使用定量实时逆转录PCR对中国猕猴血浆中微小RNA水平进行绝对定量

摘要

本报告描述了一种利用定量实时逆转录PCR（可选是否进行预扩增）测定血浆miRNA绝对水平的实验方案。该方案有助于更准确地理解血浆miRNA的数量，并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。

摘要

RT-qPCR 是评估特定 miRNA 的最常用方法之一。miRNA 水平通常相对于参考样本进行测量。该方法适用于检测靶基因表达水平的生理变化。然而，对于基因表达水平的全面评估，采用更优统计分析的绝对定量更为理想。目前，绝对定量尚未被广泛使用。本报告描述了一种利用 RT-qPCR（可选是否进行预扩增）测定血浆 miRNA 绝对水平的实验方案。

从清醒的食蟹猴（n = 50）股静脉采集的血液中制备出固定体积（200 µL）的EDTA血浆。使用市售系统提取总RNA。采用基于探针的RT-qPCR检测法对血浆miRNA进行定量，该检测法包含miRNA特异性的正向/反向PCR引物和探针。绝对定量的标准曲线使用市售的合成RNA寡核苷酸生成。合成的cel-miR-238被用作归一化和质量评估的外参对照。对于定量循环（Cq）值高于35的miRNA，在进行qPCR步骤前进行预扩增。

在检测的8种miRNA中，miR-122、miR-133a和miR-192无需预扩增即可检测到，而miR-1、miR-206和miR-499a由于表达水平较低，需要进行预扩增。miR-208a和miR-208b即使经过预扩增也无法检测到。通过添加的cel-miR-238的Cq值评估样本处理效率。在该检测方法中，技术变异估计小于3倍，大多数被检测miRNA的定量下限（LLOQ）为10² 拷贝/µL。

该方案可更准确地估算血浆miRNA的含量，并允许对不同研究产生的相应数据进行质量评估。鉴于体液中miRNA的数量较少，预扩增有助于增强低表达miRNA的检测。

引言

越来越多的研究正在探索微小RNA（miRNA）作为癌症诊断和预后的生物标志物，或在非临床和临床研究中用于监测和检测其他疾病^1,2,3。定量实时逆转录PCR（RT-qPCR）是用于检测特定目标miRNA的最常用方法之一，因为该技术比微阵列⁴和基于RNA测序的平台⁵更敏感。通常，采用ΔCq法将miRNA的表达水平相对于参考样本进行相对定量⁶。该方法适用于研究目标基因表达水平的生理变化。然而，由于循环miRNA含量极低，其相对定量的应用受到限制。此外，由于不同实验室对RT-qPCR实验方案的定制方式不同，技术变异使得不同研究之间的结果难以比较，导致不同研究得出的结果不一致甚至相互矛盾⁷。

鉴于上述问题，绝对定量可能更适合于评估体液中微量的miRNA。绝对定量方法采用标准曲线，该曲线由已知浓度的合成RNA寡核苷酸构建而成，这些寡核苷酸的序列与相应的目标miRNA完全相同⁸。健康与环境科学研究所（HESI）基因组学技术委员会最近开展了一项全面研究，比较了多个测试单位对血浆miRNA进行绝对定量测量的结果。结果显示，采用统一的miRNA绝对定量标准操作流程，可在不同测试单位之间获得可比的结果⁹。本研究中描述的RT-qPCR检测方法与HESI的标准操作流程几乎完全相同，包括对多个miRNA靶标进行多重分析，以及对低表达水平的miRNA进行预扩增以增强检测灵敏度。

本研究使用了从清醒的食蟹猴（n = 50）股静脉采集的血液制备的EDTA血浆，每次使用固定体积（200 µL）¹⁰。以下方案描述了血浆样本制备、miRNA提取以及包括预扩增在内的RT-qPCR操作流程。更重要的是，本方案中还补充了额外的技术信息，以便通过严格验证的流程，对样本中靶向miRNA的含量进行确认。首先，在对生物样本中的miRNA进行定量之前，需分别验证每种miRNA标准曲线的检测范围。其次，通过外部对照（cel-miR-238）的Cq值，全面评估当前方法学的质量。因此，该平台能够提供更具信息量且可靠的数据，便于比较不同研究或实验室之间的结果。

本报告包含了8种miRNA的表达谱，作为此处所述检测方法的代表性结果。这些miRNA已被提出作为与肝脏（miR-122和miR-192）、心脏（miR-1、miR-208a、miR-208b和miR-499a）以及骨骼肌（miR-133a和miR-206）组织损伤相关的潜在安全性生物标志物，在啮齿类动物和人类中均有研究支持^3,11,12,13。

