方法文章

16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

DOI：

10.3791/56845

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2018年3月19日

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1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

本文内容

摘要

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本文描述了一种高通量16S rRNA扩增子测序的详细标准化方案。该方案从粪便样本采集到数据分析，提供了一套整合性、统一性、可行且低成本的操作流程。本方案能够以严格的质控标准和多个对照，实现对大量样本的分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类肠道微生物组在保护细胞免受损伤、能量和营养物质代谢以及促进免疫功能方面发挥着核心作用。肠道菌群组成偏离健康状态（即菌群失调）可能损害重要生理功能，导致病理状况的发生。近年来持续开展的研究工作致力于表征微生物组成与人类健康及疾病之间的关联。

高通量测序技术的进步使得肠道微生物组成的表征成为可能。这些方法包括16S rRNA扩增子测序和宏基因组测序。16S rRNA扩增子测序用于分析分类学组成，而宏基因组测序则提供有关基因预测和功能注释的额外信息。采用针对16S rRNA基因可变区的靶向测序方法的一个优势是，其成本显著低于宏基因组测序。16S rRNA基因的序列差异被用作微生物指纹，以鉴定和定量单个样本中的不同分类群。

目前，多项国际性工作已制定了16S rRNA扩增子测序的标准。然而，多项研究报道，批次效应是导致结果变异的一个常见来源。为最大限度减少这一影响，必须实施统一的样本采集、处理和测序操作流程。本方案整合了从粪便样本采集到数据分析的多个广泛使用的标准流程。该方案包含一种无需离心柱的直接PCR方法，可同时处理大量粪便样本并进行DNA提取，以及对V4区进行PCR扩增。此外，本方案还描述了数据分析流程，并提供了基于最新版本QIIME（QIIME 2 2017.7.0版）和DADA2的分析脚本。这一逐步操作的实验方案旨在为希望以稳健、可重复、易于使用且详尽的方式开展16S rRNA扩增子测序的研究人员提供指导。

引言

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人们已投入大量努力以更好地理解微生物组的多样性和丰度，这是揭示个体在健康与病理状态下差异与相似性的另一个方面。年龄2,3、地理4、生活方式5,6以及疾病5已被证明与肠道微生物组的组成相关，但许多条件和人群尚未得到充分表征。最近有报道称，微生物组可被改造用于治疗目的7,8,9。因此，进一步了解各种生理状态与微生物组成之间的关系，是优化未来潜在干预措施的第一步。

传统的微生物培养方法受限于较低的产量10,11，且通常被概念化为一种二元状态，即细菌在肠道中要么存在，要么不存在。基于DNA的高通量测序技术已彻底改变了微生物生态学研究，使得能够全面捕获微生物群落中的所有成员。然而，测序读长和质量仍然是准确进行分类学注释的重要障碍12。此外，基于高通量的实验可能受到批次效应的影响，即测量结果受到非生物或非科学变量的干扰13。近年来，已启动多个项目以研究人类微生物组，包括美国肠道项目（American Gut Project）、美国人类微生物组计划（US Human Microbiome Project）以及英国MetaHIT项目。这些计划产生了大量数据，但由于研究方法缺乏一致性，数据之间难以直接比较。一些国际项目，如国际人类微生物组联盟（International Human Microbiome Consortium）、国际人类微生物组标准项目（International Human Microbiome Standards Project）以及美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST），已尝试解决其中部分问题14，并制定了微生物组测量的标准，以期实现可靠且可重复的研究结果。本文描述了一种整合性实验流程，结合了多种广泛应用的方法15,16，用于从粪便样本采集到数据分析的16S rRNA高通量测序（16S-seq）。该流程采用一种无柱式PCR方法，最初设计用于植物DNA的直接提取16，可在相对较短的时间内同时处理大量粪便样本，并获得高质量的扩增DNA，用于在通用测序平台上对微生物16S rRNA基因的可变区V4进行靶向测序。本实验方案旨在为希望开展16S rRNA扩增子测序研究的科研人员提供一种稳健、可重复、易于操作且详尽的技术指导，并包含关键的实验对照。通过提供系统化、分步详述的操作流程，可最大限度地减少批次效应，从而提高不同实验室之间测序结果的可比性。

