建立一种结构逼真的心肌细胞的有限元几何模型研究蜂窝结构在心肌系统生物学中的作用

摘要

该协议概述了一种新的方法, 以建立一个空间详细的有限元模型的细胞内体系结构的电子显微镜和共焦显微图像。通过对钙信号和生物能学的案例研究, 证明了这个空间细节模型的威力。

摘要

随着三维 (3D) 成像技术的出现, 如电子层析成像、串行块面扫描电子显微镜和共焦显微术, 科学界在亚微米上对大型数据集有前所未有的访问权。在健康和疾病中伴随心肌细胞功能变化的结构重塑的分辨率。然而, 这些数据集已被用于研究细胞结构重塑在心肌功能中的作用。本协议的目的是概述如何使用高分辨电子显微镜和共焦显微图像, 建立一个精确的心肌细胞有限元模型。一个详细和准确的细胞结构模型有很大的潜力, 提供新的洞察力的心肌生物学, 比单独的实验可以获得。这种方法的威力在于它能够从两种不同的心肌细胞超微结构成像模式中融合信息, 从而形成一个统一的、详细的心肌细胞模型。本协议概述了将成人雄性大鼠心肌细胞的电子层析成像和共焦显微图像整合的步骤 (名称为特定品种的白化大鼠), 以建立一个半小节有限元心肌模型。该过程生成一个3D 的有限元模型, 其中包含一个精确的, 高分辨率的描述 (35 nm 的顺序) 的分布线粒体, 肌原纤维和兰尼碱受体簇, 释放必要的钙的心肌细胞收缩从肌网状网络 (SR) 入肌原纤维和胞浆室。此处生成的模型不包含横向小管结构或肌网状网络的细节, 因此是心肌细胞的最小模型。然而, 该模型已经被应用于基于模拟的研究中的细胞结构在钙信号和线粒体生物能学的作用, 这是说明和讨论使用两个个案研究, 提出以下详细的协议。

引言

心脏的励磁收缩耦合 (ECC) 是指心肌细胞膜的电刺激与细胞在每次心跳过程中随后的机械收缩之间的重要而复杂的耦合。数学模型在发展对相互关联的生物化学过程的定量理解方面发挥了关键作用, 这些进程调节了动作电位¹、胞浆钙信号²、生物能^学3 以及随后的收缩力的产生。当其中一个或几个生化过程发生改变时, 这些模型也成功地预测了心跳的变化^4,5。心肌细胞的高度组织超微结构越来越被认为对正常收缩功能和整体心脏起着关键作用。事实上, 心脏超微结构成分的形态学和组织的变化与疾病条件的生物化学变化 (如肥厚⁶、心力衰竭⁷和糖尿病心肌病⁸) 平行发生。无论这些结构变化是轻微的, 适应性, 或病理反应变化的生物化学条件仍然很大程度上未知的⁹。生物学中形式和功能之间固有的紧密耦合意味着实验研究不能比结构重塑和心肌细胞功能之间的相关性提供更深的洞察力。新一代的数学模型可以将子细胞成分的结构组装, 连同经过研究的生物化学过程结合起来, 对关系进行全面、定量的理解是必要的。在心肌细胞的结构、生物化学和收缩力之间。该协议描述了可用于生成结构精确的心肌细胞有限元模型的方法, 可用于此类调查。

过去十年在3D 电子显微术¹⁰、共焦¹¹和超分辨率显微镜¹²上取得了重大进展, 为纳米尺度和微尺度组装提供了前所未有的高分辨率洞察力。心肌细胞的分胞成分。最近, 这些数据集被用来生成心肌细胞超微结构的计算模型^13,14,15,16。这些模型使用了一个已建立良好的工程模拟方法, 称为有限元方法¹⁷, 以创建有限元计算网格的生物化学过程和心肌收缩可以模拟。但是, 这些模型受显微镜方法可以在图像数据集中提供的分辨率和细节的限制。例如, 电子显微学可以生成纳米级的细胞结构细节, 但很难确定图像内的特定蛋白质, 这将是必要的创建模型。另一方面, 超分辨率光学显微术可以提供高对比度图像在分辨率上的 50 nm 的顺序只有一个选择少数分子成分的细胞。只有通过将互补信息与这些成像方式相结合, 才能切实地探索功能对结构变化的敏感性。相关光和电子显微术仍然不是一个常规的程序, 它仍然会受到限制, 只有有限数量的成分可能被染色在免疫荧光的观点, 并与电子显微镜的看法相关联。

