本文介绍了一种可用于在显微镜下可视化并定量分析细胞和组织中脱氢酶活性及其动力学、功能和亚细胞定位的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
细胞代谢异常是多种疾病的显著特征，包括癌症、心血管疾病和感染性疾病。细胞的代谢功能单位是酶，其活性在多个层面受到严格调控，包括转录、mRNA稳定性、翻译、翻译后修饰以及功能水平。这种复杂的调控机制意味着传统的定量或成像检测方法，如定量mRNA实验、Western印迹和免疫组织化学，只能提供关于酶最终活性、功能和/或亚细胞定位的不完整信息。定量酶细胞化学与组织化学（即， 代谢成像）提供了关于 原位 酶活性及其动力学、功能和亚细胞定位在近乎自然状态下的研究。
我们描述了一种检测脱氢酶活性的实验方案，脱氢酶是一类可催化氧化还原反应、还原NAD(P)+和FAD等辅因子的酶。将细胞或组织切片孵育在针对特定脱氢酶酶活性的反应介质中。随后，待研究的脱氢酶在其亚细胞定位部位发挥酶活性，并与反应介质发生化学反应，最终在脱氢酶活性位点生成蓝色的甲臜沉淀。因此，甲臜的吸光度可直接反映脱氢酶的活性水平，并可通过单色光显微镜结合图像分析进行定量。该方案的定量特性使研究人员能够从这些检测中得出具有统计学意义的结论。
除了观察性研究外，该技术还可用于特定酶的抑制研究。在此背景下，研究可受益于代谢定位技术真实反映自然状态的优势，从而提供 原位 可能比生理学上更相关的结果 体外 酶抑制研究。总之，代谢图谱技术是在细胞或组织水平上研究代谢不可或缺的方法。该技术易于采用，可提供深入、全面且整合的代谢信息，并支持快速的定量分析。
引言
细胞生理学的一个基本基石是代谢。代谢为细胞提供所有生理过程所需的能量，供给大分子生物合成的结构单元，并调节细胞内废物、有毒分子以及无用或功能异常的细胞组分的分解与再循环，从而维持细胞稳态。几乎所有关键的细胞化学反应都由酶催化，因此酶是细胞生理功能中的基本功能单位。1,2
酶的活性在多个层面受到严格调控，因此定量酶组织化学和细胞化学（也称为代谢定位）是原位研究酶活性的首选方法。in situ。在转录水平上，基因表达为mRNA的过程受到调控。转录调控的效果可通过定量mRNA检测方法（如微阵列或直接RNA测序）或定性mRNA检测方法（如in-situ杂交）来确定，后者可提供mRNA分子的（亚）细胞定位信息。这使得研究人员能够评估不同细胞间转录活性的相对差异。然而，由于调控也发生在mRNA水平——即mRNA从DNA转录后，其序列和稳定性会进一步被编辑——因此将这些mRNA检测结果用于推断代谢活性时，其解释和有效性变得复杂。这种编辑过程调控了核糖体上蛋白质异构体的翻译以及蛋白质翻译的数量。此外，蛋白质翻译过程本身也受到控制，最终影响酶的表达及其活性。上述调控步骤的综合效应可通过定量蛋白质表达检测方法（如Western印迹或反相蛋白裂解物微阵列）或定性蛋白质表达检测方法（如免疫细胞化学和免疫组织化学）进行评估，但这些技术未能涵盖翻译后修饰以及酶在其高度拥挤的微环境中的功能调控等下游调控效应。此外，酶的表达水平可能与其实际活性相关性较差，因此通常采用对细胞或组织匀浆液中纯化的酶或稀释溶液中的酶进行活性测定的方法来研究酶活性。然而，这些实验无法模拟高度拥挤且具有区室化的细胞质或细胞器对酶活性的影响。更重要的是，上述所有技术仅能测定mRNA或酶表达的数量或定位，无法同时全面提供这两方面的信息，更无法将这些信息与酶活性测定结果进行整合。2，3，4
