方法文章

动态和电泳光散射的 DNA-磁性颗粒结合分析

DOI：

10.3791/56815

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2017年11月9日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

本文内容

摘要

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该协议描述了磁性粒子的合成, 并通过动态和电泳光散射对其 DNA 结合特性进行了评价。该方法着重于监测粒子大小的变化, 它们的多和粒子表面的泽塔电位, 它们在 DNA 等材料的结合中起着重要作用。

摘要

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利用磁性微粒分离 DNA 是生物技术和分子生物学研究的一个重要领域。本协议描述了通过动态光散射 (dl) 和电泳光散射 () 对 DNA 磁粒子结合的评价。dl 的分析提供了关于粒子的物理化学性质的有价值的信息, 包括颗粒大小, 多, 和泽塔电位。后者描述了粒子的表面电荷, 它在 DNA 等材料的静电结合中起主要作用。在这里, 比较分析利用三化学修饰纳米微粒和微粒及其对 DNA 结合和洗脱的影响。研究了分枝亚、四乙基硅酸和 (3-氨基丙氨) 烷的化学修饰。由于 dna 呈负电荷, 因此预期粒子表面的泽塔电位会随着 dna 的结合而减少。簇的形成也会影响粒子的大小。为了研究这些微粒在 dna 分离和洗脱中的效率, 在低 pH 值 (约 6)、高离子强度和脱水环境中, 颗粒与 dna 混合。粒子被用磁铁洗涤, 然后 DNA 被洗的三盐酸缓冲 (pH 值 = 8)。用定量聚合酶链反应 (PCR) 估计 DNA 拷贝数。对其电位、粒径、多和定量 PCR 数据进行了评价和比较。dl 是一种有洞察力和支持性的分析方法, 为 DNA 分离的微粒筛选过程增添了新的视角。

引言

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DNA 分离是分子生物学中最重要的步骤之一。核酸提取方法的发展对基因组学、基因、遗传学和转录等新兴领域产生了巨大的影响。有广泛的生物技术应用的 DNA 隔离, 包括医学 (法医/诊断工具和预后的生物标志), 和环境应用 (基因多样性, 病原体的流行, 和监测)。从不同的材料和不同的尺度, 如血液、尿液、土壤、木材和其他种类的样品, 对 DNA 进行纯化和分离的需求越来越大。1,2,3,4

纳米和微米粒子适用于 DNA 的分离, 因为它们的表面积很高, 特别是当它们可以被磁场固定时。颗粒的物理化学性质, 如大小或电荷, 会极大地影响它们对靶生物分子的束缚能力。5为了进一步增强生物分子的结合力和稳定粒子, 可以利用不同的化学修饰 (表面涂层)。根据共价键和价的相互作用, 对多种不同的结合策略进行分类。6粒子的大小直接影响其磁化特性, 而颗粒成分可以通过加入金属、合金或其他能影响其密度、孔隙度和表面的材料来定制。7没有可靠的方法来测量小颗粒的表面电荷。相反, 在滑移面上的电势 (离纳米颗....

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方案

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1. 磁性纳米粒子合成

  1. 用柠檬酸稳定的磁性纳米粒子合成 (MNPs)
    1. 添加20摩尔 FeCl 3 和 #8729; 6H 2 O (5.406 g) 和10摩尔 FeCl 2 和 #8729; 4H 2 O (1.988 g) 在20毫升的氧双蒸馏水 (ddd 水)。使用机械搅拌器在烧杯中的 N 2 气氛中大力搅拌获得的溶液, 直至获得透明溶液为止.
    2. 在快速机械搅拌下, 添加150毫升的 1 M NH 4 OH, 使用下降漏斗下降 (如果需要, 采取1小时或以上)。在所有 NH 4 之后, 将解决方案转移到 screwable 容器中。在75和 #176 上拧紧容器和热溶液; C 为 30 min.
      警告: NH 4 OH 被归类为对环境具有腐蚀性和危险性.
      注: 准备 nh 4 oh 解决方案从高品位的 28% nh 4 oh 在水中使用氧水.
    3. 用磁铁收集黑色沉淀物, 用100毫升的 ddd 水冲洗。重复3次。加入50毫升的0.5 米柠檬酸三钠二水合物沉淀。把船拧紧.
      注: 使用柠檬酸三钠二水....