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方案

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本研究已获得谢巴当地研究伦理委员会的伦理批准，所有方法均按照相关指南和规定进行。由于所使用的粪便样本已作为临床检查的一部分提交至微生物学核心实验室，且除年龄、性别和微生物检测结果外不包含任何可识别的患者信息，因此该研究方案获得了当地伦理审查委员会的患者知情同意豁免。对健康志愿者已获取书面知情同意，且本研究已获得机构审查委员会批准。其中部分样本此前已在一项分析中使用过1。

1. 样品处理

  1. 使用无菌棉签从新鲜粪便样本中采集约 5 mm2 的样本（大小约相当于铅笔橡皮擦），置于试管中（参见材料表）。所有含粪便样本的棉签须在 24 小时内储存于 -80 °C。粪便棉签可在此温度下保存至后续处理。

2. DNA 提取

  1. 在室温下解冻提取液和稀释液（见材料表）。
  2. 将粪便采样拭子转移至一个空的2 mL收集管中（见材料表）。使用干净的剪刀剪短拭子柄，以确保管盖能够闭合，并尽量减少交叉污染。向每支含有粪便拭子的收集管中加入250 μL提取液，并涡旋混匀。
  3. 将样本置于沸水浴中加热10分钟（95–100 °C）。向每个样本中加入250 μL稀释液，并涡旋混匀。
  4. 将含有提取DNA和拭子的2 mL管置于4 °C保存。

3. PCR 与文库构建

在执行步骤 3.1 和 3.2 时，应在提供洁净、无模板和无扩增子污染环境的 PCR 工作站中操作。

  1. 根据条形码标记引物（表1）。将每种引物用双蒸水（DDW）稀释至50 μM浓度，并于-20 °C保存。
  2. 使用96孔板进行PCR反应。每块板可包含32个不同的样本，由32种不同的索引引物标记。将正向引物和32种反向引物在室温下解冻，并稀释至5 μM。
  3. 配制100次PCR反应的混合液（每孔终体积为20 μL）：混合100 μL的5 μM正向引物、1 mL 2× PCR预混液和400 μL双蒸水。向每个孔中加入15 μL该PCR混合液（共96孔）。向3个不同的孔中各加入1 μL的5 μM带索引的反向引物（32种不同引物设三个重复，共96孔）。
  4. 在专用于预PCR操作的区域（即无模板和扩增子污染的洁净工作台）中，向每个反应体系中加入4 μL提取的DNA样本（每个提取的DNA样本进行三个重复扩增——每块96孔板包含32个样本）。
  5. 按以下程序运行PCR：94 °C预变性3分钟；随后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性1分钟、55 °C退火1分钟、72 °C延伸1分钟；最后72 °C终延伸10分钟。
  6. 在另一指定为后PCR操作区的工作台上，将每个样本的三个重复PCR反应产物合并至同一离心管中（每个样本共60 μL）。
  7. 为评估PCR扩增产物的质量，取每份合并后的PCR反应产物4 μL，在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳。在260 nm紫外光下，阳性扩增产物应显示大小为375–425 bp的预期条带。仅这些产物进入后续步骤。
    注意：每个样本进行三个重复扩增，即每个样本在三个独立的PCR反应中扩增。请勿按比例放大反应体系。

4. 文库定量与纯化

  1. 为了获得所有PCR样本的等摩尔浓度混合物，使用双链DNA（dsDNA定量试剂）荧光核酸染料（参见材料表）对每个扩增子进行定量，该方法适用于同时定量大量样本。
    注意：由于扩增子的大小范围不确定，实际加载等摩尔浓度时应以纳克（ng）为单位的准确质量为准。
  2. 将每种样本各500 ng加入同一无菌离心管中，涡旋振荡以充分混匀。
  3. 取200 μL混合文库在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶上电泳。根据试剂盒说明书（参见材料表），使用凝胶回收试剂盒从凝胶中切回收375–425 bp的条带，并将回收的文库洗脱于80 μL去离子水（DDW）中。
    注意：应对混合文库进行片段大小选择，以减少宿主DNA产生的非特异性扩增产物。
  4. 根据制造商说明书，使用高灵敏度dsDNA检测试剂盒测定最终文库浓度（参见材料表）。同时根据制造商说明书，使用高灵敏度DNA文库分离与分析试剂盒精确测定文库片段大小（参见材料表）。

5. 测序

  1. 根据测序仪的操作规程，用20%的对照文库将混合文库稀释至7 pM（参见材料表）。
  2. 测序时使用定制设计的读段引物，该引物与V4扩增引物互补（参见表1）。
  3. 使用第三个定制设计的测序引物，在额外的一个循环中读取条形码（参见表1），并按照制造商的规格生成每端175个碱基长度的双端测序读段（paired-end reads）。
  4. 运行测序仪，并按照制造商的方案获得FASTQ文件。