此协议提供了一种新的方法¹⁸ , 使用统计方法¹⁹分析和计算保险丝光显微学信息关于离子通道的空间分布的电子显微镜信息在其他心脏超微结构成分, 如肌原纤维和线粒体。这产生了一个有限元模型, 可用于生物化学过程的生物物理模型, 以研究心肌细胞分胞组织对调节心肌细胞收缩的生物化学过程的作用。例如, 该协议可用于建立健康和链脲佐菌素诱导的糖尿病心肌细胞模型, 研究结构重塑对糖尿病动物模型中观察到的心肌细胞功能的影响⁸。该方法还说明了该方法的统计性质的另外一个优点: 该法能产生多实例的有限元几何, 它可以密切模仿实验观察到的细胞结构变化。

作为一项概述, 协议步骤包括: (一) 制备用于电子显微术的心脏组织, 生成具有足够分辨率和对比度的3D 图像;(二) 使用3D 电子显微重建和图像分析软件 (称为 IMOD²⁰) 重建和分割3D 图像栈, 从电子显微镜数据中提取;(iii) 使用 iso2mesh²¹生成使用分段数据作为输入的有限元网格;(iv) 利用新的算法和编码将离子通道的分布映射到有限元网格上。

在议定书内概述了每一步骤的方法的前提, 并在所附数字中提供了代表性的结果。概述了如何使用生成的空间详细模型来研究在 ECC 中钙的空间动力学, 以及线粒体生物能学。讨论了该议定书目前的一些局限性, 以及正在进行的新的发展, 以克服这些限制, 并进一步促进对细胞结构在心脏系统生物学中的作用的定量理解。还讨论了如何将这些方法推广到其他细胞类型的有限元模型中。

如果用户能够访问预先存在的电子显微图像栈, 则此协议的使用者可能跳过步骤1和步骤2的重建部分。有意与更有经验的电子 microscopists 合作获取其数据的用户可能希望与专家讨论和比较步骤1中的固定和染色程序, 以确定最佳的获取协议。

方案

这里所描述的所有方法都得到了奥克兰大学动物伦理委员会和加利福尼亚大学圣地亚哥机构动物护理和使用委员会的批准, 组织协议最初是在那里制定的。

1. 实验准备

1. 根据表 1, 在 pH 值为7.4 的情况下, 准备0.15 米和 0.3 m 钠常使用缓冲器的库存解决方案。
2. 使用表7.4 中列出的组件, 将戊二醛固定剂 (2% 多聚甲醛 (粉煤灰) + 2.5% 戊二醛 + 0.2% 单宁酸在0.15 米钠常使用缓冲液中 pH 1)。
   1. 将2克的粉煤灰粉溶于20毫升的蒸馏水中, 在60摄氏度的加热板上连续搅拌。
   2. 添加1米氢氧化钠溶液, 直到解决方案明确。
   3. 等到溶液的温度低于40摄氏度, 然后加入10毫升戊二醛和20毫升的0.3 米常使用钠。
   4. 加入0.2 克丹宁酸, 溶解于溶液中。
   5. 加入50毫升的0.15 米常使用钠。
   6. 储存三或四20毫升的固定在冰箱中的固定剂在4摄氏度, 或在冰上, 如果在同一天使用。
3. 根据表 1中的食谱, 准备 Tyrode 的 20 mM 23 butanedione 肟 (BDM) 的解决方案。
4. 在通风柜内构造一个 Langendorff 装置。
   1. 夹紧两个100毫升塑料注射器管到两个不同的反击立场, 大约70厘米高从立场基地。
   2. 使用3毫米内径油管和三路旋塞阀连接塑料注射器管和连接器管,如图1所示。
   3. 适合3毫米外径套管的底部连接器油管, 其中心脏将被绑在灌注固定。
5. 用 Tyrode 的溶液和固定液在37摄氏度填充注射器管。
   1. 通过通过注射器溶液, 去除油管内的气泡。

