本报告描述了一种利用定量实时逆转录PCR（可选是否进行预扩增）测定血浆miRNA绝对水平的实验方案。该方案有助于更准确地理解血浆miRNA的数量，并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。
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摘要
摘要
RT-qPCR 是评估特定 miRNA 的最常用方法之一。miRNA 水平通常相对于参考样本进行测量。该方法适用于检测靶基因表达水平的生理变化。然而，对于基因表达水平的全面评估，采用更优统计分析的绝对定量更为理想。目前，绝对定量尚未被广泛使用。本报告描述了一种利用 RT-qPCR（可选是否进行预扩增）测定血浆 miRNA 绝对水平的实验方案。
从清醒的食蟹猴（n = 50）股静脉采集的血液中制备出固定体积（200 µL）的EDTA血浆。使用市售系统提取总RNA。采用基于探针的RT-qPCR检测法对血浆miRNA进行定量，该检测法包含miRNA特异性的正向/反向PCR引物和探针。绝对定量的标准曲线使用市售的合成RNA寡核苷酸生成。合成的cel-miR-238被用作归一化和质量评估的外参对照。对于定量循环（Cq）值高于35的miRNA，在进行qPCR步骤前进行预扩增。
在检测的8种miRNA中，miR-122、miR-133a和miR-192无需预扩增即可检测到，而miR-1、miR-206和miR-499a由于表达水平较低，需要进行预扩增。miR-208a和miR-208b即使经过预扩增也无法检测到。通过添加的cel-miR-238的Cq值评估样本处理效率。在该检测方法中，技术变异估计小于3倍，大多数被检测miRNA的定量下限（LLOQ）为102 拷贝/µL。
该方案可更准确地估算血浆miRNA的含量，并允许对不同研究产生的相应数据进行质量评估。鉴于体液中miRNA的数量较少，预扩增有助于增强低表达miRNA的检测。
引言
越来越多的研究正在探索微小RNA（miRNA）作为癌症诊断和预后的生物标志物，或在非临床和临床研究中用于监测和检测其他疾病1,2,3。定量实时逆转录PCR（RT-qPCR）是用于检测特定目标miRNA的最常用方法之一，因为该技术比微阵列4和基于RNA测序的平台5更敏感。通常，采用ΔCq法将miRNA的表达水平相对于参考样本进行相对定量6。该方法适用于研究目标基因表达水平的生理变化。然而，由于循环miRNA含量极低，其相对定量的应用受到限制。此外，由于不同实验室对RT-qPCR实验方案的定制方式不同，技术变异使得不同研究之间的结果难以比较，导致不同研究得出的结果不一致甚至相互矛盾7。
鉴于上述问题，绝对定量可能更适合于评估体液中微量的miRNA。绝对定量方法采用标准曲线，该曲线由已知浓度的合成RNA寡核苷酸构建而成，这些寡核苷酸的序列与相应的目标miRNA完全相同8。健康与环境科学研究所（HESI）基因组学技术委员会最近开展了一项全面研究，比较了多个测试单位....
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方案
所有实验均经第一三共株式会社机构动物护理和使用委员会批准。
1. 样品制备
- 使用含EDTA 2K的采血管，从食蟹猴的股静脉采集血液（至少0.5 mL）。
注意：柠檬酸盐和肝素不可使用，因为这些抗凝剂会抑制后续的PCR14,15。 - 采集后的样本立即置于冰上，并在采集后2小时内进行血浆分离处理。
- 在4 °C条件下，以10,000 × g离心5分钟。
- 将上清液转移至2 mL微量离心管中，随后在4 °C条件下以16,000 × g离心5分钟，以去除细胞碎片和残留血小板。
注意：血小板污染会显著影响miRNA的定量结果16。 - 取200 µL上清液分装至新的2 mL微量离心管中，保存于-80 °C直至使用。
注意：每个样本用于RNA提取的体积是固定的，因此分装体积必须准确。
2. RNA 提取
- 将冷冻样品（来自步骤1.5）置于冰上解冻。
- 在RNA提取过程中保持样品置于冰上并保持低温。使用前将裂解试剂和氯仿预冷于冰上。 <....
