通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

摘要

本方案描述了纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂）之间的相互作用。实验结果表明，生物膜干涉技术（BLI）可能成为一种用于新型小分子离子通道配体筛选的潜在方法。

摘要

生物膜层干涉技术（BLI）是一种用于检测蛋白质-蛋白质及蛋白质-小分子相互作用的有效工具。本文首先介绍了这种新型无标记技术在研究人源EAG1（hEAG1）通道蛋白与小分子PIP₂相互作用中的应用。由于hEAG1通道在多种癌症中异常高表达，并且存在一些与神经系统疾病相关的功能获得性突变，因此被认为是一个潜在的治疗靶点。我们从哺乳动物稳定表达系统中纯化了 hEAG1通道蛋白，并利用BLI技术检测其与PIP₂的相互作用。成功测定hEAG1蛋白与PIP₂之间的结合动力学表明，BLI技术可作为离子通道药理学中新型小分子配体筛选的一种潜在高通量方法。

引言

利用小分子靶向细胞表面可及的离子通道蛋白，在配体筛选和生物药物发现方面具有巨大潜力^1,2,3因此，需要一种合适的工具来研究离子通道与 小分子及其相应功能。膜片钳记录技术已被证明是在离子通道功能检测中具有独特性和不可替代性的方法。然而，确定小分子是否直接作用于离子通道还需要借助其他技术。传统上，放射性配体结合实验被用于观察小分子与其靶向离子通道蛋白之间的结合动力学。但由于该技术需要进行放射性标记与检测，其应用受到限制。此外，研究中对小分子配体进行标记的先决步骤，使其无法应用于许多尚未发现特异性配体的离子通道。一些无标记技术，如核磁共振波谱法、X射线衍射、微尺度热泳动（MST）⁴ 表面等离子共振（SPR）已被用于检测蛋白质与小分子之间的相互作用。然而，由于难以获得全长蛋白质、动力学分辨率低、通量低以及成本高等因素，这类检测通常无法提供足够的信息⁵与这些技术相比，生物膜干涉技术（BLI）正作为一种新兴的无标记方法出现，通过将微量蛋白质样品固定在生物传感器表面并检测光学信号的变化，从而克服上述在检测蛋白质-小分子相互作用时的局限性。^6,7作为一种有前景的生物传感器平台，BLI技术已被用于观察小分子与天然水溶性蛋白质（如人源单克隆抗体CR8020）之间的相互作用。⁸ 详细的检测步骤已在之前的文章中报道过⁹尽管离子通道蛋白在发现新治疗靶点中的关键作用已被公认，但基于BLI的离子通道蛋白-小分子相互作用检测方法尚未见报道。

人类 ether-à-go-go 人源电压门控钾通道（hEAG1）在多种癌细胞和中枢神经系统中均有表达，这使得该通道成为多种癌症和神经疾病潜在的治疗靶点^{10,11,12,13,14}我们实验室的电生理学研究已证实磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂）的抑制作用。₂在hEAG1通道上的作用¹⁵根据我们的结果，建议检测PIP₂ 直接利用BLI技术研究hEAG1与小分子化合物的相互作用，可作为其他类型离子通道蛋白与小分子化合物相互作用的研究模型，尤其适用于缺乏特异性配体的通道。根据BLI检测的操作说明，我们制备了生物素标记的hEAG1蛋白，并将其固定在链霉亲和素（SA）生物传感器探针表面，随后与PIP进行相互作用分析₂ 溶液以观察蛋白质与脂质之间的直接结合。在PIP结合后₂ hEAG1蛋白包被的表面，表面层的厚度增加，这与光谱位移直接相关，并可实时测量¹⁶结合动力学可通过结合阶段的正向偏移和解离阶段的负向偏移来确定。根据这一原理，我们利用亲和纯化方法从HEK-239T稳定表达系统中纯化出具有功能活性的hEAG1离子通道蛋白，以保持其 体外 功能状态，随后检测了不同浓度 PIP 结合的动力学₂，并在电生理测量中观察到相似的动力学数据¹⁵生物发光成像与电生理测量结果的高度一致性首次证明了生物发光成像（BLI）作为离子通道膜蛋白与小分子相互作用分析工具的适用性。

方案

注意：通过将含有在远端C末端带有FLAG标签的hEAG1 DNA序列的pCDH慢病毒质粒转染至HEK-293T细胞，随后进行嘌呤霉素抗性筛选，构建稳定表达FLAG标记的hEAG1通道蛋白的HEK-293T细胞系，具体方法如前所述¹⁵。

