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一种适用于少量造血干细胞的蛋白质印迹实验方案

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DOI：

10.3791/56855

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2018年8月22日

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Southwest Hospital, Third Military Medical University

本文内容

摘要

一种标准的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案经过优化，可用于分析低至500个造血干细胞或祖细胞。优化过程包括对细胞样品的精细操作、尽量减少管间转移步骤，以及直接在Laemmli样品缓冲液中裂解细胞。

摘要

造血干细胞（HSCs）是一类稀有细胞，小鼠骨髓中仅含有约25,000个表型上的长期重建造血干细胞。本研究优化了一种适用于少量HSCs（500–15,000个细胞）分析的蛋白质印迹（Western blotting）实验方案。通过分离纯化表型HSCs，精确计数后直接在Laemmli样品缓冲液中裂解。将含有相同数量细胞的裂解液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，随后按照标准的Western blotting流程进行转膜与检测。采用该方案，通常可对2,000–5,000个HSCs进行分析，在某些情况下甚至可低至500个细胞获得有效数据，远少于大多数文献报道所需的20,000至40,000个细胞。本方案可广泛适用于其他造血细胞，使得利用常规实验室技术对少量细胞进行系统分析成为可能。

引言

造血干细胞（HSCs）是一类具有自我更新能力的细胞，能够分化为所有类型的血细胞。它们在骨髓中数量相对稀少，使得生化分析较为困难。适用于稀有细胞分析的方法，如流式细胞术，对于定量细胞表面标志物和细胞内蛋白的相对含量极为有用。然而，对细胞内蛋白的分析需要采用细胞通透化处理，以允许抗体进入细胞，但并非所有细胞表面表位都能在这些处理过程中保持完整1,2。此外，可用于流式细胞术以区分不同蛋白亚型或切割产物的抗体往往难以获得，因此研究者在某些类型的分析中仍依赖于蛋白质印迹（Western blot）。

细胞裂解物的蛋白质印迹（Western blot）分析是大多数实验室的常规操作。细胞可在保持细胞表面分子表位完整的天然条件下进行纯化，随后制备并分析细胞裂解物。然而，通过蛋白质印迹法分析稀有原代细胞群体中的蛋白质时，通常需要处死大量动物以获得足够的细胞数量。通过对多个步骤进行微小调整，一种传统的蛋白质印迹实验方案能够检测相对少量造血干细胞（HSCs）中的蛋白质（根据目标蛋白的不同，所需细胞数为500至15,000个）。这些调整包括精确计数细胞、小心处理细胞沉淀、尽量减少细胞在不同离心管之间的转移以降低细胞损失，以及使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的浓缩上样缓冲液裂解确定数量的细胞。许多已发表的研究报告中使用的蛋白质印迹实验均需20,000个或更多的HSCs3,4,5,6,7；而该简易方法可将获得等效数据所需的细胞数量及实验动物数量减少4至40倍。本实验方案设计为以每个细胞为基础进行结果归一化，而非依赖内参对照。这种方法可以检测到蛋白质总体水平的下降，而若以内参对照进行归一化，则此类变化可能被忽略。以单个细胞为基础进行归一化的重要性此前已在基因表达数据分析中有所阐述8，该原则同样适用于蛋白质印迹法中的蛋白定量。此优化后的实验方案适用于所有需要分析少量细胞的研究人员。

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方案

所有操作必须遵循机构的动物使用和护理指南。该方案最初用于分析小鼠造血干细胞和祖细胞（HSCs 和 HPs），但也可根据需要调整用于其他细胞群体的分析。

1. 流式细胞术分离小鼠造血干细胞和造血祖细胞

  1. 按照文献中所述方法收获小鼠骨髓细胞6。
    注：在图1和图2所示数据中，骨髓细胞来源于C57BL/6J小鼠。
  2. 使用小鼠谱系细胞耗竭试剂盒，按照制造商说明书对骨髓细胞进行谱系耗竭处理。
  3. 按照文献所述方法，用针对目标细胞表面标志物的抗体孵育细胞7。在图1和图2所示实验中，使用的抗体包括针对Sca-1、Kit、Flt3以及谱系（Lin）标志物Mac1、Gr1、CD3e、B220和Ter119的抗体。
  4. 将2,000 - 20,000个Lin- Sca1+Kit+ Flt3-细胞（HSCs）或Lin-Sca1-Kit+细胞（HPs）分选至含有0.1 mL含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL离心管中。
    注：在图1和图2所示实验中，使用配备70 µM喷嘴的流式细胞仪进行细胞分选。最大收集体积为1.4 mL。

