一种的开发 体外 斑马鱼胚胎发育过程中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）定量检测方法

摘要

本文介绍一种在胚胎斑马鱼中定量造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的简单方法。将解离后的斑马鱼HSPCs接种于含支持性因子的甲基纤维素中，使其分化为成熟的血细胞。该方法可用于检测血液系统缺陷，并便于开展药物筛选。

摘要

造血作用是一种重要的细胞过程，其中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化为构成成熟血液的多种不同细胞谱系。由于这些HSPCs的定义特征 事后；只有在它们分化为特定细胞谱系后才能被定义。在过去的几十年中，斑马鱼（斑马鱼已成为研究造血作用的模式生物。斑马鱼胚胎在发育过程中 子宫外，到受精后48小时（hpf）时已生成定型的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。已有用于评估HSPC分化和增殖能力的检测方法，这些方法利用细胞移植及随后的造血系统重建，以及通过共聚焦显微镜观察特化的转基因品系。然而，这些检测方法成本高昂、技术难度大且耗时，使许多实验室难以开展。一种新型检测方法的开发旨在 体外 与先前所述方法相比，该评估HSPCs的模型具有成本效益高、速度快且操作难度低的优势，可使实验室快速评估影响HSPC生物学的诱变效应和药物筛选结果。这一新型 体外 用于评估造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的实验方法是通过铺板分离的完整斑马鱼胚胎，并添加仅促进HSPC分化与增殖的外源性因子。将胚胎解离为单细胞后，与支持HSPC生长的集落刺激因子共同培养，使其形成由单个前体细胞产生的集落形成单位（CFUs）。该类实验有助于更深入地研究调控HSPC增殖、分化及调控的分子通路，从而帮助研究人员理解脊椎动物造血作用的机制及其在疾病过程中发生异常调控的基础。

引言

造血是产生维持生物体生存所需的各种成熟血细胞的过程。这是一个关键的发育过程，涉及造血干细胞（HSCs）分化为多种发育受限的细胞类型，从而形成成熟的血液细胞。这些造血干细胞必须能够自我更新，以确保该系统不会耗竭，并且必须从胚胎早期发育阶段持续存在直至个体死亡。在脊椎动物中，为了充分补充大多数每天被循环更新的终末分化血细胞，需要持续进行造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的分化与增殖。造血干细胞首先分化为一系列谱系受限的祖细胞亚群：共同淋巴样祖细胞（CLPs）¹，最终生成T细胞、B细胞和NK细胞；以及共同髓系祖细胞（CMPs）²，可产生粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞。这些祖细胞已定向发育为特定的细胞谱系，并进一步分化为发育潜能更受限的祖细胞，例如髓系红系祖细胞（MEPs），可生成红细胞和血小板；或粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs），可生成嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞²。识别并分离这些祖细胞有助于揭示造血分化过程中关键的分子通路，许多造血系统疾病（如白血病）正是由于这些祖细胞无法正常分化而引发的。

在过去的几十年中，斑马鱼（Danio rerio) 模型系统已成为研究胚胎和成体造血过程的关键研究工具。斑马鱼易于进行遗传学分析，是系统发育上最低等的具有与人类相似血管系统和造血系统的脊椎动物模型物种。斑马鱼....

方案

加州州立大学奇科分校的机构动物照护与使用委员会（IACUC）咨询委员会已批准下述所有方法。

1. 漂白48小时斑马鱼胚胎

1. 使用 15 cm（宽）× 15 cm（长）× 7 cm（高）的塑料容器制备 3 个洗涤站：1） 1 mL 5% 漂白剂溶于 1000 mL 胚胎培养基（E3；参见 表1），2）用无菌E3培养液，以及3）用无菌E3培养液。确保每个容器中含有500 mL溶液，以完全浸没胚胎。
   注意：每种测试条件至少需要10个胚胎。此洗涤步骤最多可处理200个胚胎。
2. 使用移液管将胚胎转移至茶筛中，浸入清洗站#1，清洗5分钟。取出茶筛（内含胚胎），转移至清洗站#2，清洗5分钟；再转移至清洗站#3，最后清洗5分钟。
3. 最后一次洗涤后，将茶滤器倒置在干净的10 cm培养皿上，用无菌E3培养基和移液器轻轻冲洗，使胚胎从茶滤器上脱落。

2. 去除胚胎的卵膜

1. 用移液管从培养皿中尽可能吸除并弃去 E3，然后向胚胎中加入 500 μL 去壳蛋白酶（10 mg/mL）。室温孵育 5 分钟。轻轻敲击培养皿侧面，以彻底去除卵膜。
2. 用血清学 移液管加入 20 mL 无菌 E3 以稀释蛋白酶。让胚胎沉降，然后用移液管吸除 E3。重复此洗涤步骤 ....