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结果
miRNA 通过 RT-qPCR 检测的工作流程及质量评估t
图1 显示使用qPCR从血液样本中进行miRNA检测的工作流程10通过加入cel-miR-238作为外部对照，可验证实验的质量。这将揭示RNA提取及后续RT-qPCR过程中的技术变异。本研究中，基于50个样本计算得到的Cq值平均值±标准差为21.0 ± 0.4表1）。如果由于预扩增步骤导致cel-miR-238被稀释，则其Cq值为24.2 ± 0.4（表1）。在本实验方法中，基于Cq值的差异，技术变异程度估计小于3倍。即使增加了额外的预扩增步骤，变异程度仍保持一致。这些数值与本实验室对其他不同动物物种（如小鼠、大鼠和人类）样本所得结果相符合（数据未显示）。
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讨论
我们的综合评估对动态范围的程度进行了更为严格的统计分析，结果明确表明，在所检测的miRNA中，不同个体样本之间的变异幅度存在极大差异。尽管这些变异可能归因于miRNA在体液中的含量较低，但需要注意的是，这些数据反映的不仅是生物学变异，还包括技术性变异。大部分技术性变异可通过外源性对照（cel-miR-238）的Cq值进行评估，该对照已被用于其他检测平台18。由于目前miRNA分析尚无标准化的内参对照，因此在分析中应纳入技术性变异信息，以评估检测方法的质量19。本报告所述方法的技术性变异估计小于3倍。尽管由于缺乏其他研究中可比较的技术数据，尚无法确定该实验流程的质量标准，但提供此类信息有助于提高结果的可靠性，并确保不同研究之间的可比性。
近期多项研究报道，样本处理、储存条件和处理前的储存时间等各种分析前变量可能影响循环miRNA检测结果的可靠性和可重复性20,21。尽管本研.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究未从公共、商业或非营利性资助机构获得任何专项资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD Microtainer 管（K2EDTA） | Becton, Dickinson and Company | 365974 | 用于血液采集 |
| Eppendorf PCR管，0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock 微量离心管 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock 微量离心管 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| 合成寡核苷酸 | 北海道系统科学 | - | 单个miRNA（0.2 μ摩尔，HPLC 级 |
| Tris-EDTA缓冲液 （pH 8.0） | Nippon Gene | 314-90021 | TE缓冲液 |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | miRNeasy mini 试剂盒中的成分 |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | miRNeasy mini 试剂盒中的成分 |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| 无核酸酶水 | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol 裂解试剂 | QIAGEN | - | miRNeasy mini 试剂盒中的成分 |
| 合成 cel-miR-238-3p miScript miRNA 模拟物 | QIAGEN | 219600 | ID：MSY0000293，5 nmol |
| SC接头 | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | 用于RNA提取 |
| VacEZor 36 完整系统 | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | 用于RNA提取 |
| 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统 | 赛默飞世尔科技公司 | 4351405 | 快速96孔板 |
| GeneAmp PCR System 9700 | 赛默飞世尔科技公司 | 9700 | |
| MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板 | 赛默飞世尔科技公司 | 4346907 | |
| MicroAmp 光学粘性膜 | 赛默飞世尔科技公司 | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | 赛默飞世尔科技公司 | 4444557 | |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（cel-miR-238-3p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：000248 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-122-5p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：002245 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-133a-3p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：002246 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-1-3p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：002222 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-192-5p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：000491 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-206） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测编号：000510 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-208a-3p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：000511 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-208b-3p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：002290 |
| TaqMan microRNA 检测试剂盒（hsa-miR-499a-5p） | 赛默飞世尔科技公司 | 4427975 | 检测 ID：001352 |
| TaqMan microRNA 逆转录 逆转录试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司 | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp 主混合液（2×) | 赛默飞世尔科技公司 | 4391128 | |
| 氯仿 | 和光纯药工业 | 035-02616 | |
| 乙醇（99.5） | 和光纯药工业 | 057-00456 |
参考文献
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers ....
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