注意：PAE 结合缓冲液的体积通常根据文库的量以及下一轮 SELEX 中文库所需的最终浓度，介于 200 至 500 µL 之间。
  9. 第二、第三、第四和第五轮SELEX。
    1. 按照上述步骤（第3.2–3.8节）依次进行第二、第三、第四和第五轮SELEX，唯一不同的是输入约300 pmol文库以提高筛选严格性。
    2. 为尽量减少DNA在介质上的非特异性吸附，在第三轮和第四轮筛选中，于与DBP−NH孵育前，将文库在未修饰的培养基中置于旋转摇床上孵育30分钟。2-包被的培养基
      注意：由于大量高分子量产物未能进入凝胶，显示出DNA之间存在严重交联，SELEX过程在第五轮结束。

4. 高通量测序

  1. 使用兼容引物通过PCR扩增，将第3.9.2节中的Pool4制备用于测序。
    1. 设计并合成带有索引的正向引物，在5′端包含6个核苷酸，以促进序列分析。
      索引正向引物（FP-测序）：5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. 按如下方式配制1,000 µL PCR反应体系：380 µL无RNase的水，每种10 µM引物（FP-测序、PO4-RP，各0.5 nmol）50 µL，第3.9.2节洗脱的文库20 µL，以及含dNTPs、热启动聚合酶和2× PCR反应缓冲液的预混反应液500 µL。将混合物分装至10个PCR管中。采用与第3.5.1.2节所述相同的PCR反应条件。
  2. 纯化PCR产物，使其满足测序机构的要求。例如，按照制造商说明书使用PAGE凝胶DNA回收试剂盒。
  3. 将纯化的PCR产物（约2 µg）按照测序机构要求的运输条件送至测序机构。例如，将PCR产物置于离心管中，管盖用封口膜密封，并加冰袋运输至测序机构。
    注意：收到测序结果后，根据每条序列的拷贝数进行排序，以评估测序文库的富集情况。其中丰度最高的序列被命名为DBP-1（5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'）。其亲和力与选择性通过以下方案（第5和第6节）进行测定。其在电化学生物传感中的应用随后在第7节中进行了展示。

5. 使用磁珠定量 PCR（qPCR）测定选定适配体候选物的解离常数（Kd）

  1. 使用标准的亚磷酰胺化学方法合成 DBP-1-qPCR 及引物，并通过标准 HPLC 方法进行纯化。
    适配体候选序列 (DBP-1-qPCR)：5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    qPCR 正向引物 (FP-qPCR)：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    qPCR 反向引物 (RP-qPCR)：5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    注：测试序列的引物区域与第 3 节中使用的 pool0 不同。更改引物区域的目的是单独测试核心序列的亲和力，排除引物区域的影响。
  2. 按照制造商说明书将 DBP-NH2 固定到羧基修饰的磁珠上。
    1. 用 25 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) (pH 5.0) 洗涤羧基修饰的磁珠两次，每次使用从管中移取的等体积磁珠（100 µL），在充分混匀（翻转混匀或类似方式）条件下孵育 10 分钟。
    2. 使用前立即用冷的 25 mM MES (pH 5.0) 配制 50 mg/mL 的 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 溶液。
    3. 使用前立即用冷的 25 mM MES (pH 5.0) 配制 50 mg/mL 的 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 溶液。
    4. 将 100 µL EDC 溶液和 100 µL NHS 溶液与洗涤后的磁珠混合，在室温下缓慢倾斜旋转孵育 30 分钟。
    5. 孵育后将管子置于磁力架上静置 4 分钟，弃去上清液，并用 100 µL 冷的 25 mM MES (pH 5.0) 洗涤磁珠两次。
    6. 将 6 µL 100 mM DBP-NH2 储存液与 25 mM MES (pH 5.0, 290 µL) 加入活化的磁珠中，在 5 rpm 的缓慢倾斜旋转条件下，于室温孵育至少 30 分钟，或在 4 °C 孵育 2 小时。
    7. 孵育后将管子置于磁力架上静置 4 分钟，弃去上清液。用 200 µL PAE 结合缓冲液洗涤磁珠 4 次，重悬磁珠后于 4 °C 保存备用。
  3. 收集滴定曲线以测定 Kd 值。
    1. 在 PAE 结合缓冲液中配制一系列不同浓度的 DBP-1 溶液（500 µL），浓度范围为 1 pM 至 300 nM。
    2. 向每份 DBP-1 溶液中加入 10 µL 第 5.2.7 节所述的 DBP-NH2 包被磁珠，在室温下旋转孵育 1 小时。
    3. 将管子置于磁力架上静置 4 分钟，移除上清液，并用 200 µL PAE 结合缓冲液洗涤磁珠 4 次。
    4. 向每根管中加入 60 µL PAE 结合缓冲液，在 95 °C 孵育 15 分钟。通过磁分离收集含有洗脱 DBP-1 的上清液。重复此洗脱步骤以回收更多结合的 DBP-1。
    5. 将洗脱液稀释 100 倍，取 3 µL 进行实时 qPCR。qPCR 反应体系如下：3 µL 无 RNase 水，2 µL 各 10 µM 引物（FP、PO4-RP，各 0.01 nmol），3 µL 洗脱并稀释后的 DBP-1，以及 10 µL 含 dNTPs、聚合酶和 2× PCR 反应缓冲液的预混反应液。
    6. 使用热循环仪进行 qPCR，程序设置如下：95 °C 1 个循环，30 秒；30 个循环 [95 °C，30 秒；45 °C，30 秒；72 °C，30 秒]；72 °C 1 个循环，30 秒，然后保持在 4 °C。
    7. 绘制滴定曲线，并通过非线性拟合（假设 1:1 结合比例）确定 Kd 值27。