代谢定位技术能够全面反映决定酶活性的所有上述变量。更重要的是，代谢定位是一种活细胞或活组织成像方法，在分析过程中保持细胞和组织的完整性，从而获得接近自然状态的酶活性数据。该技术生成的图像不仅有助于详细观察酶活性在细胞或组织中的定位，还可对细胞或组织区室内的酶活性进行可靠的定量分析。3，4 本文所述的脱氢酶活性代谢定位实验方案，基于现有所有酶组织化学方法的实验室手册5、定量酶组织化学原理6以及定量代谢定位的图像分析技术4。
脱氢酶是一类执行氧化还原反应以还原经典辅因子（如NAD）的酶+NADP+ 以及FAD转化为NADH、NADPH和FADH2，分别。未经过化学固定的完整细胞或冷冻切片组织被孵育于一种反应介质中，该介质除其他试剂外，还包含某种特异性脱氢酶的底物、辅因子以及一种四唑盐。随后，该脱氢酶发挥其催化活性，例如将NADP还原+ 转化为NADPH。通过电子载体，2个NADPH分子最终将1个水溶性、半无色的四唑盐分子还原为1个不溶于水的蓝色甲臜分子，后者立即在脱氢酶所在位置沉淀。因此，沉淀的甲臜的吸光度可直接反映脱氢酶的局部活性，可通过光学显微镜观察，或利用单色光显微镜结合图像分析进行定量。本实验方案的定量特性使研究人员能够从这些检测中得出统计学结论。此外，这种定量方法有助于确定 原位 动力学酶参数，例如最大酶活性（V最大）以及底物对酶的亲和力（Km).3,4,5,6
在规划代谢定位实验时，需要注意每次实验建议最多使用五十张载有细胞制备物或组织切片的玻片，以尽量减少孵育过程中的时间延迟，从而获得一致的结果。如果由多名实验人员协作完成这些实验步骤，则可以处理更多的玻片和/或不同组成的培养基。此外，不同实验之间存在一定变异性。因此，对于每种细胞制备物的细胞涂片或每种组织样本的切片，应至少重复进行三次相同的实验，并且每次实验都应包含适当的对照。始终需准备一种不含底物但含有辅因子的对照孵育液，以排除非特异性酶活性染色的干扰。当对同一样本的组织切片或细胞制备物施加不同浓度的底物/辅因子时，可获得最具代表性的结果，从而使实验者能够利用剂量-活性曲线分析酶动力学。
方案
本方案遵循学术医学中心医学伦理审查委员会关于人体材料使用的规定。
1. 细胞或组织切片的制备
- 细胞
- 使用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C条件下对10 mm培养皿中的细胞消化5 min，将细胞重悬于37 °C预热的溶液中，细胞浓度为50,000–200,000个/mL，具体浓度根据细胞大小而定。
- 使用细胞离心机，在室温下以20 × g离心5分钟，通过细胞离心涂片装置将200 µL细胞悬液加到显微镜载玻片上。
- 室温下将细胞离心涂片干燥24小时。此步骤不影响脱氢酶活性。5
- 组织切片
- 根据伦理许可从患者或动物中提取组织。10 mm3 足以进行多次实验的组织量。
- 将组织块放入小型带通气孔的2 mL塑料管中，并将装有组织块的管子在液氮中迅速冷冻。
- 将含有组织块的冻存管于 −80 °C 保存，直至后续处理。
- 使用一种称为最佳切割温度（OCT）的凝胶状介质将组织样本固定在样品台（chuck）上，并迅速冷冻至 -20 °C 至 -25 °C，以防止水形成晶体。
- 使用冷冻切片机进行切片，首先修块至所需层面（理想情况下为显微镜玻片宽度的一半）， 例如 5 mm × 5 mm
