通过动态光散射和电泳光散射分析DNA-磁性颗粒结合

摘要

本方案描述了磁性颗粒的合成及其通过动态光散射和电泳光散射评估其DNA结合特性的方法。该方法重点监测颗粒尺寸、多分散性以及颗粒表面的泽塔电位的变化，这些参数在DNA等物质的结合过程中起着关键作用。

摘要

利用磁性颗粒分离DNA是生物技术和分子生物学研究中具有重要意义的领域。本实验方案描述了通过动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）来评估DNA与磁性颗粒结合的方法。DLS分析可提供有关颗粒物的多种理化性质的重要信息，包括粒径、多分散性以及泽塔电位。其中泽塔电位描述了颗粒表面的电荷状态，对DNA等物质的静电结合起关键作用。本文通过比较分析三种不同化学修饰的纳米颗粒和微米颗粒，研究其对DNA结合与洗脱的影响。所考察的化学修饰包括支化聚乙烯亚胺、正硅酸四乙酯以及(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。由于DNA带有负电荷，预期其结合后颗粒表面的泽塔电位将降低，同时可能形成聚集体，从而影响颗粒尺寸。为评估这些颗粒在DNA分离与洗脱中的效率，实验中将颗粒与DNA在低pH（约6）、高离子强度及脱水环境中混合。随后在磁力作用下对颗粒进行洗涤，并用Tris-HCl缓冲液（pH = 8）洗脱DNA。采用定量聚合酶链式反应（PCR）估算DNA拷贝数。综合评估并比较泽塔电位、粒径、多分散性及定量PCR数据。DLS是一种具有洞察力的辅助分析方法，为筛选适用于DNA分离的颗粒提供了新的研究视角。

引言

DNA 提取是分子生物学中最基本的步骤之一。核酸提取方法的发展对基因组学、宏基因组学、表观遗传学和转录组学等新兴领域产生了重大影响。DNA 提取在生物技术中有广泛的应用，包括医学领域（法医学/诊断工具和预后生物标志物）以及环境领域（宏基因组生物多样性、病原体流行率和监测）。目前对从不同材料和不同规模的样本（如血液、尿液、土壤、木材及其他类型样本）中纯化和提取 DNA 的需求日益增加。^{1，2，3，4}

由于具有较大的比表面积，特别是能够通过磁场实现固定，纳米级和微米级颗粒适用于DNA的分离。颗粒的理化性质（如粒径或电荷）会显著影响其与目标生物分子的结合能力。⁵ 为了进一步增强生物分子的结合能力并稳定颗粒，可采用不同的化学修饰方法（表面包覆）。根据共价与非共价相互作用，目前已发展出多种多样的结合策略。⁶ 颗粒的尺寸直接影响其磁化特性，而颗粒的组成则可通过引入金属、合金或其他材料进行定制，从而影响其密度、孔隙率和表面性质。⁷ 目前尚无可靠方法直接测量小颗粒的表面电荷，取而代之的是测量滑动面....

方案

1. 磁性纳米颗粒的合成

1. 柠檬酸稳定的磁性纳米颗粒（MNPs）的合成
   1. 将 20 mmol 的 FeCl₃ ∙ 6H₂O（5.406 g）和 10 mmol 的 FeCl₂ ∙ 4H₂O（1.988 g）加入 20 mL 脱氧双蒸水（ddd 水）中。在烧杯中使用机械搅拌器在 N₂ 气氛下剧烈搅拌，直至得到透明溶液。
   2. 在快速机械搅拌下，使用滴液漏斗逐滴加入 150 mL 的 1 M NH₄OH（如需要，耗时 1 小时或更长时间）。待全部 NH₄OH 加入后，将溶液转移至可密封的容器中，密封容器，并在 75 °C 下加热 30 分钟。
      警告：NH₄OH 被归类为腐蚀性物质，对环境有害。
      注意：使用高纯度 28% NH₄OH 以脱氧水配制 NH₄OH 溶液。
   3. 使用磁铁收集黑色沉淀，并用 100 mL ddd 水洗涤。重复洗涤 3 次。向沉淀中加入 50 mL 的 0.5 M 三钠柠檬酸二水合物溶液。密封容器。
      注意：使用脱氧的三钠柠檬酸二水合物溶液。
   4. 通过超声处理（35 kHz，振幅 100%）重新分散沉淀，并在 80 °C 下加....