2. 获得心肌细胞超微结构的电子显微数据

1. 准备动物的心脏切除和化学固定。
   注意: 本协议详细介绍了处理成年男性的步骤 (名称为特定品种的白化大鼠) 大鼠心脏组织。当心脏组织来源于其他物种时, 该协议可能需要修改。
   1. 麻醉动物通过腹腔注射治疗大鼠 (体重200-250 克), 0.5 毫升 250 U/毫升肝素。等待10分钟, 然后治疗大鼠腹腔注射戊巴比妥 (210 毫克/千克体重)。
   2. 通过测试脚趾捏反射来确认适当的麻醉程度。
   3. 宫颈脱位弄死动物。
   4. 用解剖程序来收割心脏类似于以前发布的朱庇特文章^22,23, 然后将它放在冰冷的盐水中。
   5. 分离升主动脉和 cannulate。确保套管尖端位于半月阀的上方, 在那里冠状动脉分支关闭。将一根线紧紧地拴在上升的主动脉上。
   6. 将套管连接至重力驱动的 Langendorff 装置, 其操作在系统底座上方70厘米处 (图 1)。
   7. 拧 Langendorff 系统上的旋塞阀灌注心脏与 Tyrode 的解决方案, 包括20毫米 BDM (肌球蛋白抑制剂) 2-3 分钟。
   8. 拧旋塞阀开始灌注与固定剂2% 多聚甲醛, 2.5% 戊二醛, 0.2% 单宁酸在0.15 米钠常使用在37°c 10 分钟。如果成功, 心脏将变淡褐色并且变得僵硬和橡胶。
   9. 使用刀片, 解剖组织块从左心室 (侧) 游离壁和获得组织块约1毫米³大小。
   10. 将样品存放在冰上的同一固定剂的预冷20毫升闪烁瓶中, 2 小时, 在瓶中储存尽可能多的样品, 并确保样品在溶液中被淹没。
       注意: 在下面的100% 脱水步骤之后保持样品的冷是很重要的。
2. 电子显微镜样品的进一步固定和染色。
   1. 在玻璃烧杯中倒入100毫升的0.15 米常使用钠缓冲液, 在冰上冷却。
   2. 准备等量的4% 锇毒气和 0.3 M 钠常使用, 其次是添加0.08 克钾盐, 使一个重金属染色溶液含有2% 钾盐在2% 锇毒气和0.15 米钠常使用。在冰上冷却溶液。
   3. 将固定器取出, 用足够冷的 0.15 M 钠常使用缓冲液将其替换成瓶子中的浸泡样品。把瓶子放在冰上5分钟。
   4. 重复步骤2.2.3 四次, 0.15 米常使用钠去除多余的固定剂。
      注意: 不要使用玻璃吸管, 因为微小的碎片可以进入样品, 并可以破坏钻石刀在组织块切片。在将冰的所有解决方案添加到样品之前, 先冷却所有的溶液是很重要的。同样重要的是, 该样本始终保持在解决方案的所有时间 (很短的部分覆盖率持续不超过几秒钟, 可能会在解决方案交换期间短暂容忍)。在清洗或替换解决方案时, 在删除上一个解决方案后, 快速添加新解决方案。把闪烁的瓶子放在洗的冰间。请注意, 此步骤不是时间敏感, 如果需要, 组织块可以洗得稍长一些。
   5. 用冰冷重金属染色液取代常使用钠缓冲器, 并将其贮存在冰上过夜。用手摇动瓶子, 确保盐混合良好;解决方案应该变成黑色。
      注意: 在执行此步骤时, 在油烟机中工作, 因为锇是有毒的。
   6. 稀释4% 水中醋酸铀 (UA) 库存解决方案 (表 1) 到2% 使用相同数量的库存 UA 溶液和双蒸馏水, 并冷却到冰上。
   7. 用冰冷却0.15 米常使用钠代替重金属染色, 并让样品在冰上孵化5分钟。
   8. 重复步骤2.2.7 四次冰上冲洗任何过量的重金属染色溶液。
   9. 将样品冲洗四次, 在纯净水之间进行2分钟的等待期 (双蒸馏足够)。
   10. 用冰冷2% 取代纯净水, 让样品在冰上孵化60-120 分钟。
   11. 冷却五20毫升的乙醇 (足以淹没样品) 冰, 将用于脱水步骤。六瓶在蒸馏水中乙醇的百分比增加了: 20%、50%、70%、90% 和100%。
   12. 将纯丙酮倒入另一20毫升闪烁瓶中, 与乙醇瓶一起冷却在冰上。
   13. 在纯净水中冲洗样品四次, 用2分钟的时间在冰上洗涤过量的 UA。
3. 乙醇脱水样品。
   1. 冷乙醇系列脱水在样品瓶内连续更换溶液如下, 冰: 20% 乙醇为10分钟;50% 乙醇10分钟;70% 乙醇10分钟;90% 乙醇10分钟;然后两次在100% 乙醇10分钟。
   2. 转换样品到室温通过替换最后100% 乙醇与冷却的纯净的丙酮并且安置样品瓶在室温实验室长凳10分钟。
   3. 在室温下, 在纯丙酮中再进行10分钟的洗涤, 以去除瓶子内可见的凝结。在孵化时, 要组成丙酮/树脂溶液。
   4. 用50:50 纯丙酮和环氧树脂 (与制造商所说的环氧树脂元件的比例) 替换瓶中的纯丙酮。使用同一批次中的所有组件。将树脂填充的样品瓶放在转子上过夜。
4. 在树脂中嵌入样品。
   1. 用75% 树脂 (25% 丙酮) 代替50:50 树脂, 孵育3小时, 然后在室温下在100% 树脂中进一步孵化/浸润4小时。
   2. 用新鲜的100% 树脂取代100% 树脂, 并在一夜之间留下样品瓶, 以加深树脂进入组织样品的深度。
   3. 从瓶子里取出样品, 放在烤箱友好的容器里, 并放置一个平坦的底座;例如, 铝或银箔烘烤杯可用于此目的。
   4. 轻轻地倒 (以避免样品的位移) 新鲜树脂在样品 (因而嵌入样品在树脂) 和聚合树脂和样品在烤箱在60°c 为 48 h。
5. 将树脂块重新定向到剖面上的图像单元。
   1. 从树脂块中获得1µm 厚的测试部分, 使用 ultramicrotome 与玻璃刀来评估单元方向²⁴。
   2. 二十年代用1% 甲苯蓝和1% 硼砂染色厚的试验段。
   3. 在明亮的田野显微镜下检查肌肉细胞的方向。
   4. 根据从染色测试部分的图像推断出的方向, 重新定向纵向或斜向定向 (类似于图 2A) 树脂块, 以确保单元格暴露在玻璃刀上, 以便将其切割成剖面 (类似于图 2B)。
6. 图像组织切片使用电子层析成像。
   1. 使用菱形刀获得调整后的组织块的半薄部分 (~ 300 毫微米), 并将剖面转移到铜网格²⁵。
   2. 用 2% UA 和佐藤引线²⁵着色厚剖面。
   3. 在²⁵节的两侧应用胶体金粒子。
   4. 获取从-70 °到 +70 °²⁵的单个或双轴倾斜序列投影图像的集合。
7. 使用 IMOD²⁰重建3D 图像栈 (一系列2D 图像, 提供单个电子层析切片的3D 信息) 的单元格。此重建堆栈将在下一步骤中进行分段。