- 切片时，使用毛笔和防卷板以防止切片向上卷曲。
- 以缓慢但恒定的速度（每片1秒）将组织样本切成6-10 µm厚的切片。当切片成功时，切片会在防卷板下方平整地贴附在切片刀上。
- 取1至3片组织切片置于显微镜载玻片上，于−80 °C保存备用。切片数量取决于组织样本的大小及所需的切片厚度。
2. 可溶性脱氢酶的酶组织化学/酶细胞化学
- 配制反应缓冲液。
- 配制 100 mL 正确 pH 值的磷酸盐缓冲液（参见 表1；每种酶都有其最适pH值，在该pH值下酶活性最高）。例如，将0.1 M KH₂PO₄溶液与0.1 M K₂HPO₄溶液混合2PO4 （酸性）和 0.1 M NA2HPO4 （基础）直至配制出 pH 值正确的缓冲液。
- 在通风橱中将18 g聚乙烯醇（PVA）称量至磷酸盐缓冲液中，因为PVA具有粉尘且有毒。
- 将18% w/v的PVA在磷酸盐缓冲液中于100 °C加热溶解 水浴 （将玻璃瓶放入沸水中）并搅拌，直至聚乙烯醇（PVA）完全溶解。溶液将变为透明，因搅拌会产生少量气泡。PVA完全溶解通常需要约15分钟。
注意：18% w/v 的 PVA 磷酸盐缓冲液具有较高黏度，可使用宽口移液器转移至 15 mL 反应缓冲液管中。18% w/v 的 PVA 磷酸盐缓冲液短期储存应置于 ≥40 °C 环境，长期储存（最长 2 周）应置于 ≥60 °C 环境。制备细胞涂片通常需要 250 µL 18% w/v 的 PVA 磷酸盐缓冲液，而组织切片则需要 500 µL。
- 将18% w/v的PVA在磷酸盐缓冲液中于100 °C加热溶解 水浴 （将玻璃瓶放入沸水中）并搅拌，直至聚乙烯醇（PVA）完全溶解。溶液将变为透明，因搅拌会产生少量气泡。PVA完全溶解通常需要约15分钟。
- 配制四唑盐（nitroBT）溶液。每1 mL孵育培养基需要40 µL nitroBT溶液，该溶液由5 mg nitroBT（黄色粉末）溶解于20 µL二甲基甲酰胺（DMF）和20 µL乙醇的混合液中制成，呈淡黄色透明溶液。
注意：由于硝基BT在所有必需试剂中稳定性最低，建议最后配制硝基BT储备液，并先将硝基BT溶解于反应体系中。- 将硝基BT溶于DMF和乙醇中，用本生灯短暂加热玻璃小瓶（约10秒）。加热过程中振荡小瓶，避免小瓶在火焰中停留过久，以防溶剂蒸发。
- 多配制10%的硝基BT溶液，以补偿溶解过程中二甲基甲酰胺（DMF）和乙醇的挥发。
- 用锡箔纸包裹玻璃储存瓶，避免电子载体吩嗪硫酸甲酯（PMS）或1-甲氧基-吩嗪硫酸甲酯（mPMS）以及含有m(PMS)的孵育培养基暴露于直射光下。
- 根据以下说明配制试剂溶液 表1 通过将其溶解于蒸馏水中2O. 某些试剂易迅速降解，因此应尽量在实验开始前配制。 使用前将试剂溶液置于冰上或4 °C保存。
- 按照所示准备孵育培养基 表1 每次操作后通过轻轻搅拌使溶液充分混匀。孵育过程中应持续搅拌，并保持刮刀位于孵育液液面以下，以避免孵育液中产生气泡。
- 将孵育液应用于组织切片
- 将带有细胞离心涂片或组织切片的显微镜载玻片置于免疫组织化学孵育盒中，37 °C 预热 15 分钟。将免疫组织化学孵育盒底部浸入温水中，以维持孵育环境温度恒定。
- 在移液管由细变粗的过渡处小心折断或锯断巴斯德移液管。普通巴斯德移液管的管径过细，无法吸取黏稠的孵育培养基，因此需要进行此步骤，以使移液管口径足够宽，便于吸取孵育培养基。
