小鼠匹罗卡品颞叶癫痫模型及基于无线遥测系统的脑电图监测

摘要

本文描述了一种通过全身注射匹鲁卡品诱导癫痫持续状态的方法，以及利用无线遥测视频和脑电图系统在活体动物中监测自发性复发性癫痫发作的方法。该方案可用于研究慢性癫痫、癫痫发生以及急性癫痫发作的病理生理机制。

摘要

颞叶癫痫（TLE）是成年期常见的神经系统疾病。在慢性癫痫的转化研究中，通常选用匹罗卡品诱导的癫痫持续状态（SE）来模拟自发性反复发作的癫痫（SRS）。本文介绍了一种通过腹腔（i.p.）注射匹罗卡品诱导SE，并利用无线遥测视频与脑电图（EEG）系统在活体动物中监测慢性反复性癫痫发作的实验方案。我们展示了匹罗卡品注射后需密切关注的显著行为学变化，并分析了这些变化与注射后7天及6周时海马神经元丢失之间的相关性。此外，我们还描述了用于视频和脑电图记录的电极植入实验步骤，以及对慢性反复性癫痫发作频率和持续时间的分析方法。最后，我们讨论了在不同情况下未能获得预期结果的可能原因。本研究为小鼠慢性癫痫建模提供了基本概述，并给出了相应的故障排查指南。我们认为该方案可作为构建合适的慢性癫痫及癫痫发生模型的基础参考。

引言

颞叶癫痫（TLE）是最常见的获得性癫痫之一¹。癫痫患者由于大脑中神经元活动异常而反复出现癫痫发作^2,3。鉴于TLE常难以治疗，了解癫痫发生发展的基本机制至关重要。

能够重现人类颞叶癫痫（TLE）关键特征的动物模型有助于更深入理解TLE的病理生理机制，使我们能够便捷地监测和调控癫痫发生过程中的关键因素。其中，化学致痫剂诱导的癫痫持续状态（SE）已被广泛应用^4,5与其他癫痫模型（如电刺激模型）不同，后者无海马硬化且自发性癫痫发作（SRS）显著^6,7,8全身注射化学致痫剂可模拟人类颞叶癫痫的临床发病过程， 即，初始脑损伤、潜伏期和表现为SRS的慢性癫痫阶段^5,9,10因此，该技术可用于多种研究，以阐明急性脑损伤、癫痫....

方案

所有实验程序均经韩国天主教大学伦理委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号）进行。

1. SE 诱导

1. 购买8周龄的雄性C57BL/6NHsd小鼠，并称量每只小鼠的体重。然后使用记号笔标记所有小鼠的尾巴，以便在诱发癫痫持续状态（SE）期间进行快速识别。
2. 根据小鼠体重计算溴甲基东莨菪碱（scopolamine；2 mg/kg）、硫酸特布他林（terbutaline；2 mg/kg）和盐酸匹罗卡品（pilocarpine；280 mg/kg）的用量，并加入生理盐水（0.9% NaCl，10 mL/kg）配制成溶液。
   注意：例如，若小鼠体重为25 g，则各试剂用量如下：东莨菪碱和特布他林：2 mg/kg × (25 g/1,000 g) = 0.05 mg；生理盐水：10 mL/kg × (25 g/1,000 g) = 0.25 mL；匹罗卡品：280 mg/kg × (25 g/1,000 g) = 7 mg；生理盐水：10 mL/kg × (25 g/1,000 g) = 0.25 mL。
3. 将东莨菪碱与特布他林的混合液装入带有30 G针头的1 mL注射器中，对每只小鼠进行腹腔注射，随后将小鼠放回笼中。在给予东莨菪碱和特布他林30分钟后，向每只小鼠腹腔注射匹罗卡品溶液（i.p.；1 mL注射器；30 G针头）。匹罗卡品注....

