本方案概述了一种利用电子显微镜和共聚焦显微镜图像构建心肌细胞细胞内结构高空间分辨率有限元模型的新方法。通过钙信号传导和生物能量学的案例研究，展示了该高空间分辨率模型的强大功能。
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本文内容
摘要
摘要
随着电子断层扫描、连续块面扫描电子显微镜和共聚焦显微镜等三维（3D）成像技术的发展，科学界前所未有地获得了大量亚微米分辨率的数据集，这些数据能够表征健康与疾病状态下心肌细胞功能变化所伴随的细胞结构重塑。然而，这些数据集在研究细胞结构重塑对心肌细胞功能影响方面尚未得到充分利用 。本实验方案旨在介绍如何利用高分辨率电子显微镜和共聚焦显微镜图像，构建一个精确的心肌细胞有限元模型。一个详细且准确的细胞结构模型具有巨大潜力，能够提供仅靠实验难以获得的心肌细胞生物学新见解。该方法的优势在于能够通过计算手段融合来自两种不同成像模态的心肌细胞超微结构信息，从而构建出统一而详尽的心肌细胞模型。本方案详细说明了整合成年雄性Wistar（一种白化大鼠品系的名称）大鼠心肌细胞的电子断层扫描与共聚焦显微镜图像，以建立心肌细胞半肌节有限元模型的步骤。该流程生成的三维有限元模型，能够以高分辨率（约~35 nm）精确呈现线粒体、肌原纤维以及兰尼碱受体簇的分布情况，后者负责将钙离子从肌浆网（SR）释放至肌原纤维和胞质区，从而触发心肌细胞收缩。本文所展示的示例模型未包含横小管结构或肌浆网网络的细节，因此属于心肌细胞的最小化模型。尽管如此，该模型已可用于基于模拟的研究，以探讨细胞结构在钙信号传导和线粒体生物能量学中的作用，本文在详细方案之后通过两个案例研究对此进行了说明和讨论。
引言
心脏中的兴奋-收缩耦联（ECC）是指心肌细胞膜的电兴奋与每次心跳过程中细胞机械收缩之间重要而复杂的耦合关系。数学模型在定量理解调控动作电位1、胞质钙信号2、生物能量学3以及后续收缩力生成的相互关联的生化过程中发挥了关键作用。这些模型还成功预测了当一个或多个此类生化过程发生改变时心跳特性的变化4,5。心肌细胞高度有序的超微结构 increasingly 被认为在细胞及整个心脏的正常收缩功能中起着至关重要的作用。事实上，在肥厚6、心力衰竭7和糖尿病性心肌病8等疾病状态下，心脏超微结构组分的形态和组织变化与生化改变同时发生。这些结构变化是轻微的、适应性的，还是对生化环境改变的病理性反应，目前仍 largely 不清楚9。生物学中结构与功能之间固有的紧密耦联意味着，仅靠实验研究无法提供超越结构重塑与心肌细胞功能之间相关性的深层见解。要全面、定量地理解心肌细胞中结构、生化过程与收缩力之间的关系，亟需新一代能够整合亚细胞组分结构组装特征以及已被深入研究的生化过程的数学模型。本实验方案描述了可用于构....
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方案
本文所述所有方法均已获得奥克兰大学动物伦理委员会和加州大学圣地亚哥分校机构动物护理与使用委员会的批准，其中组织方案最初由后者开发。
1. 实验准备
- 根据表1配制pH 7.4的0.15 M和0.3 M二甲胂酸钠缓冲液储备液。
- 使用表1中列出的组分，配制戊二醛固定液（含2%多聚甲醛（PFA）、2.5%戊二醛和0.2%单宁酸的0.15 M二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4）。
- 将2 g PFA粉末加入20 mL蒸馏水中，在加热板上60 °C条件下持续搅拌使其溶解。
- 逐滴加入1 M NaOH溶液，直至溶液变澄清。
- 待溶液温度降至40 °C以下后，加入10 mL戊二醛和20 mL 0.3 M二甲胂酸钠缓冲液。
- 加入0.2 g单宁酸，并使其完全溶解于溶液中。
- 加入50 mL 0.15 M二甲胂酸钠缓冲液。
- 将固定液分装至三到四个20 mL闪烁瓶中，于4 °C冰箱中保存；若当天使用，可置于冰上。
- 根据表1中的配方，配制含20 mM 2,3-丁二酮单肟（BDM）的Tyrode溶液。
- 在通风橱内组装Langendorff装置。
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结果
图2 至 图7 展示了本实验方案中若干关键步骤的代表性结果：（i）对组织块进行可视化并重新定位，以获得横截面电子显微镜图像；（ii）生成三维电子显微镜图像序列；（iii）对目标细胞器的亚细胞超微结构进行分割；（iv）使用 iso2mesh 生成有限元网格；（v）在网格上模拟兰尼碱受体（RyR）簇的真实空间分布；（vi）随后将该空间分布映射为计算网格上的空间密度。
图2展示了典型的明场图像，显示了细胞相对于切面呈纵向（图2A，标记为L）、斜向（图2A，标记为O）和横截向（图2B）排列时的外观。斜向和纵.......
