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方法文章

一种的开发 体外 斑马鱼胚胎发育过程中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）定量检测方法

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DOI：

10.3791/56836

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2017年11月30日

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

本文内容

摘要

本文介绍一种在胚胎斑马鱼中定量造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的简单方法。将解离后的斑马鱼HSPCs接种于含支持性因子的甲基纤维素中，使其分化为成熟的血细胞。该方法可用于检测血液系统缺陷，并便于开展药物筛选。

摘要

造血作用是一种重要的细胞过程，其中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化为构成成熟血液的多种不同细胞谱系。由于这些HSPCs的定义特征 事后；只有在它们分化为特定细胞谱系后才能被定义。在过去的几十年中，斑马鱼（斑马鱼已成为研究造血作用的模式生物。斑马鱼胚胎在发育过程中 子宫外，到受精后48小时（hpf）时已生成定型的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。已有用于评估HSPC分化和增殖能力的检测方法，这些方法利用细胞移植及随后的造血系统重建，以及通过共聚焦显微镜观察特化的转基因品系。然而，这些检测方法成本高昂、技术难度大且耗时，使许多实验室难以开展。一种新型检测方法的开发旨在 体外 与先前所述方法相比，该评估HSPCs的模型具有成本效益高、速度快且操作难度低的优势，可使实验室快速评估影响HSPC生物学的诱变效应和药物筛选结果。这一新型 体外 用于评估造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的实验方法是通过铺板分离的完整斑马鱼胚胎，并添加仅促进HSPC分化与增殖的外源性因子。将胚胎解离为单细胞后，与支持HSPC生长的集落刺激因子共同培养，使其形成由单个前体细胞产生的集落形成单位（CFUs）。该类实验有助于更深入地研究调控HSPC增殖、分化及调控的分子通路，从而帮助研究人员理解脊椎动物造血作用的机制及其在疾病过程中发生异常调控的基础。

引言

造血是产生维持生物体生存所需的各种成熟血细胞的过程。这是一个关键的发育过程，涉及造血干细胞（HSCs）分化为多种发育受限的细胞类型，从而形成成熟的血液细胞。这些造血干细胞必须能够自我更新，以确保该系统不会耗竭，并且必须从胚胎早期发育阶段持续存在直至个体死亡。在脊椎动物中，为了充分补充大多数每天被循环更新的终末分化血细胞，需要持续进行造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的分化与增殖。造血干细胞首先分化为一系列谱系受限的祖细胞亚群：共同淋巴样祖细胞（CLPs）1，最终生成T细胞、B细胞和NK细胞；以及共同髓系祖细胞（CMPs）2，可产生粒细胞、红细胞、巨噬细胞和巨核细胞。这些祖细胞已定向发育为特定的细胞谱系，并进一步分化为发育潜能更受限的祖细胞，例如髓系红系祖细胞（MEPs），可生成红细胞和血小板；或粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs），可生成嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞2。识别并分离这些祖细胞有助于揭示造血分化过程中关键的分子通路，许多造血系统疾病（如白血病）正是由于这些祖细胞无法正常分化而引发的。

在过去的几十年中，斑马鱼（Danio rerio) 模型系统已成为研究胚胎和成体造血过程的关键研究工具。斑马鱼易于进行遗传学分析，是系统发育上最低等的具有与人类相似血管系统和造血系统的脊椎动物模型物种。斑马鱼胚胎在体外发育 子宫外 在受精后48小时内（hpf）生成造血干细胞和祖细胞（HSPCs）3,4,5,6,7,8斑马鱼还具有很高的繁殖能力，雌鱼单次产卵可超过100枚，有利于获得大样本量并进行实验重复。斑马鱼胚胎具有光学透明性，便于通过显微镜观察造血系统。目前已建立多种荧光转基因斑马鱼品系，可标记造血干细胞（HSCs），例如 runx1EGFP 鱼9, cd41EGFP 鱼10，以及 kdrl:mCherry cmybGFP3 双阳性动物，可实现造血干细胞出现与扩增的活体实时可视化 体内3,4,7,8,9斑马鱼的快速繁殖周期和发育能力 子宫外 已使其被用于诱变研究11,12,13,14,15 药物筛选16,17,18,19,20 对于具有治疗人类血液疾病潜力的化合物而言，斑马鱼由于其造血系统的保守性、转基因品系的易得性和快速发育特性，已成为一种经济、快速、灵活且理想的造血研究模型。