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结果

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利用本文所述的协议对磁性微粒进行化学合成和改性, 合成并分析了六磁性颗粒的 DNA 结合。分析的摘要显示在表 1中。通过比较水中的颗粒大小和结合溶液, 很清楚, 所有的粒子在结合溶液中聚集 2-22 倍的褶皱。在 DNA 存在下, 一些粒子进一步聚集到更多的褶皱;然而, 这与定量 PCR 检测到的 DNA 检索没有直接关联 (表 1)。对照与 DNA 中的粒子在三粒子中的明显下降, 比较了在对照组中的10测量值 (2 分钟间隔) 中的齐塔人电位;即: MNPs_APTES、MMPs_TEOS 和 MMPs_APTES (图 2)。随着时间的推移, 泽塔电位的趋势也被观察到, 在大多数情况下, 前三读数的变化是稳定的 (图 3)。DNA 暴露后的变化主要在基质金属蛋白酶中观察到 (图 2)。在对 DNA (表 1<.......

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讨论

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在这个协议中, 解释 DNA 与磁性粒子通过齐塔人的电位结合的理论原理是有问题的。该协议描述了磁性纳米微粒和微粒的合成和修饰。文中还介绍了制备 DNA 控制和结合液的方法。这里显示了两种筛选 DNA-粒子相互作用的策略: 定量 PCR 和 dl 方法。dl 提供了三指标的物理化学变化的粒子: 颗粒大小, 多指数和泽塔电位。颗粒大小的变化直接表明聚合或解体。多指数值描述了从分散 (指数和 #60; 0.05) 到高度分散 (索引和 #62; 0.7) 的系统中粒子种类的分布。泽塔电位可以根据表面电荷对粒子进行分类, 高度正粒子显示值大于 30 mv, 高负粒子显示值低于-30 mv。正如所预测的, 当粒子暴露在 DNA 中时, polycharged 磁性粒子在结合溶液中的泽塔电位相对降低。此规则的例外是 MNPs_TEOS。这些粒子的不同之处在于它们具有独特的高度负表面电荷 (图 2)。这表明离子强度在将粒子、DNA 和正离子结合在一起时起着重要的作用。另一方面, 粒子大小的变化可以表明在结合过程中 dna 粒子的沉淀/聚集的作用, 特别是在更长的 dna 链的存在。

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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捷克科学基金会 (项目 GA CR 17-12816S) 和 CEITEC 2020 (LQ1601) 的财政支持得到了极大的认可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化铁（III）六水合Sigma-Aldrich207926磁粒子合成
氯化铁（II）四水合Sigma-Aldrich380024磁粒子合成
铁（II）七水合Sigma-AldrichF8263磁粒子合成
丙酮Penta10060-11000磁粒子合成
柠檬酸钠二水合Sigma-AldrichW302600磁性粒子合成
正硅酸四乙Sigma-Aldrich131903磁性粒子合成
（3-氨丙基）三乙氧基硅烷Sigma-Aldrich440140磁性粒子合成
聚乙烯亚胺，支链，平均分子量 ~25,000Sigma-Aldrich408727磁粒子合成
氢氧化铵溶液Sigma-Aldrich221228-M 磁珠合成
乙醇Penta71250-11000磁粒子合成
硝酸钾Sigma-AldrichP6083磁粒子合成
氢氧化钾Sigma-Aldrich1.05012磁粒子合成
低分子量截止膜 （Mw=1 kDa）Spectrum labsG235063磁粒子合成
Overhead Stirrerwiteg Labortechnik GmbHDH.WOS01035磁粒子合成
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998磁珠合成
SonicatorBandelin795磁粒合成
品牌 UV 比色皿 microSigma-AldrichBR759200-100EA用于尺寸测量的比色皿
用于 UV-比色皿的品牌盖Sigma-AldrichBR759240-100EA用于尺寸测量的比色皿盖
折叠的毛细管 Zeta CellMalvernDTS1070用于 zeta 电位测量的比色皿
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600用于测量大小和 zeta 电位的设备
Infinite 200 PRO
NanoQuant 仪器		Tecan396 227 V1.0， 04-2010用于 DNA 浓度测量的设备
SYBR Green 定量 RT-PCR 试剂盒Sigma-AldrichQR0100PCR 试剂盒
Mastercycler pro S仪器Eppendorf6325 000.013热循环仪
MinElute 试剂盒Qiagen28004DNA 纯化试剂盒
乙酸钠Sigma-AldrichS7670DNA 结合
物 物 硫酸物 物 酯

参考文献

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  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al.

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标签

Zeta DNA PCR

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