结果

成功的癫痫持续状态（SE）可诱导海马细胞死亡和自发性癫痫发作（SRS）（图1 和 图2）。我们在SE发作后3小时通过注射地西泮终止行为学上的急性癫痫发作，并在7天或6周后处死小鼠。

进行视频脑电图（video-EEG）监测时，小鼠在癫痫持续状态（SE）发生4周后接受植入手术，并在SE发作后5至7周期间连续评估自发性癫痫发作（SRS）情况，评估持续2周。

图1 显示通过焦油紫染色评估的海马区细胞死亡情况。在诱发癫痫持续状态（SE）后7天，齿状回的门区（图1Ad）以及.......

讨论

本研究描述了癫痫持续状态诱导及慢性癫痫发作评估的实验步骤。

多种因素可影响癫痫持续状态（SE）诱导的成功率。根据Racine评分标准进行准确的行为学监测，对于自发性癫痫发作（SRS）的形成至关重要。头部点动、前肢阵挛、直立和跌倒，是急性癫痫发作进展至SE阶段的行为学特征^4,16。一旦检测到首次运动性癫痫发作，随后惊厥性发作之间的间隔时间会逐渐缩短，直至进入SE状态。此外，除非使用地西泮终止行为性癫痫发作，否则SE应至少持续6小时⁵。值得注意的是，即使地西泮注射后行为性癫痫发作看似缓解，仍有可能通过皮层脑电图检测到持续的癫痫样电活动，研究人员应意识到这一可能性。在匹罗卡品注射后至SE诱导期间提高环境温度，可显著增加成功诱导SE的动物数量。此外，提供强化的发作后护理也至关重要，包括充分补水、营养支持和体重监测，以实现平均70-80%以上的存活率^5,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6	Envigo	C57BL/6NHsd
硝酸甲基东莨菪碱	Sigma	S2250	配制10倍储存液
硫酸特布他林盐	Sigma	T2528	配制10倍储存液
盐酸匹鲁卡品	Sigma	P6503
盐酸氯胺酮	Yuhan corporation
盐酸赛拉嗪	Bayer Korea
地西泮	SAMJIN
蓖麻油（Kolliphor EL）	Sigma	C5135	聚氧乙烯35氢化蓖麻油
生理盐水	Daihan pharm. Co.
5%葡萄糖	Daihan pharm. Co.
碘溶液（聚维酮碘）	Firson
兽用软膏（Terramycin）	Pfizer
蓝色尼龙线	AILEE	NB617
莫匹罗星（Bearoban）	Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd
酮洛芬	Samchundang Pharm. Co., Ltd		5 mg/kg
庆大霉素	Huons, Ltd.		5 mg/kg
1 mL注射器	Sung shim medial Co., Ltd.
26号针头	Sung shim medial Co., Ltd.		26 G * 13 mm (1/2")
30号针头	Sung shim medial Co., Ltd.		30 G * 13 mm (1/2")
剃须刀片	Dorco
钻机	Saeshin precision Co., Ltd.		207A, 35K（转速）
遥测视频/脑电图系统	Data sciences International. Inc.	Version 5.20-SP6
可植入式发射器	Data sciences International. Inc.	ETA-F10
螺钉	Sungho Steel		M1.4，2 mm长，不锈钢
牙科水泥材料	Dentimex
丙酮	Duksan pure chemicals Co., Ltd.		CAS 67-64-1
多聚甲醛（PFA）	millipore	1.04005.1000	4 %
蔗糖	Sigma	S9378	0.01 M PBS中的30%溶液
乙酸焦油紫	Sigma	C5042
乙醇	EMD Millipore Co.	UN1170
二甲苯	Duksan pure chemicals Co., Ltd.	UN1307
冰乙酸	Junsei chemical	31010-0350
FSC33 透明剂	Leica biosystems		用于组织冷冻的OCT包埋剂
组织学用DPX封片剂	Sigma	6522
镊子	Fine science tools	11002-12
剪刀	Solco biomedical	02-2445
立体定位仪	David Kopf Instruments	E51070012