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讨论
上述方案概述了构建心肌细胞超微结构新型有限元几何模型的关键步骤。该方法能够计算融合不同的显微成像技术（或原则上其他数据）模态，从而建立更全面的心肌细胞动力学计算模型，其中包含细胞空间结构的详细信息。目前尚无其他可用的方案来创建此类心肌细胞模型。
步骤1概述了灌注固定的方案。或者，也可将心脏切除后分割成较小的组织块，并浸入固定液中。然而，该过程必须迅速完成，且结果可能因样本大小而异。根据作者的经验，灌注法可确保固定液充分渗透至组织和细胞内部。作者此前还曾使用克雷布斯-亨塞莱特（Krebs-Henseliet）溶液对心脏进行灌注，以在固定前使其跳动，从而可在固定前对工作状态的心脏进行测量。
步骤2中的透射电子显微镜处理步骤是电子断层扫描的典型流程。当使用其他成像技术（如连续块面扫描电子显微镜或聚焦离子束显微镜）时，所用处理溶液的用量（尤其是染色液）以及处理时间可能有所不同28。所获得的电子显微镜图像必须分割成不同的细胞器区域，例如线粒体、肌原纤维和横小管。该分割过程可手动完成，也可采.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了新西兰皇家学会Marsden Fast Start基金11-UOA-184、人类前沿科学计划研究基金RGP0027/2013以及澳大利亚研究理事会发现项目基金DP170101358的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 丙磺舒 | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-丁二酮单肟 | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% 戊二醛电镜级（500 ml 瓶装） | 默克 | 354400-500ML | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 单宁酸 | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100克 EM级 |
| 二甲胂酸钠 | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| 四氧化锇 | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% 水溶液，5 ml 瓶装（也可提供 10 ml 瓶装） |
| 醋酸铀酰 | EM Sciences | 22400 | 25克装瓶 |
| 亚铁氰化钾 | 默克密理博 | 104973 | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| 硼砂 | Sigma-Aldrich | S9640 | 也称为硼砂 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 792780 | 用纯水稀释至不同百分比 |
| 丙酮 | EM Sciences | RT10017 | |
| 树脂试剂盒 | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan 效果良好 |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | H9892 | 1号正常溶液 |
| <强>仪器设备 | |||
| 超薄切片机 | Leica | EM UC7 | |
| 透射电子显微镜 | 赛默飞世尔科技 | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| 铁架台 | Proscitech | T752 | |
| 导管 | 生物策略 | 75831-346 | 对于兰格多夫灌流装置，建议使用直径3 mm的导管，但并非必需 |
| 三通阀 | SDR | QP13813 | 用于兰格多夫导管；该产品仅为示例，用户可选择任意产品 |
| 铁架台夹具 | Proscitech | T715 | |
| 塑料注射器 | SDR | QPC1108 | 用于兰格多夫装置的溶液 |
| 7-0 丝线套管 | TeleFlex | 15B051000 | 用于将心脏固定在朗根多夫装置上 |
| 导管 | 由外径3 mm的钢针制成 | ||
| 橡胶培养皿垫 | Proscitech | H068 | 用于固定心脏解剖时作为切板 |
| 剃须刀片 | Proscitech | L056 | 用于将固定的心脏切割成小块以进行电镜处理 |
| 玻璃瓶 | 生物策略 | 89000-236 | 用于在组织固定和电镜处理过程中储存溶液 |
| 烧杯 | 生物策略 | 213-0477 | 用于临时储存溶液及灌注过程中使用 |
| 闪烁瓶 | 生物策略 | 548-2170 | 用于组织样本在电镜处理过程中的处理 |
| 解剖工具包 | Proscitech | T161 | 用于动物解剖 |
| 注射器滤器 | Proscitech | WS3-02225S | 用于醋酸铀酰的纯化 |
| 铝/银箔烤杯 | 从任何烘焙用品商店 | ||
| Dupont 金刚石刀片 | 生物策略 | 102680-780 | 35度角版本可产生最佳切片。 |
| 胶体金 | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm 胶体金 |
| EM 网格载网 | Proscitech | GCU150 | 可测试多种尺寸：例如 GCU150h、GCU200h |
| 塑料一次性移液管 | Proscitech | LCH20 | 最好使用一次性塑料制品，尤其是在处理树脂时 |
| 软件 | |||
| SerialEM | 博尔德大学 | 断层扫描采集 | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | 博尔德大学 | 图像配准与分割 | |
| iso2mesh | 可在 http://iso2mesh.sourceforge.net 获取 | ||
| Fiji 或类似的图像处理软件 | ImageJ | Fiji 就是 ImageJ | 可在 https://fiji.sc 获取，用于二值图像序列的处理 |
| RyR-Simulator 代码/数据 | CellSMB 小组 | 可在 https://github.com/CellSMB/RyR-simulator 获取 | |
| 心脏细胞网格生成器 | CellSMB 小组 | 随 RyR-Simulator 位于文件夹中 "图形界面版本" | |
| R 统计软件 | R-project | 从 https://www.r-project.org 下载 | |
| spatstat | R项目 | 通过 R 程序安装 | |
| rgl | R项目 | 通过 R 程序安装 | |
| doparallel | R-project | 通过 R 程序安装 | |
| foreach | R项目 | 通过 R 程序安装 | |
| doSNOW | R-project | 通过 R 程序安装 | |
| 迭代器 | R-project | 通过 R 程序安装 |
参考文献
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci.
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重印与许可