6. 数据处理

  1. 使用 QIIME 2 版本 2017.7.0 实现的数据整理流程，将重叠的成对末端 FASTQ 文件拼接并进行处理17。根据样本特异性条形码对读段进行解复用。
  2. 使用 DADA218 进行质量控制和序列变体（SVs）检测。从 3' 端截去 13 个碱基，从 5' 端截去 15 个碱基，丢弃预期错误数超过 2 的读段。采用共识方法识别并去除嵌合体——在每个样本中单独检测嵌合体，并去除在足够比例样本中被鉴定为嵌合体的序列。
  3. 使用基于 2013 年 8 月版本 99% 相似性 Greengenes 数据库训练的朴素贝叶斯分类器，对 175 条长读段及正向/反向引物组进行 SVs 的分类学注释6。
  4. 将所有样本稀疏化至 2,146 条序列的深度。
  5. 在稀疏化后的样本上使用未加权 UniFrac 方法测量 β-多样性（样本间多样性19,20），以避免样本量效应。
  6. 利用所得距离矩阵进行主坐标分析（PCoA）。
    注：数据处理脚本和映射文件作为补充材料提供（补充材料 1 和 2）。

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结果

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该实验方案的示意图见图1。

我们前瞻性地收集了因疑似感染性腹泻而住院患者的粪便样本。这些样本于2015年2月至5月期间提交至Sheba医疗中心临床微生物学实验室，具体方法如前所述1。粪便样本同时接受了临床微生物学实验室进行的传统微生物培养以及广谱高通量16S测序分析。此外，还对健康成人的粪便样本进行了测序，以作比较。

本分析重点关注数据的质量控制，并展示使用 QIIME217 获得的输出结果的代表性数据。首先，对6个阴性对照样本的测序结果进行了质量控制审查，包括：i) 无模板的PCR反应，ii) 对提取和稀释溶液中洁净且无菌的拭子进行PCR扩增，以及iii) 对混合的提取和稀释溶...

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讨论

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16S rRNA扩增子测序和宏基因组鸟枪法测序在临床微生物学应用中日益普及21,22,23。这些技术的优势在于能够更全面地捕获可培养和不可培养的分类单元，提供关于病原接种物相对丰度的数据，并能更精确地识别多微生物感染特征24。微生物组研究领域的进展产生了大量数据，但由于各种研究方法缺乏一致性，这些数据难以相互比较。近年来，多个研究联盟已尝试解决其中部分问题。本实验方案的文库构建流程与地球微生物组计划（Earth Microbiome Project, EMP）类似，但额外提供了从粪便样本中提取DNA直至分析流程的详细分步操作指南。

既往研究已采用16S rRNA测序技术分析健康非住院个体及疑似感染性腹泻住院患者的粪便样本微生物组成模式，并与传统培养结果进行比较。该分析结果显示，住院患者的变形菌门（Proteobacteria）分类群丰度显著升高

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作部分由 I-CORE 项目（资助号 41/11）、以色列科学基金会（资助号 908/15）以及欧洲克罗恩病和结肠炎组织（ECCO）资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
引物Integrated DNA Technologies (IDT)
提取液Sigma-AldrichE7526
稀释液Sigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR 预混液
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒InvitrogenP7589dsDNA 定量试剂
MinElute 凝胶回收试剂盒Qiagen28606
琼脂糖Amresco0710-250G
超纯无 DNase 和 RNase 水Biological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Molecular probesQ32854dsDNA 检测试剂盒
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582分离与分析
Screen Tape 检测Agilent Technologies试剂 5067-5583用于 DNA 文库
PhiX Control v3Illumina15017666对照文库
MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）IlluminaMS-102-2003
溴化乙锭AmrescoE406-10mL-TAM
2 mL 收集管SARSTEDT72.695.400Safe Seal 收集管
聚丙烯试管中的塑料棒状拭子STERILE INTERIOR23117
名称公司目录编号备注
设备
PCR 仪Applied Biosystems2720 Thermal Cycler
测序仪IlluminaMiseq
PCR 工作站BiosanUV-cleaner
剪刀
涡旋振荡器Scientific IndustriesVortex-Genie 2

参考文献

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16S rRNA DNA PCR V4 QIIME 2 DADA2

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