3. 从 EM 3D 图像数据集中分割肌原纤维和线粒体区域

1. 执行 IMOD 程序 "3dmod"。
2. 在3dmod 图形用户界面中, 输入包含该单元格的3D 重建图像数据集 (在步骤2.7 中生成) 到标记为 "图像文件:" 的输入框中的 ". rec" 或 ". mrc" 文件的地址, 然后按 "确定"。
3. 在 "文件" 菜单下, 选择 "新建模型", 然后使用适当的名称保存该文件, 方法是 "文件" 下的 "保存模型为"..。
   注意: IMOD 中的对象可以包含构成 "对象" 的分段组件的集合。默认情况下, 新模型包含 id 为 "#1" 的新对象。
4. 在 "特殊" 菜单下, 选择 "绘图工具"。这将打开一个类似于图 3A中所示的新工具栏。
   注意: 有几种工具可用于在不同的细胞器边界周围创建轮廓。有关如何使用这些工具的更多帮助, 请在 IMOD²⁰文档中找到。
5. 在 "绘图工具" 菜单中选择 "造型" 选项, 然后将鼠标移到图像窗口;将出现一个以鼠标指针为中心的圆形轮廓。
6. 通过在线粒体 (图像文件的较暗区域) 按住鼠标中键 (如图 3A中的绿色轮廓线分界所示), 将圆轮廓的周长拖到其边界的形状中。
7. 一旦轮廓的线粒体边界完成, 释放中间按钮和重复步骤3.6 为每个线粒体在数据。每个轮廓将自动被 IMOD 识别为一个新的轮廓在同一对象内。
8. 在 "编辑 |对象 "菜单中, 选择" 新建 "以创建新对象。这将自动递增一个对象的总数, 并将此数字分配给新对象。
9. 重复步骤3.6 和3.7 以分割和保存肌原纤维轮廓。
10. 重复步骤 3.8, 后跟步骤 3.6, 以分割单元格边界。
11. 将模型文件保存在 "文件" 菜单下。
12. 在命令行窗口中执行以下命令, 将每个对象分组转换为二进制掩码, 如图 4-c中所示。
    1. 从模型 "imodextract 对象 modelfile outputmodelfile" 中提取特定对象, 其中 "对象" 是要提取的对象的编号。
    2. 为该对象创建掩码: imodmop 掩码 255 outputmodelfile imagefile outputmask. mrc
    3. 将文件转换为 tif 堆栈: mrc2tif outputmask outputmask. tif