- 使用巴斯德移液管的宽口端，向载玻片上的每份细胞制备物或组织切片加入250–500 µL相应的孵育培养基。
- 使用移液器吸头将孵育液均匀铺开。孵育液中的微小气泡可忽略不计，因其会浮至液面，不会干扰载玻片上细胞样本或组织切片的酶促反应。
- 将细胞制备物或组织切片置于载玻片上，在37 °C培养箱中孵育（例如 组织培养孵育箱）中孵育一段预先设定的时间，具体时长取决于酶动力学及其在特定细胞制备物或组织中的表达情况（表1保持免疫组化孵育盒的盖子处于关闭状态，以维持湿润环境，防止反应缓冲液干燥。
- 清洗显微镜载玻片
- 用纸巾轻轻吸去多余的孵育液。
- 在60 °C、pH 5.3的磷酸盐缓冲液中，通过上下移动显微镜载玻片，机械冲洗去除孵育液。此步骤可终止酶促反应。
- 将显微镜载玻片置于60 °C、pH 5.3的磷酸盐缓冲液中浸泡20分钟进行清洗。
- 在60 °C的自来水中机械清洗显微镜载玻片。
- 将显微镜载玻片置于60 °C的自来水中浸泡20分钟进行清洗。
- 在1分钟内，将室温自来水与60 °C的自来水缓慢混合，使水和载玻片逐渐冷却。
- 在室温蒸馏水中进行最后一次机械清洗步骤。
- 将染色后的细胞离心涂片或组织切片封固在显微镜载玻片上
- 将载玻片加热板预热至 50–60 °C。
- 用纸巾小心擦干载玻片背面，并将其放置于载玻片加热板上，以烘干载玻片正面。
- 待玻片干燥后，使用甘油明胶封片剂和盖玻片将细胞标本或组织切片封固在显微镜载玻片上。
- 将细胞制备物或组织切片的显微镜载玻片避光保存于4 °C冰箱中，或立即进行图像采集。
3. 图像采集
- 使用具有足够动态范围（至少8位，但优选10位或12位）、固定增益和线性响应的科学级黑白CCD相机拍摄图像。
- 选择合适的物镜（细胞离心涂片使用20X-63X，组织切片使用10X-63X）。
- 通过缩小视场光阑至略大于视野范围，以减少眩光。
- 使用单色光，通过应用一个 10 nm 窄带通滤光片，位于甲臜沉淀物的等吸收波长附近7 结合红外阻断滤光片（参见 材料表).
注意：硝基BT的最大等吸收点位于585 nm。 - 优化照明条件，以确保使用相机的整个灰度范围（即， 将照明水平调整至在记录空白载玻片时达到最大亮度但不产生过曝的程度。
- 将测得的灰度值校准为已知吸光度（或光密度 [OD]）值。为此，拍摄至少包含 10 个不同灰阶的校准片或阶梯标板（具有已知 OD 值，参见步骤 4.1.1）的灰度图像，可使用市售产品（见 材料表或使用测密度光度计测量自制的灰度梯度阶跃板，并利用测量结果将测得的灰度值校准为已知的吸光度值。
- 拍摄目标细胞或组织切片的显微照片。
4. 图像分析
- 在进行图像分析之前，使用 ImageJ 软件进行吸光度测量的校准。
- 使用已知光密度（OD）值的校准玻片或阶梯平板，测量其中至少10个具有已知吸光度参数的校准区域的显微照片吸光度（OD）。在ImageJ中，使用“分析 → 测量”菜单或按快捷键Ctrl+M来测量选定区域。
- 开始吸光度校准程序，进入分析 → 校准，选择函数 "罗德巴德（NIH Image）"在打开窗口的左侧栏中，已显示4.1.1步骤中对校准片/阶梯标样各梯度进行灰度测量的结果。若无，请从ImageJ结果界面复制。在右侧栏中，输入与校准阶梯标样证书上所标注的各对应已知吸光度值。勾选复选框 "全局校准" 和 "显示图表" 并按压 "好的".