2. 样品制备

注意：此步骤至关重要。请非常小心地处理样品。去除上清液时，务必小心不要扰动细胞沉淀。

  1. 将含有分选细胞的1.5 mL离心管置于摆桶转子中，于4 °C、500 × g条件下离心5 min。使用移液器和20 µL吸头，小心吸除上清液，仅保留约100 µL，注意不要扰动细胞沉淀。
    1. 如果样本细胞数少于 5,000 个，且分选后样本总体积小于 0.2 mL，应先将细胞转移至低吸附的 0.2 mL PCR 管中，再进行离心。
    2. 如果样本细胞数少于 5,000 个且体积超过 0.2 mL，需在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞，保留 200 µL 上清液，弃去其余部分。将沉淀的细胞重悬于剩余的 200 µL 上清液中，转移至 0.2 mL PCR 管，再次离心。第二次离心后，弃去上清液，仅保留 20–30 µL，将细胞沉淀重悬。
  2. 将细胞重悬于管中剩余的上清液中。如有必要，可加入额外的含2% FBS的PBS（也可使用含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS或仅使用PBS）以获得5 × 10⁶ 个细胞/mL的浓度。4 至 5 × 105 cells/mL
    注意：使用细胞计数仪获得的细胞计数来估算用于重悬细胞的体积。
  3. 使用 2 - 5 µL 重悬的细胞，通过自动细胞计数仪（按照制造商说明书操作）或血细胞计数板测定准确的细胞浓度9.
  4. 将含有所需数量细胞的重悬细胞液转移至新的1.5 mL离心管中。对于本实验中的 图1，转移2,000、1,000或500个HSCs或HPs。所需细胞数量取决于Western blot检测获得的信号强度，需通过实验经验确定。使用20 µL或100 µL的Eppendorf移液器吸头进行转移。
  5. 在4 °C条件下，以500 × g离心力用水平转子离心机离心5分钟。
  6. 为制备100倍浓缩储存液，按照生产商说明书将蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂溶解于DMSO中。
  7. 通过将厂家提供的4x Laemmli上样缓冲液与等体积的蒸馏水混合，配制2x Laemmli上样缓冲液。加入适量的100x蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂储备液，使2x Laemmli上样缓冲液中抑制剂的终浓度为2x。
    注意：2× Laemmli 上样缓冲液可预先配制，但在将其（含抑制剂）加入细胞沉淀以裂解细胞之前，应立即加入蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂，具体操作如下一步所述。
  8. 小心地从细胞沉淀的上清液中移除部分上清，向留有细胞沉淀的离心管中剩余的上清液加入等体积的2x Laemmli样品缓冲液，同时加入蛋白酶体抑制剂和磷酸酶抑制剂，使最终体系中细胞浓度为500个细胞/µL，并处于1x Laemmli样品缓冲液中。
    注意：例如，在步骤 2.5 中，若将 2,000 个细胞溶于总体积为 20 µL 的溶液中转移至离心管，则在离心细胞后（步骤 2.6），应从沉淀中弃去 18 µL 上清液，并向剩余的 2 µL 上清液中加入等体积（2 µL）的 2× Laemmli 样品缓冲液，以获得最终浓度为 500 个细胞/µL 的 1× Laemmli 样品缓冲液体系。
  9. 尽快重悬沉淀以制备裂解液。此时，样品可立即进行SDS-PAGE凝胶电泳，或在液氮中速冻保存。2 并于 -80 °C 保存以备后续使用。

3. 电泳

  1. 将裂解液置于95 °C的加热块或沸水中加热5分钟。
  2. 按照标准方案，取1 - 40 µL裂解液（含有500至20,000个细胞当量）在SDS-PAGE凝胶中以100 V进行电泳10。
    注意：上样体积取决于获得理想信号所需的细胞数量，具体取决于目标蛋白的丰度以及抗体的质量。图1中的数据使用了2,000、1,000和500个细胞当量的裂解液。加样孔的宽度应在3 mm至1.5 mm范围内。可使用剪刀将市售的宽齿梳切削出1.5 mm的齿。

4. 转移与封闭

注意：按照标准方案进行蛋白质印迹实验11。步骤简述如下：

  1. 将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用甲醇预处理10秒，然后用蒸馏水短暂漂洗。
  2. 根据转印装置制造商提供的说明书，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至膜上。
  3. 转印完成后，按照标准操作流程，用2 mL含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBST（含0.1% Tween的PBS）在4 °C下封闭膜过夜11。

5. 抗体标记

  1. 将膜置于摇床上，加入抗体，在 4 °C 下孵育过夜，抗体稀释比例参照供应商推荐值。
    注意：材料表中列出了已针对造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPs）验证过的抗体及相应的抗体稀释比例。抗体标记步骤请按照标准操作流程进行8。

6. 检测

  1. 在室温下用 PBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
  2. 在室温下用 2 mL 增强型化学发光缓冲液孵育膜 1 分钟。根据成像系统的说明书，或使用放射自显影胶片和胶片处理器检测信号。

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结果

500 - 2,000 个纯化的 HSC 和 HP 的代表性结果如图所示 图1 和 图2。该 β-actin 信号在 图1 可从一只小鼠骨髓中纯化的低至500个HSC和HP中检测到信号。需要注意的是，将裂解物上样至1.5 mm加样孔时，500个HP产生的信号明显强于上样至3.0 mm加样孔。 图2 是 EIF4G 和 Rps6 磷酸化（p-Rps6）的蛋白质印迹，两者均参与蛋白质翻译的调控12，在造血干细胞（HSCs）以及有无干细胞因子（SCF）刺激的造血祖细胞（HPs）中 体外.

