本方案描述了纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）之间的相互作用。实验结果表明，生物膜干涉技术（BLI）可能成为一种用于新型小分子离子通道配体筛选的潜在方法。
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摘要
摘要
生物膜层干涉技术（BLI）是一种用于检测蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用的有效工具。本文首先介绍了这种新型无标记技术在研究人源EAG1（hEAG1）通道蛋白与小分子PIP2相互作用中的应用。由于hEAG1通道在多种癌症中异常高表达，并且存在一些与神经系统疾病相关的功能获得性突变，因此被认为是一个潜在的治疗靶点。我们从哺乳动物稳定表达系统中纯化了 hEAG1通道蛋白，并利用BLI技术检测其与PIP2的相互作用。成功测定hEAG1蛋白与PIP2之间的结合动力学表明，BLI技术可作为离子通道药理学中新型小分子配体筛选的一种潜在高通量方法。
引言
利用小分子靶向细胞表面可及的离子通道蛋白，在配体筛选和生物药物发现方面具有巨大潜力1,2,3因此，需要一种合适的工具来研究离子通道与 小分子及其相应功能。膜片钳记录技术已被证明是在离子通道功能检测中具有独特性和不可替代性的方法。然而，确定小分子是否直接作用于离子通道还需要借助其他技术。传统上，放射性配体结合实验被用于观察小分子与其靶向离子通道蛋白之间的结合动力学。但由于该技术需要进行放射性标记与检测，其应用受到限制。此外，研究中对小分子配体进行标记的先决步骤，使其无法应用于许多尚未发现特异性配体的离子通道。一些无标记技术，如核磁共振波谱法、X射线衍射、微尺度热泳动（MST）4 表面等离子共振（SPR）已被用于检测蛋白质与小分子之间的相互作用。然而，由于难以获得全长蛋白质、动力学分辨率低、通量低以及成本高等因素，这类检测通常无法提供足够的信息5与这些技术相比，生物膜干涉技术（BLI）正作为一种新兴的无标记方法出现，通过将微量蛋白质样品固定在生物传感器表面并检测光学信号的变化，从而克服上述在检测蛋白质-小分子相互作用时的局限性。6,7
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方案
注意：通过将含有在远端C末端带有FLAG标签的hEAG1 DNA序列的pCDH慢病毒质粒转染至HEK-293T细胞，随后进行嘌呤霉素抗性筛选，构建稳定表达FLAG标记的hEAG1通道蛋白的HEK-293T细胞系，具体方法如前所述15。
1. 从 HEK-293T 细胞中亲和纯化 FLAG 标签标记的人源 hEAG1 通道蛋白
- 迅速将稳定表达 hEAG1 通道的细胞从液氮中取出并放入温水（37 °C）中解冻。将细胞（约 5 × 106 冻存细胞）接种至 10 cm 培养皿中。在含 8 mL 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 4 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养过夜，并于次日更换培养基。
- 使用荧光显微镜检测这些 HEK-293T 细胞的 GFP 荧光，以确认在培养体系中高比例的细胞稳定表达 hEAG1 通道。在室温下用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶对生长中的细胞进行指数期消化 1 分钟，然后加入 2 mL 含血清的培养液终止消化。将 400 μL 细胞悬液转移至含有 15 mL 完全 DMEM 培养基的 15 cm 培养皿中。共准备四个 15 cm 培养皿。
- 在培养 2–3 天、细胞融合度达到约 90% 时收获细胞。
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结果
我们从稳定过表达hEAG1的HEK-293T细胞中纯化了FLAG融合的hEAG1通道蛋白。该融合蛋白的功能已通过膜片钳技术验证，其蛋白纯度和特异性通过Western blot确认（图1）。将纯化的通道蛋白进行生物素标记，用于通过实时BLI检测与脂质（PIP2）的相互作用。BLI结合检测的实验设置如图2所示。典型的hEAG1与PIP2结合曲线如图3所示。在本例中，将3 μM PIP2溶解于PBS缓冲液中（PIP2 的结构见补充图1），并采用双参考扣除法对信号进行分析，以消除非特异性结合（传感器与PIP2之间的结合）、背景干扰（生物素标记的hEAG1蛋白与PBS之间的相互作用）以及由传感器差异引起的信号漂移（传感器与PBS之间的结合）。结合曲线经全局拟合后显.......
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讨论
膜离子通道已被证实为目前超过13%已知药物的主要治疗靶点，这些药物用于治疗包括心血管和神经系统疾病在内的多种人类疾病18膜片钳记录是测量离子通道在小分子作用下功能的金标准，已广泛用于离子通道配体的筛选。然而，此类电生理学方法无法证明小分子是否直接与通道结合。19，因为小分子可能作用于其他与该通道相互作用的蛋白质或细胞内信号通路。与广泛使用的放射性配体结合实验及其他常见的无标记生物传感器方法相比，BLI在实验装置相对简单、结合相不受限制、高通量、实验设计更接近体内系统以及所需固定化蛋白量少（仅需少量）等方面具有显著优势 μg），并可提供有关动力学数据的详细信息5,6,20.
为了最大程度地模拟体内情况，我们从哺乳动物稳定表达系统中纯化了 具有功能活性的hEAG1通道蛋.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由生物身份识别中心和上海交通大学医工交叉研究基金（YG2016QN66）、国家自然科学基金（31271217）以及国家重点基础研究发展计划（2014CB910304）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/高糖培养基 | HyClone | SH30243.01 | |
| 磷酸盐缓冲液（1×） | HyClone | SH30256.01 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 1697550 | |
| 细胞培养皿 | Corning | 430599 | 150 mm × 25 mm |
| Nonidet P-40 替代物 | Amresco | E109 | |
| 氯化钠 | BBI Life Sciences | A610476 | |
| 氯化钾 | BBI Life Sciences | A610440 | |
| 牛血清白蛋白 | BBI Life Sciences | A600332 | |
| 聚氧乙烯-20-山梨醇单月桂酸酯 | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 亲和凝胶 | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG 肽 | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| 数据采集软件 | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| 数据分析软件 | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| 生物传感器/链霉亲和素 | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| 微量滴定板 | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-生物素 | ThermoFisher | 21338 | |
| 离心机 | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler 预染蛋白 Marker | ThermoScientific | 318120 | |
| 超滤装置 | MILLIPORE | UFC503008 | 截留分子量 30 kDa |
| 磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP2） | Sigma | P9763 | |
| 单克隆 ANTI-FLAG M2 抗体 | Sigma | F1804 | 1:2000 稀释 |
| 山羊抗小鼠 HRP 标记二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 稀释 |
| 增强型 BCA 蛋白检测试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 成像系统 | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot 系统 | BIO-RAD |
参考文献
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K.
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重印与许可