6. 通过竞争性实验进行相对亲和力与特异性检测

  1. 加入10 µL DBP-NH2将包被的磁珠加入DBP-1溶液（500 µL，1 µM）中，室温下旋转孵育1小时。将离心管置于磁架上静置4分钟，吸除上清液。用200 µL PAE结合缓冲液洗涤磁珠4次，最后将磁珠重悬于10 µL PAE结合缓冲液中。
  2. 加入10 µL的DBP-NH2- 将涂有介质的DBP-1与每种10 µM测试样品（DBP-NH）各110 µL结合2，DBP，DEHP，邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP），重金属离子， 等等室温孵育1小时。通过磁分离收集上清液。
  3. 将上清液稀释100倍，取3 µL用于qPCR定量。qPCR反应体系设置如下：3 µL无RN酶水，2 µL 10 µM的各引物（FP，PO）4-RP，各0.01 nmol）、3 µL洗脱并稀释的DBP-1，以及含dNTPs、聚合酶和2 × PCR反应缓冲液的预混反应体系10 µL。
  4. 使用配备以下程序的热循环仪进行qPCR，测定各样本中DBP-1的数量：95 °C预变性30 s，1个循环；95 °C变性30 s、45 °C退火30 s、72 °C延伸30 s，30个循环；72 °C终延伸30 s，1个循环；最后于4 °C保存。
  5. 通过将样品存在时从磁珠释放的DBP-1数量除以PAE结合缓冲液中从磁珠释放的DBP-1数量，计算相对亲和力：相对亲和力 = N样本/无内容/缓冲液.

7. DEHP 电化学生物传感器的制备与电化学测量

  1. 使用标准的亚磷酰胺化学方法合成巯基化核心序列（HS-DBP-1）和信号探针（DBP-1-C-Fc），并通过标准高效液相色谱法（HPLC）进行纯化。
    HS-DBP-1: 5'- HS-(CH2)6-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3'
    DBP-1-C-Fc：5'-GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc-3'
    注意：传感器探针的理性设计已在我们之前的出版物中描述18,22.
  2. 将HS-DBP-1和DBP-1-C-Fc用无核酸酶级水重悬至100 µM，分装后于-20或-80 °C保存，可稳定保存长达一年。
  3. 用 1、0.3 和 0.05 µm 的 Al₂O₃ 对金电极进行仔细抛光，直至形成镜面表面2O3 在微型布上研磨5分钟，然后在超纯水中超声处理5分钟，以去除残留的Al2O3然后通过电化学抛光清洁电极，以相对于Hg-Hg的0.4至+1.2 V电位范围内连续进行35次循环伏安法（CV）扫描。2SO4) 加入 0.5 M H2SO4 在 100 mV/s 时。
  4. 在含有1 M NaCl、pH 7.4的100 µL 10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制0.5 µM HS-DBP-1与0.5 µM DBP-1-C-Fc的混合物。将混合物置于薄壁离心管中，在95 °C水浴中加热10分钟，随后缓慢冷却至室温。
  5. 加入1 µL三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP，10 mM，储存液）至混合物中，室温孵育1小时。
  6. 将洁净的金电极浸入上述溶液中，室温下静置12小时或过夜。
  7. 用 PBS 冲洗电极，并将电极浸入 1 mM [S(CH2)2（OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-EG6-OMe) 在 PBS 中孵育 1 小时。用 PAE 结合缓冲液充分冲洗电极，并将电极浸入 PAE 结合缓冲液中。
  8. 在无靶标的PAE结合缓冲液中采集方波伏安法（SWV）背景扫描图谱。
    1. 清洁所有实验设备：电解池、金工作电极、铂对电极和饱和甘汞参比电极（SCE）。
    2. 激活已安装的软件；设置用于SWV测量的实验参数。
      注意：以下实验参数用于SWV实验：电位范围：-0.2 至 0.7 V；调制幅度：25 mV；脉冲宽度：5 ms；扫描速率：50 mV/s；电位步长：1 mV。
    3. 将金工作电极、铂对电极和饱和甘汞电极（SCE）连接至电化学工作站，并将这三支电极插入含有PAE结合缓冲液的电解池中。
    4. 进行方波伏安法测量。
      注意：一旦开始方波伏安法（SWV）测量，计算机屏幕上将显示一条SWV曲线。扫描将持续重复，直至扫描曲线趋于稳定，且峰高或峰形不再发生明显变化。
  9. 将工作电极浸入含有一定浓度DEHP的PAE结合缓冲液中例如， 10 pM）中室温孵育30分钟。用PAE结合缓冲液充分冲洗电极，然后将电极浸入含有对电极和饱和甘汞电极（SCE）的PAE结合缓冲液中。在与第7.8节所述相同条件下采集SWV曲线。
  10. 重复步骤7.9，但DEHP的浓度不同（例如 100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 µM）依次增加。绘制滴定曲线。
  11. 特异性检测： 重复步骤7.3–7.9，但将含有DEHP的PAE结合缓冲液替换为含有目标浓度潜在干扰物质的PAE结合缓冲液。