方案

所有实验均经第一三共株式会社机构动物护理和使用委员会批准。

1. 样品制备

1. 使用含EDTA 2K的采血管，从食蟹猴的股静脉采集血液（至少0.5 mL）。
   注意：柠檬酸盐和肝素不可使用，因为这些抗凝剂会抑制后续的PCR^14,15。
2. 采集后的样本立即置于冰上，并在采集后2小时内进行血浆分离处理。
3. 在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟。
4. 将上清液转移至2 mL微量离心管中，随后在4 °C条件下以16,000 × g离心5分钟，以去除细胞碎片和残留血小板。
   注意：血小板污染会显著影响miRNA的定量结果¹⁶。
5. 取200 µL上清液分装至新的2 mL微量离心管中，保存于-80 °C直至使用。
   注意：每个样本用于RNA提取的体积是固定的，因此分装体积必须准确。

2. RNA 提取

1. 将冷冻样品（来自步骤1.5）置于冰上解冻。
   1. 在RNA提取过程中保持样品置于冰上并保持低温。使用前将裂解试剂和氯仿预冷于冰上。
2. 向样品（200 µL）中加入5倍体积（1000 µL）含有苯酚和异硫氰酸胍单相溶液的裂解试剂，涡旋振荡1分钟，充分混匀。
3. 加入5 µL浓度为5 nM的合成物 秀丽隐杆线虫 miRNA（Syn-cel-miR-238-3p）
4. 加入1体积（200 µL）氯仿，涡旋振荡1分钟，充分混匀。
5. 置于冰上孵育2至3分钟，然后在4 °C条件下以12,000 x g离心15分钟。
6. 将水相小心转移至新的微量离心管中。
   注意：不要转移任何有机相（红色）或中间相（白色）。收集的水相体积应保持一致，以避免操作不一致导致技术误差增加。本方案中通常转移的水相体积为 650 µL。
7. 加入1.5倍体积（975 µL）的乙醇，用移液器上下吹打充分混匀。
8. 将样品转移至相应的层析柱和接头中，随后使用真空 manifold 装置真空干燥 3 分钟。若样品体积超过 700 µL，重复此步骤以处理剩余溶液。
   注意：基于柱的RNA分离方法适用于真空和离心法。
9. 向柱中加入 200 µL 乙醇，随后真空干燥 1 分钟。
10. 向柱中加入 800 µL RWT 缓冲液，随后真空干燥 2 分钟。
11. 向柱中加入 800 µL RPE 缓冲液，随后真空干燥 2 分钟。
12. 重复步骤 2.11。
13. 向柱中加入 300 µL 乙醇，随后真空干燥 1 分钟。
14. 将柱子置于新的微量离心管上，在室温（15 至 25 °C）下以 12,000 × g 离心 1 分钟。
15. 将柱子转移至新的微量离心管中，加入 50 µL 无核酸酶水。
16. 室温（15 至 25 °C）静置 3 分钟，然后在室温（15 至 25 °C）下以 8,000 × g 离心 1 分钟。
17. 将洗脱液重新加回到柱子中。
18. 重复步骤 2.16，并将洗脱液保存于 -80 °C 直至使用。

3. cDNA 合成

1. 解冻冻存的样品（来自步骤 2.18）。
2. 制备与目标 miRNA 对应的已知浓度的合成 RNA 寡核苷酸。
   1. 使用合成 RNA 寡核苷酸用于在 qPCR 中生成标准曲线。为储存目的，制备浓度为 1 × 10⁸ 拷贝/µL 的储备液。
   2. 将储备液稀释 10 倍，得到 1 × 10⁷ 拷贝/µL（未预扩增样品）或 1 × 10⁵ 拷贝/µL（预扩增样品）的工作液，作为构建标准曲线的最高浓度。通常建议的标准曲线浓度范围为 1 × 10⁷ 至 1 × 10² 拷贝/µL（未预扩增样品）或 1 × 10⁵ 至 1 × 10⁰ 拷贝/µL（预扩增样品）。
3. 通过混合等体积的各目标 miRNA 的 20x RT 引物，制备多重 RT 引物混合液。
   注：如图 2所示，可通过混合池中每种 miRNA 的 20x RT 引物，制备最多包含 4 种目标 miRNA 的引物混合液。每个反应管中必须包含 Cel-miR-238（外源性对照）作为目标 miRNA 之一。若目标 miRNA 少于 4 种，则用等体积的 1/10 TE 缓冲液替代缺失的 20x RT 引物。
4. 制备 RT 反应体系：3 µL RT 引物混合液（来自步骤 3.3）、0.15 µL 100 mM 含 dTTP 的 dNTPs、1 µL 逆转录酶（50 U/µL）、1.5 µL 10x RT 缓冲液、0.19 µL RNase 抑制剂（20 U/µL）以及 4.16 µL 无核酸酶水。
5. 用移液器将 10 µL RT 反应体系与 5 µL RNA 样品（来自步骤 3.1）或寡核苷酸（来自步骤 3.2）混合，在冰上孵育 5 分钟。
6. 在热循环仪上进行逆转录反应：16 °C 反应 30 分钟，42 °C 反应 30 分钟，最后在 85 °C 灭活逆转录酶 5 分钟。将逆转录后的样品储存于 -80 °C，待后续使用。