- 为质量控制，请确保 R2 Rodbard 函数的 >0.99。如果是 <0.99，检查校准玻片是否已正确拍摄并测量，以及已知的吸光度参数是否已正确输入。
- ImageJ 现已校准，此校准状态将持续至您关闭程序为止（因此 "全局校准"）。对于吸光度测量，经过校准的 ImageJ 会话始终将观测到的吸光度均值转换为介于 0 和 1 之间的数值，其中 0 和 1 分别代表无吸光度和完全吸光度的渐近值。
- 用于细胞离心涂片，选择 >随机选取100个单细胞。对于组织切片，在所有切片中选择一个或多个固定长度和宽度的感兴趣区域。
- 在显微照片上投影栅格以辅助无偏倚的细胞选择。在 ImageJ 中，通过插件 → 分析 → 栅格菜单在图像上投影网格。
- 在 ImageJ 中，使用椭圆工具选择单个细胞，使用矩形工具选择组织区域。
- 测量所选细胞或组织区域的吸光度和面积。光密度和面积被称为 "平均值" 和 "面积" 分别在 ImageJ 结果电子表格中。
注意：一个细胞或组织区域的总吸光度（如果您选择了多个不同大小的组织区域）等于所有独立像素吸光度的总和。如果一个细胞由1000个像素成像，则总吸光度为这1000个吸光度值的总和，平均吸光度为总吸光度除以1000。该方法还可避免分布误差。 - 测定总吸光度的平均值 >对照载玻片中的30个细胞或组织区域，该载玻片包含暴露于对照孵育介质但无底物、有辅因子的样本。此对照吸光度用于校正非特异性酶活性染色以及由所用显微镜载玻片、封片介质、盖玻片或显微镜引起的吸光度伪影。
- 从暴露于含有相同辅因子浓度（但底物和/或抑制剂浓度不同）的孵育介质的样品的所有总吸光度测量值中，减去平均对照吸光度。由此得到细胞或组织区域的校正后总吸光度。
- 使用学生t检验或单因素方差分析（ANOVA），根据实验设计对校正后的总吸光度平均值进行统计学比较。
- 甲臜吸光度可通过朗伯-比尔定律转换为酶活性（每分钟每毫升反应体系中转化的底物微摩尔数，µmol/min/mL）：c = A / (ε × d)，其中 c 为反应体系中甲臜的浓度，A 为经 ImageJ 校准后测得的吸光度值，ε 为甲臜在 585 nm 处的摩尔吸光系数（16.000），d 为光程长度（单位：cm）8 d 为光传播距离，等于平均细胞厚度或名义切片厚度（本方案中为 6–10 µm）。
注意：干燥后，组织切片的厚度相比标称切片厚度减少约50%，但上述计算未体现此变化，因为标称切片厚度在生物学上最具相关性。附着于显微镜玻片上的细胞样本的平均细胞厚度及球体尺寸可通过共聚焦显微镜或宽场显微镜测定，相关实验方案可参见其他文献。9,10
结果
为研究特定脱氢酶的活性，提供了多种制备孵育培养基的方案。针对每种脱氢酶，将所列试剂溶解于PVA溶液中，同时保持温度不低于 37 °C试剂应按照表格中列出的顺序依次溶解。 即 硝基BT总是先溶解，(m)PMS总是最后溶解。每5 mg硝基BT溶于 40 µL 混合（20 µL 乙醇 + 20 µL 二甲基甲酰胺）。所有体积均针对 1 mL 18% PVA 溶液，该溶液可用于染色约 2 个组织切片或约 4 个载玻片上的细胞样本。NitroBT，NAD+NADP+，ADP 和底物溶液应新鲜配制。NaN3，MgCl2 以及 (m)PMS 溶液可在 4 °C 一个月。溶解于磷酸盐缓冲液中的18% PVA可在 60 °C 持续2周。可通过不同比例的0.1 M磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶液调节18% PVA溶液的pH值。2PO4）和 0.1 M 磷酸氢二钠（Na2HPO4）缓冲液。所示的孵育时间可作为良好的起始参考，但最佳孵育时间取决于物种、组织类型及组织保存状态。通常情况下，为了获得相似水平的甲臜生成，细胞制备物的孵育时间应长于组织切片。
野生型异柠檬酸脱氢酶1和2（IDH1/2）分别在细胞质和线粒体中催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸（αKG），同时将NADP+还原为NADPH。这些酶近年来受到关注，因为IDH1/2基因突变存在于多种人类癌症中，包括原发性脑癌（胶质母细胞瘤）和结直肠癌，为展示代谢成像的可能性提供了独特机会。IDH1基因突变不仅使IDH1野生型酶活性丧失，还诱导产生一种新的酶活性，导致致癌代谢物D-2-羟基戊二酸（D-2HG）的生成并随之积累11，这一现象在其他文献中有详细讨论12。代谢成像实验显示，在携带敲入型杂合IDH1突变的结直肠癌细胞中，NADP+依赖的IDH1/2酶活性显著低于IDH1野生型的结直肠癌细胞（图1A）。该差异通过单色光显微图像的图像分析进行了量化（图1B）12。