已开发出多种用于分离和检测哺乳动物造血系统中造血干细胞（HSCs）的方法。研究者可利用一组细胞表面受体的组合来标记HSCs21,22,23,24以及利用造血干细胞（HSCs）外排染料的能力25,26标记后，可通过荧光激活细胞分选（FACS）实现其物理分离。要证实某个细胞为造血干细胞（HSC），需对宿主动物进行照射以清除内源性造血干细胞和祖细胞（HSPC），随后移植待测的HSC，并观察其是否能够长期、多谱系地重建所有成熟血细胞类型。这类检测在小鼠中效果良好，因为已有大量针对造血细胞的细胞表面抗体，以及便于移植时免疫匹配的近交系小鼠品系。然而，目前生成的斑马鱼造血细胞表面抗体较少。27，阻碍了造血干细胞（HSCs）的鉴定与分离。标记和分离斑马鱼HSCs最常用的方法是使用转基因动物，即通过细胞特异性启动子序列驱动荧光蛋白的表达。利用该技术，已有研究通过显微镜观察并计数了背主动脉腹壁中的HSCs。3,4,8,9. 其他实验室已培育出斑马鱼的克隆品系28,29 并在MHC匹配的动物中成功进行了移植30然而，这些技术对许多实验室而言成本过高，技术难度大，且耗时较长。为解决这些问题，实验室已开发出多种方法 体外 用于检测HSPC的存在、增殖速率及分化能力的检测方法31,32,33,34,35,36这些检测显示了造血干细胞和祖细胞的增殖与分化 体外31,32,33,34,35,36造血缺陷的挽救36以及发现和测试细胞因子的高效方法33,34,35它们还被用于鉴定负责造血干祖细胞生物学的基因31,32在本研究中，我们进一步改进了这些检测方法，使其能够对发育中的斑马鱼胚胎内的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行定量。这些检测方法还可用于定量突变体动物以及经造血干扰药物处理的动物体内HSPCs的数量。本质上，这些方法快速、技术难度低且成本低廉，可用于定量HSPCs数量、检测其增殖情况，并研究其分化阻滞现象。

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方案

加州州立大学奇科分校的机构动物照护与使用委员会（IACUC）咨询委员会已批准下述所有方法。

1. 漂白48小时斑马鱼胚胎

  1. 使用 15 cm（宽）× 15 cm（长）× 7 cm（高）的塑料容器制备 3 个洗涤站：1） 1 mL 5% 漂白剂溶于 1000 mL 胚胎培养基（E3；参见 表1），2）用无菌E3培养液，以及3）用无菌E3培养液。确保每个容器中含有500 mL溶液，以完全浸没胚胎。
    注意：每种测试条件至少需要10个胚胎。此洗涤步骤最多可处理200个胚胎。
  2. 使用移液管将胚胎转移至茶筛中，浸入清洗站#1，清洗5分钟。取出茶筛（内含胚胎），转移至清洗站#2，清洗5分钟；再转移至清洗站#3，最后清洗5分钟。
  3. 最后一次洗涤后，将茶滤器倒置在干净的10 cm培养皿上，用无菌E3培养基和移液器轻轻冲洗，使胚胎从茶滤器上脱落。

2. 去除胚胎的卵膜

  1. 用移液管从培养皿中尽可能吸除并弃去 E3，然后向胚胎中加入 500 μL 去壳蛋白酶（10 mg/mL）。室温孵育 5 分钟。轻轻敲击培养皿侧面，以彻底去除卵膜。
  2. 用血清学 移液管加入 20 mL 无菌 E3 以稀释蛋白酶。让胚胎沉降，然后用移液管吸除 E3。重复此洗涤步骤 3 次，以彻底清除所有去壳蛋白酶残留。