4. 从分段元件中创建有限元网格

1. Iso2mesh 是一个自由可用的 MATLAB 程序, 将 TIFF 图像栈转换为体积四面体有限元网格。从 iso2mesh.sourceforge.net 下载并添加 iso2mesh 到 MATLAB 路径。
2. 下载源代码和数据, 以模拟 RyR 集群在网格上从 github 网站 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator。
3. 启动 CardiacCellMeshGenerator MATLAB 应用程序 (图 5)。
4. 使用 GUI 左上角的三按钮将不同的细胞器组件掩码加载到 MATLAB 中。
5. 创建另一个二进制图像堆栈, 界定肌原纤维和线粒体之间的间隙,如图6A 所示。
   1. 打开 ImageJ。
   2. 使用文件 |打开对话框, 将肌原纤维和线粒体 tiff 堆栈加载到程序中。
   3. 通过选择 "过程 |" 来启动图像加法插件计算器加 "。
   4. 选择肌原纤维图像栈作为 i1, 将线粒体图像堆栈作为 i2, 并选择 "添加" 运算符。单击 "确定"。
   5. 在表示4.5.4 结果的新图像堆栈出现后, 选择 "编辑 |反转 "以生成类似图 6A的图像堆栈。
6. 通过推送 CardiacCellMeshGenerator 程序上的 "RyRGapsFile" 按钮, 加载包含肌原纤维和线粒体之间间隙的二进制图像栈的文件。
7. 在 GUI 上推送 "生成网格"。这将使用 "cgalmesh" 选项触发 iso2mesh 命令 v2m, 以生成与图 4E类似的四面体网格。在这个步骤的末尾将输出三个文件: 一个. 元器件文件、一个. 面文件和一个. 节点文件, 其中包含组成元素的节点列表、构成面孔的节点和节点的坐标。分别。