结果

根据本文所述的磁性颗粒化学合成与修饰方案，合成了六种磁性颗粒并分析其DNA结合能力。分析结果总结见表1。通过比较颗粒在水溶液和结合溶液中的粒径，明显可见所有颗粒在结合溶液中均发生聚集，聚集倍数为2至22倍。部分颗粒在DNA存在下进一步发生更高倍数的聚集；然而，这与通过定量PCR检测到的DNA回收量并无直接相关性（表1）。比较颗粒在对照组与含DNA条件下的zeta电位（约每2分钟测量一次，共10次），发现三种颗粒的zeta电位显著下降，分别为：MNPs_APTES、MMPs_TEOS和MMPs_APTES（图2）。还观察到zeta电位随时间变化的趋势，在大多数情况下，前三个读数存在波动，随后趋于稳定（图3）。暴露于DNA后的变化主要出现在MMPs中（图2）。若剔除颗粒接触DNA后前5分钟内的前三个读数，则标准偏差显著降低（

讨论

在本实验方案中，通过zeta电位解释DNA与磁性颗粒结合的理论原理受到质疑。该方案描述了磁性纳米颗粒和微米颗粒的合成与修饰方法，以及DNA对照和结合溶液的制备方法。文中展示了两种用于筛选DNA-颗粒相互作用的策略：定量PCR和动态光散射（DLS）方法。DLS可提供颗粒理化性质变化的三个指标：粒径、多分散指数和zeta电位。粒径变化直接反映颗粒的聚集或解离状态。多分散指数描述系统中颗粒种类的分布情况，从单分散（指数 < 0.05）到高度多分散（指数 > 0.7）。zeta电位可用于根据颗粒表面电荷进行分类，其中高度带正电的颗粒其值大于30 mV，高度带负电的颗粒其值小于-30 mV。正如预测，当颗粒暴露于DNA时，结合溶液中多电荷磁性颗粒的zeta电位相对降低。但MNPs_TEOS颗粒例外，这些颗粒的唯一区别在于其具有独特的高度负电表面电荷（图2）。这表明离子强度在维持颗粒、DNA和正离子之间的结合中发挥了重要作用。另一方面，粒径的变化可反映DNA-颗粒在结合过程中发生沉淀/聚集的作用，尤其是在存在较长DNA链的情况下更为明显。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
六水合三氯化铁	Sigma-Aldrich	207926	磁性颗粒合成
四水合二氯化铁	Sigma-Aldrich	380024	磁性颗粒合成
七水合硫酸亚铁	Sigma-Aldrich	F8263	磁性颗粒合成
丙酮	Penta	10060-11000	磁性颗粒合成
二水合柠檬酸钠	Sigma-Aldrich	W302600	磁性颗粒合成
正硅酸四乙酯	Sigma-Aldrich	131903	磁性颗粒合成
（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	440140	磁性颗粒合成
支化聚乙烯亚胺，平均分子量 ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	磁性颗粒合成
氢氧化铵溶液	Sigma-Aldrich	221228-M	磁性颗粒合成
乙醇	Penta	71250-11000	磁性颗粒合成
硝酸钾	Sigma-Aldrich	P6083	磁性颗粒合成
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	1.05012	磁性颗粒合成
低分子量截留膜（分子量=1 kDa）	Spectrum labs	G235063	磁性颗粒合成
顶置式搅拌器	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	磁性颗粒合成
水浴锅	Memmert GmbH + Co.	84198998	磁性颗粒合成
超声波破碎仪	Bandelin	795	磁性颗粒合成
BRAND UV 微量比色皿	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	粒径测量用比色皿
BRAND UV 微量比色皿盖	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	粒径测量用比色皿盖
折叠毛细管Zeta池	Malvern	DTS1070	Zeta电位测量用比色皿
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	粒径与Zeta电位测量设备
Infinite 200 PRO NanoQuant 仪器	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	DNA浓度测量设备
SYBR Green 定量RT-PCR试剂盒	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR试剂盒
Mastercycler pro S 仪器	Eppendorf	6325 000.013	PCR仪
MinElute 试剂盒	Qiagen	28004	DNA纯化试剂盒
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S7670	DNA结合