3. 胚胎样品的制备

  1. 使用 P1000 移液器，将 10 个胚胎放入一个无菌的 1.5 mL 微量离心管中。
  2. 用移液器吸出 E3 并弃去。
    注意：操作移液时需小心，因为在后续的洗涤步骤中，胚胎容易被移位并随之弃去。

4. 准备用于解离的胚胎

  1. 将样品转移至超净工作台，加入1 mL无菌E3培养基清洗胚胎。待胚胎沉降至管底后，用P1000移液器吸除上清液。共重复洗涤3次。
  2. 最后一次洗涤后，吸除E3培养基并弃去。加入1 mL含10 mM二硫苏糖醇（DTT）的E3培养基，以去除包裹在斑马鱼胚胎周围的黏液层（以及可能被困在其中的孢子、酵母或细菌）。将微量离心管水平放置，在超净工作台中室温孵育25分钟。

5. 胚胎解离

  1. 用 1 mL 无菌 DPBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）将样品洗涤 3 次。最后一次洗涤后，加入 500 μL DPBS（含 Ca2+ 和 Mg2+），再加入 5 μL 的 5 mg/mL（26 U/mL）解离蛋白酶。
    注意：该酶需要 Ca2+ 和 Mg2+，因此需确保 DPBS 中含有这些离子。
  2. 将样品置于 37 °C、180 rpm 的水平轨道摇床上孵育 60 分钟。将样品移至超净工作台，用 P1000 移液器反复吹打胚胎，直至样品完全解离。
    注意：需定期检查胚胎，以确定其解离程度。胚胎悬液中应含有一定量的组织碎片，不应完全均一。过度消化可能导致 HSPC 被破坏（见 补充图 1）。

6. 分离胚胎的制备

  1. 用移液器将10个已解离的胚胎转移至带有35 μm细胞筛帽的5 mL聚苯乙烯圆底管的上层储液端。
  2. 用移液器以无钙离子（Ca2+）和镁离子（Mg2+）的无菌PBS冲洗培养皿，并将冲洗液转移至含有步骤6.1中过滤后细胞的5 mL聚苯乙烯管中。重复此操作，直至5 mL聚苯乙烯管中液体体积达到4 mL。
    注意：此步骤可使用PBS、DPBS或其他等渗缓冲溶液，前提是不含Ca2+或Mg2+
  3. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。用移液器小心吸除并弃去圆底管中的上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于100 μL PBS中。

7. 甲基纤维素的制备

  1. 制备1×完全甲基纤维素（表1）储存液，使用3 mL注射器和16 G针头将2.5 mL加入无菌圆底14 mL试管中。每种实验条件使用一个试管。
  2. 向各样本中加入待研究的细胞因子、小分子或其他试剂。
    1. 进行髓系分化时，在甲基纤维素培养基中加入1% 鲤鱼血清和0.3 mg/mL 重组斑马鱼粒细胞集落刺激因子（Gcsf）34。有关鲤鱼血清和重组细胞因子制备的完整说明，请参见Svoboda et al.37 。
    2. 进行红系分化时，在甲基纤维素培养基中加入1% 鲤鱼血清和0.1 mg/mL 重组斑马鱼促红细胞生成素（Epo）38 。
    3. 为检测多系祖细胞，同时加入Epo和Gcsf。
      注意：细胞因子和添加剂总体积不应超过培养基总体积的10%，否则培养基黏度不足，难以分辨单个克隆。

8. 将解离的胚胎加入甲基纤维素

  1. 使用移液器将100 μL解离后的10个胚胎加入含有重组细胞因子和鲤鱼血清的预处理甲基纤维素表面。盖上盖子后轻轻涡旋，使样品充分混匀。每管现在应含有10个胚胎的解离组织。
  2. 使用3 mL注射器和16 G针头，将1 mL样品分装至两个独立的35 mm培养皿中。确保样品在培养皿内完全分散。每个样品均需重复此步骤。
  3. 将含有细胞的35 mm培养皿放入15 cm培养皿中。向每个15 cm培养皿中加入一个含5 mL无菌水的35 mm培养皿，以保持样品湿度。于32 °C和5% CO2条件下培养7–10天。