4. 预扩增（可选）

注意：在后续 qPCR 中 Cq 值高于或等于 35 的 miRNA 需进行预扩增。

1. 解冻冻存样品（来自步骤 3.6）。
2. 对合成 RNA 寡核苷酸的反转录产物进行 10 倍梯度稀释，浓度范围为 1 × 10⁵ 至 1 × 10⁰ 拷贝/µL，用于生成标准曲线。
3. 通过将靶向目标 miRNA 的 20x 检测引物等体积（各 5 µL）混合，配制多重检测引物混合液，最终总体积为 1,000 µL，各检测引物在 TE 缓冲液中被稀释 200 倍。
   注意：靶向在后续 qPCR 中无需预扩增即可检测到的 miRNA 的引物，以及靶向 cel-miR-238（外源性对照）的引物，不包含在该引物混合液中。
4. 配制预扩增反应体系：12.5 µL 的 2x 即用型预扩增试剂、3.75 µL 的引物混合液（来自步骤 4.3）和 6.25 µL 的无核酸酶水。
5. 将 22.5 µL 预扩增反应体系与 2.5 µL 反转录样品（来自步骤 4.1）或寡核苷酸（来自步骤 4.2）通过移液充分混匀，并在冰上孵育 5 分钟。
6. 在热循环仪中运行反应程序：95 °C 预变性 10 分钟；随后进行 12 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 4 分钟。预扩增后的样品储存于 -80 °C，待后续使用。

5. 定量实时聚合酶链式反应（qPCR）

1. 解冻冻存的样品（来自步骤 3.6 或步骤 4.6）。
2. 用无菌水将样品稀释 5 倍。
3. 制备来源于合成 RNA 寡核苷酸的 RT 产物的 10 倍系列稀释液：1 × 10⁷ 至 1 × 10² 拷贝/µL（未预扩增样品）或 1 × 10⁵ 至 1 × 10⁰ 拷贝/µL（预扩增样品），用于生成标准曲线。
4. 配制 qPCR 反应体系：10 µL 的 2× 即用型扩增试剂，1 µL 的 20× 检测试剂（包含针对目标 miRNA 的正向/反向 PCR 引物和探针），以及 7 µL 无核酸酶水。
5. 将 18 µL qPCR 反应体系转移至快速光学 96 孔反应板中，每孔加入 2 µL 稀释后的样品（来自步骤 5.2 或步骤 5.3）。
   注意：qPCR 的样品和标准品均设复孔。
6. 用粘性封板膜密封反应板，并短暂离心。
7. 在实时荧光定量热循环仪上运行反应程序：95 °C 预变性 20 秒，随后进行 45 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 1 秒和 60 °C 退火/延伸 20 秒。

6. 数据分析

1. 使用与相应实时荧光定量PCR仪配套的数据分析软件，计算每个样本的原始拷贝数。
   注意：本研究中所有反应板的阈值线均手动设置为"1.0"，以便通过与Cq值的比较验证实验的可重复性。设定Cq值大于>40个循环为截断值。
2. 根据每个样本的重复测定结果，计算其原始拷贝数的平均值。
3. 通过将每个样本中cel-miR-238的拷贝数除以相应管中所有样本cel-miR-238拷贝数的平均值，计算校正因子。
   注意：如图2所示，每管最多包含4种目标miRNA，其中包括cel-miR-238（外源性对照）。因此，需根据相应管中的cel-miR-238值为每管单独计算校正因子。
4. 将每个样本的平均原始拷贝数（来自步骤6.2）除以其对应的校正因子（来自步骤6.3），计算校正后的拷贝数。
5. 将每个样本的校正后拷贝数（来自步骤6.4）乘以该样本的稀释倍数，计算其绝对拷贝数。
   注意：本实验方案中稀释倍数为"5"，来源于步骤5.2。
6. 根据各梯度稀释样本的Cq值对cDNA浓度对数值作图，利用所得曲线的斜率计算PCR扩增效率。
   注意：扩增效率的计算公式为：E = (10^(-1/slope) -1) × 100%。
7. 利用所有样本中cel-miR-238的Cq值，按公式E = (2 × 扩增效率)^{ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq))}计算技术变异。
   注意：步骤6.5和6.7用于实验流程的质量评估。