1. 从 HEK-293T 细胞中亲和纯化 FLAG 标签标记的人源 hEAG1 通道蛋白

1. 迅速将稳定表达 hEAG1 通道的细胞从液氮中取出并放入温水（37 °C）中解冻。将细胞（约 5 × 10⁶ 冻存细胞）接种至 10 cm 培养皿中。在含 8 mL 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 4 mM L-谷氨酰胺的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养过夜，并于次日更换培养基。
2. 使用荧光显微镜检测这些 HEK-293T 细胞的 GFP 荧光，以确认在培养体系中高比例的细胞稳定表达 hEAG1 通道。在室温下用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶对生长中的细胞进行指数期消化 1 分钟，然后加入 2 mL 含血清的培养液终止消化。将 400 μL 细胞悬液转移至含有 15 mL 完全 DMEM 培养基的 15 cm 培养皿中。共准备四个 15 cm 培养皿。
3. 在培养 2–3 天、细胞融合度达到约 90% 时收获细胞。
   1. 移除细胞的生长培养基，并用 4 mL 磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH = 7.4）洗涤细胞两次。
   2. 洗涤后弃去 PBS。
   3. 使用细胞刮刀将每个培养皿中的细胞刮入 2 mL 1× PBS 中，并用 1 mL 移液器将刮下的细胞转移至 15 mL 离心管中。
   4. 在 4 °C 条件下，以 420 × g 离心 5 分钟。
   5. 倾去并弃除上清液。
   6. 将细胞沉淀重悬于总共 4 mL 裂解缓冲液（10 mM HEPES、1.5 mM MgCl₂、10 mM NaCl、1% NP-40，pH 7.0，含完全蛋白酶抑制剂）中，冰上孵育 30 分钟，每隔 10 分钟充分涡旋混匀一次。
   7. 在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 10 分钟。
   8. 将上清液转移至 5 mL 管中，置于冰上备用。
4. 准备抗 FLAG M2 亲和树脂。
   1. 通过轻柔倒置充分悬浮树脂（以储存缓冲液中的 50% 悬浮液形式提供），确保抗 FLAG M2 亲和凝胶瓶内为均匀的凝胶珠悬浮液。
   2. 立即取 400 μL 悬浮液转移至预冷的 1.5 mL 管中。
   3. 在 4 °C 条件下，以 8,000 × g 离心 30 秒，小心弃去上清液以洗去储存缓冲液。
   4. 向树脂中加入 500 μL 1× PBS，并用 1 mL 移液器重悬沉淀。然后在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 30 秒，小心弃去上清 PBS。重复此洗涤步骤以彻底清除储存缓冲液。
5. 将步骤 1.3.8 制备的 500 μL 蛋白提取物上清液加入树脂沉淀中以重悬沉淀，并将悬液转移至新的预冷 5 mL 管中。重复此操作以确保无凝胶珠残留。将剩余的蛋白提取物加入混合液中。
6. 在 4 °C 条件下，以 8 rpm 摇床孵育混合物过夜，以捕获 FLAG 融合蛋白。
7. 孵育 12 小时后，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。
8. 弃去上清液，并用 500 μL 1× PBS 洗涤沉淀三次。置于冰上备用。
9. 使用 3× FLAG 肽洗脱 FLAG hEAG1 蛋白。
   1. 配制 3× FLAG 洗脱液。将 3× FLAG 肽溶解于 500 μL 储存液（0.5 M Tris-HCl，1 M NaCl，pH = 7.5）中，终浓度为 8 μg/μL。
   2. 将 10 μL 3× FLAG 洗脱液加入 390 μL PBS 中，配制成终浓度为 200 ng/μL 的溶液。
   3. 向步骤 1.8 制备的凝胶珠中加入 400 μL 3× FLAG 洗脱液。
   4. 在 4 °C 条件下，以 8 rpm 摇床孵育样品 2 小时。
   5. 以 8,000 × g 离心树脂 30 秒。
   6. 将上清液转移至新的 1.5 mL 管中，于 4 °C 保存以备立即使用。

2. 使用BCA蛋白检测试剂盒和蛋白质印迹法测定并验证纯化的FLAG融合hEAG1的浓度

1. 根据制造商说明书，使用BCA蛋白检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。
2. 取30 μL样品进行Western分析，使用ANTI-FLAG抗体检测目标蛋白是否已成功纯化，方法如前所述¹⁵。