9. HSPC 来源的集落形成单位（CFUs）的可视化

  1. 孵育7天后，将样品置于倒置显微镜下，以40 - 100倍放大倍数进行观察和计数。此时，可用移液器分离单个菌落，并进行染色 和/或基因分析。

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结果

为评估胚胎斑马鱼中的造血干细胞/祖细胞（HSPC）数量，将48小时受精龄（hpf）的胚胎进行消化处理，随后接种至含外源性造血支持性生长因子的甲基纤维素培养基中，并培养7天（图1A）。培养7天后，对集落形成单位（CFUs）进行计数（图1B），并进行成像（图1C）。通过调控添加的不同细胞因子，可控制所形成的集落类型：促红细胞生成素（Epo）是红系分化所必需的，粒细胞集落刺激因子（Gcsf）是髓系分化所必需的。鲤鱼血清在斑马鱼培养中起到类似于胎牛血清在哺乳动物组织培养中的作用，可提供广谱生长因子。在图1中，添加了Epo、Gcsf和鲤鱼血清，从而可对红系、髓系以及混合型红髓系集落进行计数。这些集落可根据其形态和颜色加以区分：红系集落结构紧密、体...

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讨论

斑马鱼模型系统已成为研究原始和确定性脊椎动物造血作用的一种高效、有效且经济的模型。开发快速、经济且技术难度较低的检测方法可用于小分子测试、突变胚胎分析以及揭示对造血干细胞和祖细胞（HSPC）生物学重要的分子通路。体外培养成年斑马鱼来源的HSPC是研究诱变、细胞因子及造血缺陷的有效方法。本实验方案在上述研究基础上加以改进，但采用斑马鱼胚胎。将这些检测方法应用于斑马鱼胚胎可加快数据收集速度，减少所需物理空间，降低药物用量（适用于药物筛选），并可检测特定遗传通路的mRNA过表达和/或吗啉代（MO）敲低效果。更重要的是，该方法还允许研究仅在脊椎动物早期发育阶段发生的造血过程。

由于该检测方法具有较高的灵活性，因此可轻松修改以满足多种不同的需求。本方案的一种改进是调控发育时间点；通过改变所用胚胎的年龄，可实现对HSPC随时间生成情况的定量分析。这种方法还可用于研究HSPC的不同亚群，例如在36 hpf之前出现的红系-髓系祖细胞6，与之后出现的真正造血干细胞（bona fide HSCs）

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

资金由美国国立卫生研究院（NIH：K01-DK087814-01A1，授予 D.L.S.）、加州州立大学生物技术教育与研究项目（CSUPERB：脊椎动物造血微环境的分子调控，授予 D.L.S.）以及加州州立大学奇科分校研究生院办公室（授予 A.C.B.）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Isco​​ve's MDM 中的 10% 牛血清白蛋白StemCell Technologies 9300
含钙2+ 和镁2+ 的 DPBS (10x)Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
 DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV
 Ham's F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
青霉素/链霉素 (5000 U/mL
和 5000 mg/mL)，含 L-谷氨酰胺 (200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
硫酸庆大霉素 10 mL (50 mg/mL)Corning Mediatech30-005-CR
1.5 mL MCF 管FisherBrand05-408-129
3 mL 23 号 ×1 注射针头，带鲁尔锁BD Safety Glide305905
5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞筛网帽Corning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL 聚苯乙烯圆底管Corning Falcon352057
10 mm 聚苯乙烯易握培养皿Corning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001解离蛋白酶
蛋白酶 K (Pronase)Roche Sigma-Aldrich11459643001去卵膜蛋白酶
15 cm 培养皿Corning Falcon351058
AB斑马鱼国际资源中心 (ZIRC)ZL1所用斑马鱼品系
二硫苏糖醇 (DTT)Sigma-Aldrich646563

参考文献

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