结果

为了评估胚胎斑马鱼中的造血干细胞和祖细胞（HSPC）数量，将48小时发育期（hpf）的胚胎进行消化处理，接种至含外源性造血支持性生长因子的甲基纤维素培养基中，并培养7天（图1A）。培养7天后，对集落形成单位（CFUs）进行计数（图1B）并拍照记录（图1C）。通过调控添加的不同细胞因子，可控制所生成集落的类型：促红细胞生成素（Epo）是红系分化所必需的，而粒细胞集落刺激因子（Gcsf）是髓系分化所必需的。鲤鱼血清在斑马鱼培养中的作用类似于胎牛血清在哺乳动物组织培养中的应用，可提供多种通用生长因子。在图1中，添加了Epo、Gcsf和鲤鱼血清，从而能够对红系、髓系以及混合型红髓系集落进行计数。这些集落可根据其形态和颜色加以区分：红系集落结构紧.......

讨论

斑马鱼模型系统已成为研究原始和确定性脊椎动物造血作用的一种高效、有效且经济的模型。开发快速、经济且技术难度较低的检测方法可用于小分子测试、突变胚胎分析以及揭示对造血干细胞和祖细胞（HSPC）生物学重要的分子通路。体外培养成年斑马鱼来源的HSPC是研究诱变、细胞因子及造血缺陷的有效方法。本实验方案在上述研究基础上加以改进，但采用斑马鱼胚胎。将这些检测方法应用于斑马鱼胚胎可加快数据收集速度，减少所需物理空间，降低药物用量（适用于药物筛选），并可检测特定遗传通路的mRNA过表达和/或吗啉代（MO）敲低效果。更重要的是，该方法还允许研究仅在脊椎动物早期发育阶段发生的造血过程。

由于该检测方法具有较高的灵活性，因此可轻松修改以满足多种不同的需求。本方案的一种改进是调控发育时间点；通过改变所用胚胎的年龄，可实现对HSPC随时间生成情况的定量分析。这种方法还可用于研究HSPC的不同亚群，例如在36 hpf之前出现的红系-髓系祖细胞⁶，与之后出现的真正造血干细胞（bona fide HSCs）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Isco​​ve's MDM 中的 10% 牛血清白蛋白	StemCell Technologies	9300
含钙2+ 和镁2+ 的 DPBS (10x)	Life Technologies	14080-055
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
DMEM 500 mL	Corning CellGrow	10-017-CV
Ham's F12 500 mL	Corning CellGrow	10-080-CV
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HEPES 100 mL (1 M)	Gibco life technologies	15-630-080
青霉素/链霉素 (5000 U/mL 和 5000 mg/mL)，含 L-谷氨酰胺 (200 mM)	Corning Mediatech	30-009-CI
硫酸庆大霉素 10 mL (50 mg/mL)	Corning Mediatech	30-005-CR
1.5 mL MCF 管	FisherBrand	05-408-129
3 mL 23 号 ×1 注射针头，带鲁尔锁	BD Safety Glide	305905
5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞筛网帽	Corning Falcon	352235
Methocel MC	Sigma-Aldrich	64630
14 mL 聚苯乙烯圆底管	Corning Falcon	352057
10 mm 聚苯乙烯易握培养皿	Corning Falcon	351008
Librease TM	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	解离蛋白酶
蛋白酶 K (Pronase)	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	去卵膜蛋白酶
15 cm 培养皿	Corning Falcon	351058
AB	斑马鱼国际资源中心 (ZIRC)	ZL1	所用斑马鱼品系
二硫苏糖醇 (DTT)	Sigma-Aldrich	646563