3. 为BLI实验用生物素标记纯化的通道蛋白

1. 在 PBS 中配制 5 mg/mL 的生物素储存液。每次检测（两个生物传感器）时，在 20 μg 纯化蛋白中加入 3 倍摩尔过量的生物素，以在 PBS 中实现纯化蛋白优先的 N 端生物素标记。
2. 将样品置于冰上避光孵育至少 30 分钟。
3. 配制样品稀释（SD）缓冲液：含 0.02% 吐温-20 和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA，pH 7.4）的 PBS。
4. 通过超滤法将纯化的通道蛋白缓冲液置换为 SD 缓冲液。使用截留分子量为 30 kDa 的超滤装置，加入 SD 缓冲液后，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，以去除未结合的生物素。
5. 从超滤装置的离心管中移除滤出液，向滤膜装置中加入 200 μL SD 缓冲液，并在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。重复此操作至少三次。
6. 为收集完成缓冲液置换的样品，将滤膜装置反向插入 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 5 分钟。将样品置于冰上，立即使用。

4. 检测用PIP₂溶液的制备

1. 按照先前所述方法¹⁷，将PIP₂溶于去离子H₂O中，配制成1 mM的储备液，并在冰上超声处理30分钟。将该溶液储存于玻璃小瓶中，置于-20 °C保存；在实验前通过剧烈涡旋震荡，将其稀释至所需终浓度。

5. BLI 检测

1. 打开设备并检查 "仪器状态" 确认设备已就位的窗口 "准备就绪" 在进行生物发光成像（BLI）研究前，需至少预热设备30分钟。
2. 确保在打开数据采集软件之前已关闭仪器门，并选择 "新的动力学实验" 在实验向导中。
3. 在96孔板上通过右键单击定义将要使用的孔，选择缓冲液、加载液和样品。对于样品孔，应以摩尔浓度输入生物素化FLAG融合hEAG1蛋白的浓度单位（10 μg，0.09 μM）。
4. 定义检测步骤，包括基线、加载、结合和解离。选择一个检测步骤，双击相应的列。对照传感器设置相同的检测定义。将转速设为1,000 rpm。基线步骤持续1分钟，加载、结合和解离步骤分别持续5–10分钟。在室温（约24 °C）下进行实验。
   注意：主要有两种操作流程：将生物素化通道蛋白加载至传感器，以及检测其与小分子化合物的相互作用。这两种流程可连续进行（基线、加载、基线、结合与解离）。或者，也可分步进行，以便在蛋白加载失败时避免浪费待测化合物。
5. 点击包含传感器的列，然后点击 "填充" 用于指示传感器托盘中传感器的位置。
6. 检查所有计划步骤，查找错误并返回修正。
7. 设置数据文件的位置并点击 "开始" 开始实验。
   注意：传感器需在SD缓冲液中预湿至少10分钟，若此步骤已完成，则继续下一步 "延迟实验开始" 应跳过该设置。否则，在预润湿传感器前设置600秒延迟。
8. 将一块黑色96孔板放入托盘底部，并将板的A1角插入托盘的凹槽中以固定板。在96孔板的A行2个孔和B行2个孔中，每孔加入200 μL检测缓冲液，用于加载传感器。
9. 另准备一块黑色96孔板作为样品板，根据步骤5.3中的程序设定，在B行各孔中加入200 μL SD缓冲液作为对照，A行各孔中加入200 μL生物素标记的hEAG1蛋白溶液（10 μg）。
   注意：避免引入气泡。
10. 打开仪器门，将传感器托盘和样品板分别插入左侧和右侧的板架中。根据左侧板架的形状，检查传感器托盘和样品板是否已正确放置 "A1" 右培养皿架右上角的标记。关闭门并开始检测。

