16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

摘要

本文描述了一种高通量16S rRNA扩增子测序的详细标准化方案。该方案从粪便样本采集到数据分析，提供了一套整合性、统一性、可行且低成本的操作流程。本方案能够以严格的质控标准和多个对照，实现对大量样本的分析。

摘要

人类肠道微生物组在保护细胞免受损伤、能量和营养物质代谢以及促进免疫功能方面发挥着核心作用。肠道菌群组成偏离健康状态（即菌群失调）可能损害重要生理功能，导致病理状况的发生。近年来持续开展的研究工作致力于表征微生物组成与人类健康及疾病之间的关联。

高通量测序技术的进步使得肠道微生物组成的表征成为可能。这些方法包括16S rRNA扩增子测序和宏基因组测序。16S rRNA扩增子测序用于分析分类学组成，而宏基因组测序则提供有关基因预测和功能注释的额外信息。采用针对16S rRNA基因可变区的靶向测序方法的一个优势是，其成本显著低于宏基因组测序。16S rRNA基因的序列差异被用作微生物指纹，以鉴定和定量单个样本中的不同分类群。

目前，多项国际性工作已制定了16S rRNA扩增子测序的标准。然而，多项研究报道，批次效应是导致结果变异的一个常见来源。为最大限度减少这一影响，必须实施统一的样本采集、处理和测序操作流程。本方案整合了从粪便样本采集到数据分析的多个广泛使用的标准流程。该方案包含一种无需离心柱的直接PCR方法，可同时处理大量粪便样本并进行DNA提取，以及对V4区进行PCR扩增。此外，本方案还描述了数据分析流程，并提供了基于最新版本QIIME（QIIME 2 2017.7.0版）和DADA2的分析脚本。这一逐步操作的实验方案旨在为希望以稳健、可重复、易于使用且详尽的方式开展16S rRNA扩增子测序的研究人员提供指导。

引言

人们已投入大量努力以更好地理解微生物组的多样性和丰度，这是揭示个体在健康与病理状态下差异与相似性的另一个方面。年龄^2,3、地理⁴、生活方式^5,6以及疾病⁵已被证明与肠道微生物组的组成相关，但许多条件和人群尚未得到充分表征。最近有报道称，微生物组可被改造用于治疗目的^7,8,9。因此，进一步了解各种生理状态与微生物组成之间的关系，是优化未来潜在干预措施的第一步。

传统的微生物培养方法受限于较低的产量^10,11，且通常被概念化为一种二元状态，即细菌在肠道中要么存在，要么不存在。基于DNA的高通量测序技术已彻底改变了微生物生态学研究，使得能够全面捕获微生物群落中的所有成员。然而，测序读长和质量仍然是准确进行分类学注释的重要障碍

方案

本研究已获得谢巴当地研究伦理委员会的伦理批准，所有方法均按照相关指南和规定进行。由于所使用的粪便样本已作为临床检查的一部分提交至微生物学核心实验室，且除年龄、性别和微生物检测结果外不包含任何可识别的患者信息，因此该研究方案获得了当地伦理审查委员会的患者知情同意豁免。对健康志愿者已获取书面知情同意，且本研究已获得机构审查委员会批准。其中部分样本此前已在一项分析中使用过¹。

1. 样品处理

1. 使用无菌棉签从新鲜粪便样本中采集约 5 mm² 的样本（大小约相当于铅笔橡皮擦），置于试管中（参见材料表）。所有含粪便样本的棉签须在 24 小时内储存于 -80 °C。粪便棉签可在此温度下保存至后续处理。

2. DNA 提取

1. 在室温下解冻提取液和稀释液（见材料表）。
2. 将粪便采样拭子转移至一个空的2 mL收集管中（见材料表）。使用干净的剪刀剪短拭子柄，以确保管盖能够闭合，并尽量减少交叉污染。向每支含有粪便拭子的收集管中加入250 μL提取液，并涡旋混匀。
3. 将样本置于沸水浴中加热10分钟（95–100 °C）。向每个样本中加入250 μL稀释液，并涡旋....

结果

该实验方案的示意图见图1。

我们前瞻性地收集了因疑似感染性腹泻而住院患者的粪便样本。这些样本于2015年2月至5月期间提交至谢巴医学中心的临床微生物学实验室，具体方法如前所述¹。粪便样本同时接受了临床微生物学实验室进行的传统微生物培养以及广谱高通量16S测序分析。此外，还对健康成人的粪便样本进行了测序，以作比较。

本分析重点关注数据的质量控制，并展示从 QIIME2¹⁷ 获得的输出结果的代表性数据。首先，对6个阴性对照样本的测序结果进行了质量控制审查，包括：i) 无模板的PCR反应，ii) 对提取和稀释溶液中洁净无菌棉签的PCR反应，以及iii) 对混合提取和稀释溶液的PCR反应.......

讨论

16S rRNA扩增子测序和宏基因组鸟枪法测序在临床微生物学应用中日益普及^21,22,23。这些技术的优势在于能够更全面地捕获可培养和不可培养的分类单元，提供关于病原接种物相对丰度的数据，并能更精确地识别多微生物感染特征²⁴。微生物组研究领域的进展产生了大量数据，但由于各种研究方法缺乏一致性，这些数据难以相互比较。近年来，多个研究联盟已尝试解决其中部分问题。本实验方案的文库构建流程与地球微生物组计划（Earth Microbiome Project, EMP）类似，但额外提供了从粪便样本中提取DNA直至分析流程的详细分步操作指南。

既往研究已采用16S rRNA测序技术分析健康非住院个体及疑似感染性腹泻住院患者的粪便样本微生物组成模式，并与传统培养结果进行比较。该分析结果显示，住院患者的变形菌门（Proteobacteria）分类群丰度显著升高

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
引物	Integrated DNA Technologies (IDT)
提取液	Sigma-Aldrich	E7526
稀释液	Sigma-Aldrich	D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR 预混液
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒	Invitrogen	P7589	dsDNA 定量试剂
MinElute 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28606
琼脂糖	Amresco	0710-250G
超纯无 DNase 和 RNase 水	Biological Industries	01-866-1A
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Molecular probes	Q32854	dsDNA 检测试剂盒
High Sensitivity D1000	Agilent Technologies	Screen Tape 5067-5582	分离与分析
Screen Tape 检测	Agilent Technologies	试剂 5067-5583	用于 DNA 文库
PhiX Control v3	Illumina	15017666	对照文库
MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）	Illumina	MS-102-2003
溴化乙锭	Amresco	E406-10mL-TAM
2 mL 收集管	SARSTEDT	72.695.400	Safe Seal 收集管
聚丙烯试管中的塑料棒状拭子	STERILE INTERIOR	23117
名称	公司	目录编号	备注
设备
PCR 仪	Applied Biosystems	2720 Thermal Cycler
测序仪	Illumina	Miseq
PCR 工作站	Biosan	UV-cleaner
剪刀
涡旋振荡器	Scientific Industries	Vortex-Genie 2