另一个代谢图谱实验的示例见图2，该图显示了注射了人源胶质母细胞瘤细胞的小鼠脑组织冰冻切片图像。IDH1/2 是人脑中最重要的 NADPH 供体，在野生型IDH1/2胶质母细胞瘤中其活性上调，而啮齿类动物脑组织中 IDH1/2 的 NADPH 生成能力则显著较低。11 图2A展示了人源胶质母细胞瘤细胞中高水平的依赖 NADP+ 的 IDH1/2 活性与健康小鼠脑组织中低水平的依赖 NADP+ 的 IDH1/2 活性之间的差异。IDH1/2 活性在图2B中以每分钟每毫升组织产生的 µmol NADPH 量进行定量。
IDH1/2 的酶促反应相对简单，而乳酸脱氢酶（LDH）则是一种更为复杂的酶复合物。LDH 催化乳酸与丙酮酸之间的可逆转化，同时伴随 NAD+ 的还原+ NADH 或反之亦然。乳酸和丙酮酸的可用性以及乳酸脱氢酶（LDH）酶复合物的组成决定了乳酸主要转化为丙酮酸（由 LDH-B 催化，生成 NADH）还是丙酮酸主要转化为乳酸（由 LDH-A 催化，消耗 NADH）。13 代谢成像实验能够可视化LDH-B反应的活性，但由于不产生NADH，因而无法还原硝基蓝四氮唑盐（nitroBT）生成甲臜，故该方法对LDH-A反应的活性“不敏感”。 图3 显示 NAD+-依赖的LDH活性（即 人脑切片中在无底物条件下乳酸转化为丙酮酸图3A)，在高浓度乳酸存在下（图3B），在 6 mM 乳酸存在下（图3C）以及在乳酸浓度较低而丙酮酸浓度较高的情况下（图 3D）。这些实验结果充分表明，代谢图谱能够有效捕捉到NAD+组织切片中依赖于乳酸和丙酮酸的LDH活性取决于反应体系中乳酸和丙酮酸的可利用性。
图1．人结肠直肠癌细胞中依赖 NADP+ 的 IDH1/2 活性。（A）HCT116 人结肠直肠癌细胞经针对 1–10 mM 异柠檬酸和 0.8 mM NADP+ 的依赖 NADP+ 的 IDH1/2 活性染色后，在单色光下的显微照片。比例尺 = 50 µm。（B）利用（A）中的单色光图像及图像分析，对每个细胞中由依赖 NADP+ 的 IDH1/2 活性通过硝基BT生成的蓝色甲臜吸光度进行定量。缩写：IDH1WT/WT，异柠檬酸脱氢酶1野生型；IDH1WT/MUT，异柠檬酸脱氢酶1突变型。请点击此处查看该图的放大版本。
图2．人胶质母细胞瘤样本中依赖NADP+的IDH1/2酶活性。（A）小鼠脑组织切片的代表性显微照片，显示健康小鼠脑组织（h）和人胶质母细胞瘤异种移植瘤（t），经染色检测在0.8 mM NADP+和2 mM异柠檬酸存在条件下的NADP+依赖性IDH1/2活性。比例尺 = 200 µm。（B）利用朗伯-比尔定律对（A）图中所示的小鼠脑组织区域（h）和人胶质母细胞瘤异种移植瘤区域（t）进行酶活性定量分析。误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
图3．人脑样本中依赖NAD+的乳酸脱氢酶（LDH）活性。 人脑样本连续切片经染色显示依赖NAD+的LDH活性的代表性显微照片：（A）实验组；（B）对照条件（无底物和丙酮酸，仅含3 mM NAD+）；（C）含150 mM乳酸但无丙酮酸；（D）含6 mM乳酸且无丙酮酸，以及含6 mM乳酸同时含18 mM丙酮酸（乳酸转化为丙酮酸反应的竞争性产物抑制剂）。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 酶： | G6PDH | LDH | SDH | MDH | IDH1 | IDH2 | IDH3 | 6PGD | GDH |
| 100 mM 磷酸盐缓冲液中的 18% PVA | 1 mL；pH = 7.4 | 1 mL；pH = 7.4 | 1 mL；pH = 8.0 | 1 mL；pH = 7.4 | 1 mL；pH = 7.4 | 1 mL；pH = 7.4 | 1 mL；pH = 7.4 | 1 mL；pH = 8.0 | 1 mL；pH = 8.0 |
| 5 mM 硝基BT | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 | 5 mg/40 µL 混合液 |