5. 将感兴趣的离子通道的空间变化密度数学映射到有限元网格上。

1. 通过按下标签生成 RyR 模拟器输入的 GUI, 为 RyR 模拟器生成必要的输入。
   注意: 该按钮将触发一个函数 generateRyRsimulatorInputs, 它使用步骤4中的以下信息生成输入:
   (1) outDir: RyR 集群模拟所必需的输出文件的位置。
   (2) imres: 图像栈三方向上的像素分辨率。
   (3) myofibril_file: 包含二进制图像堆栈的文件, 如图 4B所示。
   (4) sarcolemma_file: 包含二进制图像堆栈的文件, 如图 4A所示。
   (5) ryrgaps_file: 包含二进制图像堆栈的文件, 如图 5A所示。
   1. 执行此函数后, 检查是否在指定为 outDir 路径的目录中创建了以下文件:
   • d_axial_micron, 表示 z 盘位置与图像栈中像素的其余部分之间的轴向距离。
   • d_radial_micron, 表示从可能的 RyR 簇位置集合中的每个像素到 z 圆盘平面上的像素的欧氏距离 (不包括轴向分量)。
   • W_micron, 它代表 RyR 簇的所有可用位置的空间坐标列表。
   • 文件夹中的其余3个文件包含后缀 "_pixel", 而不是 "_micron", 表示这些文件中的值已以像素坐标形式写出。
2. 在肌原纤维的二进制图像栈上模拟 RyR 簇分布。
   1. 按下标签为 "打开 RyR 模拟器" 的按钮以启动 r 程序。
   2. 在 R gui 上, 选择 "文件 |打开 "并查找文件" 设置。R "在 RyR 模拟器封装 (RyR 模拟器/源/设置。R)。
   3. 同时打开文件 ryr 模拟器并行。R (位于 RyR-模拟器/源/RyR-模拟器-平行。R). 可以使用 Rstudio (https://www.rstudio.com) 或普通命令行界面等环境,例如使用 shell 或命令窗口中的 R64 命令。
   4. 更改设置中的参数。R 文件, 详情如下:
      1. 将 Path2 设置为包含5.1.2 中列出的文件的文件夹地址, 以获取 RyR 群集和肌原纤维的共焦图像堆栈。
         注意: github 存储库文件夹输入文件/主单元格/已包含为以前收集的图像堆栈生成的文件。
      2. 将 Path4 设置为存储步骤5.1.2 中生成的文件的文件夹地址。
      3. 将 Path3 点设置为用户希望保存模拟 RyR 群集位置的文件夹。
      4. 设置 N 到要在模型中模拟的 RyR 簇的数目 (通常在200到300的范围内)。
      5. 设置 etol, 一个公差设置, 为实验测量的 RyR 簇的空间分布和模型模拟空间分布的 RyR 簇的差异。
      6. 设置 numIter 以限制 RyR 模拟器在找到满足 etol 值的模拟 RyR 群集模式时所需的尝试次数。
         注意: etol 和 numIter 的值已设置为设置中的典型值。R 文件。
      7. 将 numPatterns 设置为用户要模拟的不同 RyR 群集模式的数量 (通常, 它是模拟99模式以统计置信度的有用实践)。
      8. 设置 numCores 以允许使用多个 CPU 线程 (内核), 以便用 R 更快地并行处理以模拟点模式。
   5. 请检查以下软件包是使用 R 中的软件包安装程序 gui 安装的: 雪、doSNOW、doparallel、foreach、迭代器和 rgl。
   6. 通过在 R 命令窗口中输入以下命令来执行模拟器: 源 (' ryr-模拟器的路径-并行。R ', chdir = TRUE)
      注: RyR 模拟器程序的输出是一个 .txt 文件列表 (将生成一个 numPatterns 文件), 其中包含 n 行和3列中的坐标列表, 代表 n 个模拟 RyR 簇的 x、y 和 z 坐标。
3. 用 CardiacCellMeshGenerator 将点作为空间密度映射到计算模型上。
   1. 通过选择标记为 "选择 RyR 点文件" 的按钮, 从 RyR 模拟器输出的 RyR 群集分发文本文件中选择一个模拟的。
   2. 在 MATLAB 中对 GUI 执行 "RyR 密度映射器"。这将将步骤5.3.1 中的模拟 RyR 簇的空间位置映射到在步骤4.8 中生成的有限元素网格中, 使用称为球面核强度估计方法²⁶的方法。
      注意: 此步骤的输出为 .txt 扩展名的文件, 其中包含每个计算网格节点上每个单位球面体积的离子通道的数值密度值列表。

结果

图 2通过图 7提供了本协议中几个关键步骤的代表性结果: (一) 可视化和重新定向组织块以进行横断面电子显微观察;(二) 生成3D 电子显微图像栈;(iii) 将亚细胞超微结构分割为感兴趣的器;(iv) 利用 iso2mesh 生成有限元网格;(v) 模拟 RyR 簇在网格上的真实分布;(vi) 接着将这一空间分布映射为计算网格上的空间密度。

图 2显示典型的明亮字段图像, 显示在纵向定向时单元格的显示方式 (图 2A、标记 L)、斜 (图 2A、标记 O) 和跨分段 (图 2B), 有关切割机。斜...

讨论

上述协议概述了生成一种新的心肌细胞超微结构有限元几何模型的关键步骤。该方法使不同显微学 (或原则上, 其他数据) 模式的计算融合, 形成了一个更全面的心肌细胞动力学计算模型, 其中包括空间单元结构的细节。目前还没有其他的协议可以创建这样一个心肌细胞模型。

步骤1概述了一个灌注固定的协议。或者, 心脏可以切除, 解剖成小块, 浸泡在固定体。然而, 这一过程必须迅速完成, 并可以有不同的结果, 取决于样品的大小。在作者的经验, 灌注确保彻底渗透的固定剂进入组织和细胞。作者也曾经用克雷布斯-Henseliet 溶液灌注心脏, 使心脏在固定前跳动。这使得在固定前的工作心脏测量。