结果

miRNA检测的RT-qPCR流程及质量评估t
图1 展示使用qPCR从血液样本中进行miRNA检测的工作流程¹⁰通过加入cel-miR-238作为外参对照，可验证实验的质量。这有助于揭示RNA提取及后续RT-qPCR过程中的技术性变异。本研究中，基于50个样本计算得到的Cq值均数±标准差为21.0 ± 0.4。表1）。如果由于预扩增步骤导致cel-miR-238被稀释，则其Cq值为24.2 ± 0.4（表1）。在本实验方法中，基于Cq值的差异，技术变异程度估计小于3倍。即使增加了预扩增步骤，变异程度仍保持一致。这些数值与其他动物物种（如小鼠、大鼠和人类）样本在本实验室中获得的结果相符合（数据未显示）。

...

讨论

我们的综合评估对动态范围的程度进行了更为严格的统计分析，结果明确表明，在所检测的miRNA中，不同个体样本之间的变异幅度存在极大差异。尽管这些变异可能归因于miRNA在体液中的含量较低，但需要注意的是，这些数据反映的不仅是生物学变异，还包括技术性变异。大部分技术性变异可通过外源性对照（cel-miR-238）的Cq值进行评估，该对照已被用于其他检测平台¹⁸。由于目前miRNA分析尚无标准化的内参对照，因此在分析中应纳入技术性变异信息，以评估检测方法的质量¹⁹。本报告所述方法的技术性变异估计小于3倍。尽管由于缺乏其他研究中可比较的技术数据，尚无法确定该实验流程的质量标准，但提供此类信息有助于提高结果的可靠性，并确保不同研究之间的可比性。

近期多项研究报道，样本处理、储存条件和处理前的储存时间等各种分析前变量可能影响循环miRNA检测结果的可靠性和可重复性^20,21。尽管本研...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Microtainer 管（K2EDTA）	Becton, Dickinson and Company	365974	用于血液采集
Eppendorf PCR管，0.2 mL	Eppendorf	0030124359
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管  1.5 mL	Eppendorf	0030120086
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管  2.0 mL	Eppendorf	0030120094
合成寡核苷酸	北海道系统科学	-	单个miRNA（0.2 μ摩尔，HPLC 级
Tris-EDTA缓冲液  （pH 8.0）	Nippon Gene	314-90021	TE缓冲液
Buffer RPE	QIAGEN	-	miRNeasy mini 试剂盒中的成分
Buffer RWT	QIAGEN	-	miRNeasy mini 试剂盒中的成分
miRNeasy Mini Kit	QIAGEN	217004
无核酸酶水	QIAGEN	129114
QIAzol 裂解试剂	QIAGEN	-	miRNeasy mini 试剂盒中的成分
合成 cel-miR-238-3p miScript miRNA 模拟物	QIAGEN	219600	ID：MSY0000293，5 nmol
SC接头	TAIGEN Bioscience Corporation	S0120	用于RNA提取
VacEZor 36 完整系统	TAIGEN Bioscience Corporation	M3610	用于RNA提取
7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统	赛默飞世尔科技公司	4351405	快速96孔板
GeneAmp PCR System 9700	赛默飞世尔科技公司	9700
MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板	赛默飞世尔科技公司	4346907
MicroAmp 光学粘性膜	赛默飞世尔科技公司	4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix	赛默飞世尔科技公司	4444557
TaqMan microRNA 检测试剂盒（cel-miR-238-3p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：000248
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-122-5p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：002245
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-133a-3p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：002246
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-1-3p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：002222
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-192-5p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：000491
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-206）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测编号：000510
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-208a-3p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：000511
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-208b-3p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：002290
TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-499a-5p）	赛默飞世尔科技公司	4427975	检测 ID：001352
TaqMan microRNA 逆转录 逆转录试剂盒	赛默飞世尔科技公司	4366597
TaqMan PreAmp 主混合液（2×)	赛默飞世尔科技公司	4391128
氯仿	和光纯药工业	035-02616
乙醇（99.5）	和光纯药工业	057-00456