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结果

我们设计并合成了氨基功能化的邻苯二甲酸二丁酯（DBP-NH2）作为锚定靶标（图1F）。随后，以DBP-NH2为锚定靶标，采用经典的基于靶标固定的筛选方法，对邻苯二甲酸酯类（PAEs）进行DNA适配体筛选（图2）。在每一轮筛选中，均使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行预实验PCR，以优化PCR循环次数（图3）。强烈建议使用变性PAGE而非天然PAGE，因为我们及其他研究人员发现，在较高循环数下，天然凝胶上出现的疑似高分子量副产物，实际上是正确大小序列之间形成的交联复合物。因此，变性PAGE的条带强度才能真实反映正确产物的量。单链DNA的制备是另一个关键步骤，已有多种方法被报道28。其中，λ外切酶消化法成本最低。该步骤是否成功可通过天然PAGE方便地检测：PCR产物在天然PAGE上表现为单一条带（SEL...

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讨论

适配体的一个显著优势在于，它们是通过体外筛选过程确定的 体外 方法SELEX，而抗体则通过 体内 免疫反应。因此，在精心设计的实验条件下，可筛选出具有理想靶标特异性的适配体，而抗体则受限于生理条件。

为了促进结合序列与游离序列的分离，近年来已报道了多种改进的SELEX技术，其中采用了毛细管电泳30微流控技术31磁珠/丙烯酸珠/琼脂糖珠14, 等等。已采用微珠法等技术取代硝酸纤维素滤膜或亲和柱，以实现更高效的分离。在这些技术中，基于微珠的方法因其装置简单、操作便捷，且适用于小分子分析，已成为小分子靶标适配体筛选应用最广泛的技术。

目前常用于小分子靶标适配体筛选的方法分为两类：靶标固定化方法13和文库固定化方法14。在前一类方法中，小分子靶标...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢国家自然科学基金（21675112）、北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ201710028027）以及首都师范大学燕京青年学者计划的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
UV-2550Shimadzu，日本方案，第 3.8.2 节
DNA Engine 热循环仪，PTC0200BIO-RAD第 3.5.1.2 节和第 3.5.2 节
C1000 TouchBIO-RAD第 5.3.6 节和第 6.3 节
VMP3 多通道恒电位仪Bio-Logic Science，Claix，法国第 7.4、7.8 和 7.11 节
Epoxy-activated Sepharose 6BGE Healthcare（Piscataway，NJ，美国）10220020琼脂糖微珠，第 2.3 和 3.3 节
Dynabeads M-270 羧酸磁珠Invitrogen，美国420420磁珠，第 5.2 和 5.3 节
Premix Taq Hot Start VersionTakara，大连，中国R028ADNA 聚合酶，第 3.5.1.1 节
PARAFILM 密封膜Bemis，美国PM-996第 3.6.5 节
Lambda 外切酶Invitrogen，美国EN0561第 3.7.1.2 节。供应商提供 ×10 反应缓冲液与 λ 外切酶。
Dr. GenTLE
沉淀载体		Takara，大连，中国9094第 3.6.2 节和第 3.8.1 节
UNIQ-10 PAGE DNA 回收试剂盒Sangon Biotech（上海）B511135第 4.2 节
SYBR Gold 核酸凝胶染料Invitrogen，美国1811838核酸染色剂，第 3.5.1.5 节
SYBR Premix Ex Taq IITakara，大连，中国RR820A含 DNA 聚合酶和 dNTPs 的聚合酶混合液，第 5.3.5 节
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2第 5.2.1 节
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）Invitrogen，美国CAS: 25952-53-8第 5.2.2 节
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）Sigma-Aldrich6066-82-6第 5.2.3 节
巯基己醇（MCH）Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9第 7.7 节
金电极上海辰华CHI101第 7.4 至 7.11 节
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9第 7.5 节
O-(2-巯基乙基)-O'-甲基-六(乙二醇)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9第 7.7 节
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）中国计量科学研究院CAS: 117-81-7第 7.11 节
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1非离子型表面活性剂
PBSSigma-AldrichP5368含 1 M NaCl 的 10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4

参考文献

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PCR 2
邻苯二甲酸酯结合DNA适配体的筛选、表征及其在电化学适体传感器中的应用
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