6. 数据分析

1. 打开数据分析软件，加载包含检测数据的文件夹。点击 "处理" 进入处理菜单界面后，我们可以看到彩色的原始动力学曲线。
2. 下 步骤1: "数据选择"，点击 "传感器选择"。在 "传感器托盘 #1"，仅点击用SD缓冲液润湿的传感器孔，然后右键单击 "更换传感器类型" 到 "参考传感器". 在“样本板图”上"，指定所有非特异性结合孔，然后右键单击 "更换孔板类型" 到 "参照孔".
3. 勾选方框前 "减法" 步骤2的要点 "双参照".
4. 在 步骤 3: "对齐 Y 轴"，选择 "基线" 作为比对步骤。对于 "时间范围"，输入该基线的最后10秒 即 从：0.1 至：59.8
5. 在 步骤 4: "步骤间校正"，选择 "与基线对齐" 以最小化结合与解离步骤之间的信号漂移。
6. 在 步骤 5: "过程"在大多数情况下，选择Savitzky-Golay滤波函数并继续操作 "处理数据".
7. 在第7步中保存原始数据，以便使用其他软件进行进一步的数据分析。 "保存结果".
8. 点击 "分析 | 曲线拟合".
   1. 对于 "分析步骤"，选择 "结合 | 解离"。对于 "模型"，选择1:1。
      注意：我们选择1:1模型是因为它在原始数据上拟合良好，并且避免了在1:2或2:1模型下由于自由度较高而可能出现的过拟合问题。但此处还提供其他选项，可根据不同分析物的结合模型，适当地选择用于其他拟合分析。
   2. 对于 "拟合"，选择“全球（完整）”。对于 "分组"，选择 "颜色"选择 "Rmax 未与传感器关联" 以实现对最大信号响应（Rmax）的独立拟合。
   3. 点击 "拟合曲线！" 开始非线性回归分析。本研究中采用了Hill方程和单指数函数。
   4. 点击 "数据导出 | 保存报告" 以保存拟合结果。或点击 "数据导出 | 导出拟合结果" 以保存原始数据，供后续使用其他软件进行绘图和数据分析。

结果

我们从稳定过表达hEAG1的HEK-293T细胞中纯化了FLAG融合的hEAG1通道蛋白。该融合蛋白的功能已通过膜片钳技术得到验证，纯化蛋白的质量和特异性通过Western blot确认（图1）。将纯化的通道蛋白进行生物素标记，用于通过实时BLI检测与脂质（PIP₂）的相互作用。BLI结合检测的实验配置如图2所示。hEAG1与PIP₂之间典型的结合曲线如图3所示。在本实验中，将3 μM PIP₂溶解于PBS缓冲液中（PIP₂的结构见补充图1），并采用双参考减法分析信号，以扣除非特异性结合（传感器与PIP₂之间的结合）、背景信号（生物素标记的hEAG1蛋白与PBS之间的相互作用）以及由传感器变异引起的信号漂移（传感器与PBS之间的结合）。结合曲线经全局拟合...

讨论

膜离子通道已被证实为目前超过13%已知药物的主要治疗靶点，这些药物用于治疗包括心血管和神经系统疾病在内的多种人类疾病¹⁸膜片钳记录是测量离子通道在小分子作用下功能的金标准，已广泛用于离子通道配体的筛选。然而，此类电生理学方法无法证明小分子是否直接与通道结合。¹⁹，因为小分子可能作用于其他与该通道相互作用的蛋白质或细胞内信号通路。与广泛使用的放射性配体结合实验及其他常见的无标记生物传感器方法相比，BLI在实验装置相对简单、结合相不受限制、高通量、实验设计更接近体内系统以及所需固定化蛋白量少（仅需少量）等方面具有显著优势 μg），并可提供有关动力学数据的详细信息^5,6,20.

为了最大程度地模拟体内情况，我们从哺乳动物稳定表达系统中纯化了 具有功能活性的hEAG1通道蛋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/高糖培养基	HyClone	SH30243.01
磷酸盐缓冲液（1×）	HyClone	SH30256.01
胎牛血清	Gibco	10270
青霉素/链霉素	Gibco	1697550
细胞培养皿	Corning	430599	150 mm × 25 mm
Nonidet P-40 替代物	Amresco	E109
氯化钠	BBI Life Sciences	A610476
氯化钾	BBI Life Sciences	A610440
牛血清白蛋白	BBI Life Sciences	A600332
聚氧乙烯-20-山梨醇单月桂酸酯	BBI Life Sciences	A600560
ANTI-FLAG M2 亲和凝胶	Sigma	A2220
3x FLAG 肽	Sigma	F4799
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
数据采集软件	Pall/FortéBio	Version 7.1
数据分析软件	Pall/FortéBio	Version 7.1
生物传感器/链霉亲和素	Pall/FortéBio	18-5019
微量滴定板	Greiner Bio-one	655209
Sulfo-NHS-LC-LC-生物素	ThermoFisher	21338
离心机	ThermoFisher	75004250
PageRuler 预染蛋白 Marker	ThermoScientific	318120
超滤装置	MILLIPORE	UFC503008	截留分子量 30 kDa
磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP2）	Sigma	P9763
单克隆 ANTI-FLAG M2 抗体	Sigma	F1804	1:2000 稀释
山羊抗小鼠 HRP 标记二抗	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	1:5000 稀释
增强型 BCA 蛋白检测试剂盒	Beyotime	P0010
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	04693159001
Amersham Imager 600 成像系统	GE Healthcare Bio-Sciences
Western blot 系统	BIO-RAD