一种标准的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案经过优化，可用于分析低至500个造血干细胞或祖细胞。优化过程包括对细胞样品的精细操作、尽量减少管间转移步骤，以及直接在Laemmli样品缓冲液中裂解细胞。
一种标准的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案经过优化，可用于分析低至500个造血干细胞或祖细胞。优化过程包括对细胞样品的精细操作、尽量减少管间转移步骤，以及直接在Laemmli样品缓冲液中裂解细胞。
造血干细胞（HSCs）是一类稀有细胞，小鼠骨髓中仅含有约25,000个表型上的长期重建造血干细胞。本研究优化了一种适用于少量HSCs（500–15,000个细胞）分析的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案。通过分离纯化表型HSCs，精确计数后直接在Laemmli样品缓冲液中裂解。将含有相同数量细胞的裂解液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，随后按照标准的Western blotting流程进行转膜与检测。采用该方案，通常可对2,000–5,000个HSCs进行分析，在某些情况下甚至可低至500个细胞获得有效数据，远少于大多数文献报道所需的20,000至40,000个细胞。本方案可广泛适用于其他造血细胞，使得利用常规实验室技术对少量细胞进行系统分析成为可能。
造血干细胞（HSCs）是一类具有自我更新能力的细胞，能够分化为所有类型的血细胞。它们在骨髓中数量相对稀少，使得生化分析较为困难。适用于稀有细胞分析的方法，如流式细胞术，对于定量细胞表面标志物和细胞内蛋白的相对含量极为有用。然而，对细胞内蛋白的分析需要采用细胞通透化处理，以允许抗体进入细胞，但并非所有细胞表面表位都能在这些处理过程中保持完整1,2。此外，可用于流式细胞术以区分不同蛋白亚型或切割产物的抗体往往难以获得，因此研究者在某些类型的分析中仍依赖于蛋白质印迹（Western blot）。
细胞裂解物的蛋白质印迹（Western blot）分析是大多数实验室的常规操作。细胞可在保持细胞表面分子表位完整的天然条件下进行纯化，随后制备并分析细胞裂解物。然而，通过蛋白质印迹法分析稀有原代细胞群体中的蛋白质时，通常需要处死大量动物以获得足够的细胞数量。通过对多个步骤进行微小调整，一种传统的蛋白质印迹实验方案能够检测相对少量造血干细胞（HSCs）中的蛋白质（根据目标蛋白的不同，所需细胞数为500至15,000个）。这些调整包括精确计数细胞、小心处理细胞沉淀、尽量减少细胞在不同离心管之间的转移以降低细胞损失，以及使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的浓缩上样缓冲液裂解确定数量的细胞。许多已发表的研究报告中使用的蛋白质印迹实验均需20,000个或更多的HSCs
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所有操作必须遵循机构的动物使用和护理指南。该方案最初用于分析小鼠造血干细胞和祖细胞（HSCs 和 HPs），但也可根据需要调整用于其他细胞群体的分析。
1. 流式细胞术分离小鼠造血干细胞和造血祖细胞
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500 - 2,000 个纯化的 HSC 和 HP 的代表性结果如图所示 图1 和 图2。该 β-actin 信号在 图1 可从一只小鼠骨髓中纯化的低至500个HSC和HP中检测到信号。需要注意的是，将裂解物上样至1.5 mm加样孔时，500个HP产生的信号明显强于上样至3.0 mm加样孔。 图2 是 EIF4G 和 Rps6 磷酸化（p-Rps6）的蛋白质印迹，两者均参与蛋白质翻译的调控12，在造血干细胞（HSCs）以及有无干细胞因子（SCF）刺激的造血祖细胞（HPs）中 体外.