步骤2中的电子显微处理步骤是电子层析成像的典型方法。当使用其他成像技术 (如串行块面扫描电子显微镜或聚焦的离子束显微镜²⁸) 时, 处理解决方案的数量, 特别是染色溶液和计时可能会有所不同。获得的电子显微图像必须分割成不同的细胞器官区域, 如线粒体, 肌原纤维和横管。这可以手动或自动化的方式进行。图像栈中的对比度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
氯化钠	Sigma-Aldrich	746398
氯化钙	Sigma-Aldrich	C8106
氯化镁	Sigma-Aldrich	M2393
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氯化	钾Sigma-Aldrich	P5405
葡萄糖	Sigma-Aldrich	D9434
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761
2,3-丁二酮一肟	Sigma-Aldrich	B0753
25% 戊二醛 EM 级（500 毫升瓶）	默克	354400-500ML
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
单宁酸	Sigma-Aldrich	403040-500G	100g EM级
二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich	C0250
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Sigma-Aldrich	P4593
四氧化锇	Sigma-Aldrich	75632-10ML	4%水溶液，5 ml瓶（或10 ml瓶）也可提供）
乙酸铀	EM Sciences	22400	25g 瓶
亚铁氰化钾	Merck Millipore	104973
甲苯蓝	Sigma-Aldrich	T3260
硼砂	Sigma-Aldrich	S9640	也称为硼酸钠
乙醇	Sigma-Aldrich	792780	稀释至不同百分比纯水
丙酮	EM Sciences	RT10017
树脂套件	EM Sciences	14040	ACM Durcupan 效果良好
盐酸	Sigma-Aldrich	H9892	1普通溶液
设备
超薄切片机	Leica	EM UC7
透射电子显微镜	ThermoFisher Scientific	Tecnai F30	http://www.leica-microsystems.com/
蒸馏架	Proscitech	T752
管	BioStrategy	75831-346	用于 langendorff 灌注仪，建议使用 3 mm 直径，但不是必需的
langendorff 管的旋塞阀 SDR QP13813;产品只是一个示例，用户可以选择任何
蒸煮架夹	Proscitech	T715
塑料注射器	SDR	QPC1108	用于朗格多夫器械上的溶液
插管丝缝合线，7-0	TeleFlex	15B051000	用于在朗格多夫器械上结扎心脏
套管			由3毫米外径的钢针制成
橡胶培养皿垫	Proscitech	H068	在固定心解剖过程中用作砧板
剃须刀片	Proscitech	L056	用于将固定心切割成小块，用于 EM 处理
玻璃瓶	BioStrategy	89000-236	用于在组织固定和处理过程中储存溶液 用于 EM
烧杯	BioStrategy	213-0477	用于临时和灌注
期间储存溶液闪烁瓶	BioStrategy	548-2170	用于 EM 处理过程中的组织样品
解剖套件	Proscitech	T161	用于动物解剖
注射器过滤器	Proscitech	WS3-02225S	用于净化乙酸铀酰
铝/银箔烤杯			来自任何烘焙产品商店
杜邦金刚石刀	BioStrategy	102680-780	35 度角版本可产生最佳切片。
胶体金	BBI 解决方案	EM.GC15	15 nm 胶体金
EM 网格	Proscitech	GCU150	可以测试各种尺寸： GCU150h、GCU200h 塑料
处理管道	Proscitech	LCH20	最好使用塑料一次性用品，尤其是在使用树脂时
软件
SerialEM	博尔德		断层扫描采集
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD	博尔德		图像对齐和分割
iso2mesh			可在 http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji 或类似的图像处理软件	ImageJ	Fiji 是 Just Image J	可在 https://fiji.sc 使用，用于处理二进制图像堆栈
RyR-Simulator 代码/数据	CellSMB 组		可在
CardiacCellMeshGenerator	CellSMB 组		在文件夹"gui-version"下提供 RyR-SimulatorR
-统计软件	R-project		从 https://www.r-project.org
spatstat	下载 R-project		通过 R 程序安装
rgl	R-project		通过 R 程序安装
并行	R-project		通过 R 程序安装
foreach	通过		R 程序安装
doSNOW	R-project		通过 R 程序迭代
器	R-project		通过 R 程序安装