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讨论

Western印迹是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质及信号通路活化的常用技术。通过对一种常用实验流程进行少量调整，我们能够常规性地在15,000个造血干细胞（HSCs）中检测到15种不同的蛋白质（材料表），在某些情况下甚至可在低至500个HSCs中实现检测。本实验方案中最关键的步骤包括：1）准确计数细胞；2）尽量减少样品在不同离心管之间的转移次数；3）直接使用Laemmli上样缓冲液裂解细胞。在使用Laemmli上样缓冲液裂解细胞沉淀时，我们发现，与其将细胞沉淀中的上清液完全移除后再重悬于Laemmli上样缓冲液中，不如在离心管中保留少量上清液，并加入等体积的2x Laemmli上样缓冲液，这样可有效避免细胞损失。使用水平转子离心机对细胞进行离心也可降低细胞丢失的风险。通过修剪梳子齿以缩小加样孔宽度，可提高检测的灵敏度。

通过对实验步骤进行这些简单的调整，我们获得了可重复的结果，其效果相当于已发表论文中使用 10 - 20 倍数量细胞所得到的结果3,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金 R01 CA149976（N.A.S）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
十二烷基硫酸钠（SDS）Fisher ScientificBP166-500SDS-PAGE
TEMEDFisher ScientificBP150-20SDS-PAGE
30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液Bio-Rad1610158SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8TEKNOVAT1588SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8TEKNOVAT1068SDS-PAGE
过硫酸铵Fisher ScientificBP179-25SDS-PAGE
mini-protean 3 梳子Bio-Rad1653360SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽Bio-Rad1658005EDUSDS-PAGE
转膜系统Bio-Rad1704155EDU转膜
PowerPac HC 电源Bio-Rad1645052EDU电泳
成像系统Bio-Rad1708195信号检测
4x Laemmli 上样缓冲液Bio-Rad1610747EDU样品制备
10x Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液Bio-Rad1610732EDU电泳
2-巯基乙醇Bio-Rad1610710EDU样品制备
RTA Mini PVDF 转膜试剂盒（适用于40次印迹）Bio-Rad1704272转膜
蛋白酶抑制剂混合物Sigma11697498001样品制备
磷酸酶抑制剂混合物Gold BiotechnologyGB-450-1样品制备
EIF4GCell signaling2469WB 抗体，已在1000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：图2
p-Rps6Cell signaling4858WB 抗体，已在1000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：图2
肌动蛋白（HRP 标记）abcamab49900WB 抗体，已在500个细胞中验证
抗体稀释比例：1:5000
参考（图）：图1、图2
LC-3Abcamab48394WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图5）
S6Cell Signaling2317WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图4）
4EBP1Cell Signaling9644WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图4）
p-4EBP1Cell Signaling2855WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图4）
TSC2Cell Signaling4308WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图4）
HSP90Cell Signaling4877WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图5）
PTENCell Signaling9188WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图S1）
mTORCell Signaling2983WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图S1）
p-mTORCell Signaling5536WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图S1）
PP2ABCell Signaling4953WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图S1）
p-AMPKaCell Signaling2535WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:1000
参考（图）：参考文献5（图S1）
肌动蛋白Santa Cruzsc-47778WB 抗体，已在15000个细胞中验证
抗体稀释比例：1:3000
参考（图）：参考文献5（图4）
谱系耗竭试剂盒（小鼠）Miltenyi Biotec130-090-858造血干细胞和祖细胞纯化
LS 柱Miltenyi Biotec130-041-305造血干细胞和祖细胞纯化
SCFPeproTech250-03磷酸化刺激
APC-Cy7 c-kit 抗体ThermoFisherA15423细胞分选
抗-B220ThermoFisher48-0452-82细胞分选
抗-CD3eThermoFisher48-0031-82细胞分选
抗-Mac1ThermoFisher48-0112-82细胞分选
抗-Gr1ThermoFisher48-5931-82细胞分选
抗-Ter119ThermoFisher48-5921-82细胞分选
带1.0 mm一体式垫片的间隔板Bio-Rad1653311SDS-PAGE
牛血清白蛋白（BSA）Research Products InternationalA30075膜封闭
血清Atlanta BiologicalsA12450培养基添加剂
细胞计数仪InvitrogenAMQAF1000细胞计数
血细胞计数板ThermoFisher S17040细胞计数
胶片Denville ScientificE3012信号检测
医用胶片处理器KonicaSRC-101A信号检测
Supersignal West Femto 最高灵敏度底物Therom Scientific34096信号检测
Allegra X-15R 离心机（转子 SX4750A）Beckman CoulterX-15R样品制备
BLUEstain 蛋白质分子量标准Gold BiotechnologyP007-500电泳
细胞分选仪BDFACSAria II样品制备
IncublockDenville ScientificI0510电泳

参考文献

  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
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  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
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SDS PAGE Laemmli Beta Actin

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