| 5 mM NaN3 | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL |
| 5 mM MgCl2 | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | |||
| 3 mM NAD+ | 10 µL | 10 µL | 10 µL | ||||||
| 0.8 mM NADP | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | ||||
| 2 mM ADP | 10 µL | ||||||||
| 底物 | 10 mM 葡萄糖-6-磷酸 | 150 mM 乳酸 | 50 mM 琥珀酸 | 100 mM 苹果酸 | 2 mM 异柠檬酸 | 2 mM 异柠檬酸 | 2 mM 异柠檬酸 | 10 mM 6-磷酸-半乳糖酸 | 10 mM 谷氨酸 |
| 0.32 mM mPMS | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | ||||
| 0.2 mM PMS | 10 µL | 10 µL | 10 µL | 10 µL | |||||
| 孵育时间 | 5 分钟 | 30 分钟 | 60 分钟 | 60 分钟 | 30 分钟 | 30 分钟 | 30 分钟 | 10 分钟 | 30 分钟 |
表1. 脱氢酶代谢定位实验方案的示意图概述。 缩写：ADP，腺苷二磷酸；(m)PMS，（甲氧基）-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐；nitroBT，硝基四氮唑蓝氯化物；G6PDH，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；LDH，乳酸脱氢酶；SDH，琥珀酸脱氢酶；MDH，苹果酸脱氢酶；IDH，异柠檬酸脱氢酶；6PGD，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；GDH，谷氨酸脱氢酶。
讨论
目前，细胞代谢研究正经历一场复兴，因为研究人员意识到代谢效应在多种疾病的发病机制和治疗中至关重要。1 此外，随着越来越多的技术手段不断涌现，代谢研究领域拥有了前所未有的工具支持，包括质谱分析、放射性同位素标记以及核磁共振波谱分析。代谢图谱技术绝非新近出现，但其能够在近乎接近自然状态的条件下，提供有关酶活性的整体信息，这使得该技术比以往任何时候都更具重要性。2
辅因子 NAD+ 和 NADP+ 存在于所有活细胞中，这表明脱氢酶在进化早期就已出现，并在细胞代谢中发挥关键作用。14,15 目前已有 523 种酶促反应被归类为脱氢酶反应，且在所有物种中均有发生。16 理论上，通过调整本文所述的代谢定位实验方案，可分别研究所有不同类型脱氢酶的活性。每种酶促反应在其所需的底物和辅因子方面均具有独特性。因此，可通过在反应体系中使用适当的底物和辅因子，利用代谢定位实验测定每种酶促反应的活性。然而，某些酶的同工型在亚细胞定位上存在差异，例如，一种同工型在细胞质中催化反应，而另一种同工型则在线粒体中发挥作用。一个显著的例子是 IDH1 和 IDH2，前者位于细胞质，后者位于线粒体，它们是由两个不同基因编码的两种不同蛋白质。11 1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐（methoxy-PMS）和 5-甲基吩嗪甲基硫酸盐（PMS）均可作为这些实验中的电子载体。前者不能透过线粒体膜，而后者可以。因此，针对线粒体酶（例如 IDH2）的研究应使用 PMS，而针对胞质酶（例如 IDH1）的研究则应使用 mPMS。
与许多技术一样，该方案也存在一些变体，例如使用不同类型的四唑盐、省略PMS和叠氮化钠的添加、使用水性封片介质，以及改变孵育和漂洗时间等，这些变体同样可能获得良好的效果。四唑盐用于代谢定位的应用不仅限于脱氢酶。通过对本方案进行少量修改，还可用于评估代谢途径中位于脱氢酶上游的酶活性。我们此前已描述过该原理在谷氨酰胺酶检测中的应用，17 在谷氨酰胺分解途径中，该酶直接作用于谷氨酸脱氢酶的上游。18 理论上，相同的原理可应用于直接位于脱氢酶上游或下游起作用的其他酶 例如 位于三羧酸（TCA）循环中 IDH2 和 IDH3 直接上游的乌头酸酶。另一种简单的浓度变化方法是依据表1所述，制备含有不同浓度底物、辅因子和/或抑制剂的孵育培养基小瓶。该方法可生成以底物、辅因子和/或抑制剂浓度为函数的剂量-活性曲线。