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Western印迹是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质及信号通路活化的常用技术。通过对一种常用实验流程进行少量调整，我们能够常规性地在15,000个造血干细胞（HSCs）中检测到15种不同的蛋白质（材料表），在某些情况下甚至可在低至500个HSCs中实现检测。本实验方案中最关键的步骤包括：1）准确计数细胞；2）尽量减少样品在不同离心管之间的转移次数；3）直接使用Laemmli上样缓冲液裂解细胞。在使用Laemmli上样缓冲液裂解细胞沉淀时，我们发现，与其将细胞沉淀中的上清液完全移除后再重悬于Laemmli上样缓冲液中，不如在离心管中保留少量上清液，并加入等体积的2x Laemmli上样缓冲液，这样可有效避免细胞损失。使用水平转子离心机对细胞进行离心也可降低细胞丢失的风险。通过修剪梳子齿以缩小加样孔宽度，可提高检测的灵敏度。
通过对实验步骤进行这些简单的调整，我们获得了可重复的结果，其效果相当于已发表论文中使用 10 - 20 倍数量细胞所得到的结果3,
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作者声明无利益冲突。
本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金 R01 CA149976（N.A.S）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液 | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| 过硫酸铵 | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 梳子 | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽 | Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| 转膜系统 | Bio-Rad | 1704155EDU | 转膜 |
| PowerPac HC 电源 | Bio-Rad | 1645052EDU | 电泳 |
| 成像系统 | Bio-Rad | 1708195 | 信号检测 |
| 4x Laemmli 上样缓冲液 | Bio-Rad | 1610747EDU | 样品制备 |
| 10x Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液 | Bio-Rad | 1610732EDU | 电泳 |
| 2-巯基乙醇 | Bio-Rad | 1610710EDU | 样品制备 |
| RTA Mini PVDF 转膜试剂盒（适用于40次印迹） | Bio-Rad | 1704272 | 转膜 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 11697498001 | 样品制备 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Gold Biotechnology | GB-450-1 | 样品制备 |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB 抗体，已在1000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：图2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB 抗体，已在1000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：图2 |
| 肌动蛋白（HRP 标记） | abcam | ab49900 | WB 抗体，已在500个细胞中验证 抗体稀释比例：1:5000 参考（图）：图1、图2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图5） |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图4） |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图4） |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图4） |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图4） |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图5） |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图S1） |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图S1） |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图S1） |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图S1） |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:1000 参考（图）：参考文献5（图S1） |
| 肌动蛋白 | Santa Cruz | sc-47778 | WB 抗体，已在15000个细胞中验证 抗体稀释比例：1:3000 参考（图）：参考文献5（图4） |
| 谱系耗竭试剂盒（小鼠） | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | 造血干细胞和祖细胞纯化 |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | 造血干细胞和祖细胞纯化 |
| SCF | PeproTech | 250-03 | 磷酸化刺激 |
| APC-Cy7 c-kit 抗体 | ThermoFisher | A15423 | 细胞分选 |
| 抗-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | 细胞分选 |
| 抗-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | 细胞分选 |
| 抗-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | 细胞分选 |
| 抗-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | 细胞分选 |
| 抗-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | 细胞分选 |
| 带1.0 mm一体式垫片的间隔板 | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Research Products International | A30075 | 膜封闭 |
| 血清 | Atlanta Biologicals | A12450 | 培养基添加剂 |
| 细胞计数仪 | Invitrogen | AMQAF1000 | 细胞计数 |
| 血细胞计数板 | ThermoFisher | S17040 | 细胞计数 |
| 胶片 | Denville Scientific | E3012 | 信号检测 |
| 医用胶片处理器 | Konica | SRC-101A | 信号检测 |
| Supersignal West Femto 最高灵敏度底物 | Therom Scientific | 34096 | 信号检测 |
| Allegra X-15R 离心机（转子 SX4750A） | Beckman Coulter | X-15R | 样品制备 |
| BLUEstain 蛋白质分子量标准 | Gold Biotechnology | P007-500 | 电泳 |
| 细胞分选仪 | BD | FACSAria II | 样品制备 |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | 电泳 |
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