从技术上讲，代谢图谱实验并不支持对代谢过程的无偏倚观察 原位 酶活性，因为研究人员必须选择底物和辅因子浓度，而这些浓度可能无法反映实际存在的底物和辅因子水平 原位此外，反应体系中使用黏稠的18% PVA有助于保持大分子的完整性、空间位置和构象，但会阻碍小分子量试剂在反应体系中的有效扩散。3,5 因此，本实验中所采用超生理底物浓度测得的酶活性并不能反映 体内 在特定底物浓度下的情况，但适用于实验内的比较。因此，代谢定位实验的结果反映了在现有底物和辅因子水平条件下，酶促反应的生产能力（最大活性） 原位此外，通过使用不同浓度的底物和/或辅因子以及多个样本，可对最大生产能力（V最大）和亲和力（Km细胞提取物、组织或组织区域中酶对底物/辅因子的亲和力（Km）和最大反应速率（Vmax）。这些参数是酶蛋白表达水平、翻译后修饰以及拥挤的微环境对酶活性影响的综合结果。因此，代谢定位技术相较于仅测定蛋白表达水平或纯化酶活性的实验，能更真实地反映酶的实际活性状态 体外.
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
R.J.M. 获得 AMC 博士奖学金支持。本研究获得荷兰癌症协会（KWF 基金 UVA 2014-6839）资助。作者感谢 A. Jonker 博士在撰写本实验方案过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5′-二磷酸腺苷钠盐 | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| D-葡萄糖-6-磷酸钠盐 | Sigma-Aldrich | G7879 | |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Merck Millipore | 106559 | |
| 琥珀酸二钠 | Sigma-Aldrich | W327700 | |
| DL-异柠檬酸三钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | I1252 | |
| D-苹果酸 | Sigma-Aldrich | 2300 | |
| 甘油明胶 | Sigma-Aldrich | GG1 | |
| L-谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| 6-磷酸-D-半乳糖酸锂 | Sigma-Aldrich | 55962 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 甲氧基吩嗪硫酸甲酯 | Serva | 28966.01 | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Sigma-Aldrich | N0505 | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 | Sigma-Aldrich | NADP-RO | |
| 氯化硝基四氮唑蓝 | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| 吩嗪硫酸甲酯 | Serva | 32030.01 | |
| 聚乙烯醇，完全水解 | Sigma-Aldrich | P1763 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Merck Millipore | 104873 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| L-乳酸钠 | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| 带通滤光片 | Edmund optics | https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/ | |
| 灰阶阶梯楔 | Stouffer Industries | http://www.stouffer.net/TransPage.htm |
参考文献
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