本文介绍了将工程化分裂型TET2酶（CiDER）导入哺乳动物细胞的详细实验方案，用于化学诱导DNA羟甲基化及表观遗传重塑。
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本文内容
摘要
摘要
DNA甲基化是哺乳动物基因组中一种稳定且可遗传的表观遗传修饰，参与调控基因表达以控制细胞功能。DNA甲基化的逆转，即DNA去甲基化，由十一种易位（TET）双加氧酶蛋白家族介导。尽管已有大量报道表明异常的DNA甲基化和去甲基化与发育缺陷及癌症相关，但这些表观遗传变化如何直接导致基因表达的后续改变或疾病进展仍不明确，这主要归因于缺乏能够在基因组中以精确时空分辨率准确添加或去除DNA修饰的可靠工具。为克服这一难题，我们设计了一种分裂型TET2酶，通过简单添加化学物质即可实现对5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化及哺乳动物细胞中表观遗传状态后续重塑的时间控制。本文描述了将基于工程化分裂TET2酶的化学诱导型表观基因组重塑工具（CiDER）导入哺乳动物细胞的方法，并利用免疫染色、流式细胞术或点印迹法对化学诱导产生的5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）进行定量检测。这种化学诱导型表观基因组重塑工具将在不改变遗传密码的前提下广泛用于细胞系统的探究，以及在多种生物系统中研究表观基因型与表型之间的关系。
引言
DNA甲基化主要指在胞嘧啶的5号碳位点上添加一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），该过程由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化。5mC是哺乳动物基因组中主要的表观遗传标记，通常介导转录抑制、X染色体失活以及转座子沉默1。DNA甲基化的逆转由Ten-eleven转位（TET）蛋白家族介导。TET酶属于依赖铁（II）和2-氧代戊二酸的双加氧酶，能够将5mC逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）。TET介导的5mC氧化为哺乳动物基因组的表观遗传调控增添了新的层次。TET的发现激发了表观遗传学领域对TET蛋白及其主要催化产物5hmC生物学功能的广泛研究兴趣。5hmC不仅是TET介导的主动DNA去甲基化过程中的中间产物2,3,4，同时也可作为一种稳定的表观遗传标记5,6,7,8。尽管DNA羟甲基化与基因表达高度相关，且DNA羟甲基化的异常改变与某些人类疾病相关9....
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方案
1. 细胞培养、质粒转染与化学诱导
- 在添加了10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养贴壁细胞系（例如人胚胎肾HEK293T细胞）。
- 用CiDER质粒转染细胞。
- 转染前至少18小时，将0.3 × 106个细胞接种于6孔板的每孔中，每孔加入2.5 mL合适的DMEM培养基，于37 °C过夜培养，使细胞融合度达到60–80%。
- 使用前将转染试剂预热至室温。
- 在无菌离心管中加入250 µL无血清培养基。
注：此体积适用于融合度为80%的6孔板。如需调整，请根据培养板尺寸或细胞数量按比例增减培养基体积。 - 将2.5 µg编码CiDER18的质粒或TET2催化结构域（TET2CD，作为阳性对照）12,13加入无血清培养基中，用移液器轻轻混匀。
- 向稀释后的DNA混合物中加入7.5 µL转染试剂，用移液器轻轻混匀。
- 室温孵育20–30分钟。
- 更换预热的培养基，将上述混合物逐滴加入各孔中，并轻轻摇动细胞培养板，....
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结果
化学诱导的5mC向5hmC转化可通过单细胞水平的免疫染色、对转染后（mCherry阳性）细胞群体的流式细胞术分析，或如图1所示的更定量的点杂交实验进行验证。本研究中始终使用TET2的催化结构域（TET2CD）作为阳性对照。有关雷帕霉素诱导的5hmC全基因组变化及染色质可及性的详细信息，请参见参考文献18-20。
图1：CiDER介导的HEK293T细胞中可诱导DNA羟甲基化。（A）基于分裂型TET2酶构建的化学诱导表.......
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讨论
本文展示了利用工程化的分裂型TET2酶实现对DNA羟甲基化的时间控制。自从发现TET家族的5-甲基胞嘧啶双加氧酶以来，已有大量研究致力于解析TET蛋白的生物学功能及其主要催化产物5hmC1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。然而，对基因组中DNA修饰实现时间上精确控制仍是该领域面临的一项重大挑.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢美国国立卫生研究院基金（R01GM112003，授予 YZ）、威尔奇基金会（BE-1913，授予 YZ）、美国癌症协会（RSG-16-215-01 TBE，授予 YZ）、德克萨斯州癌症预防与研究研究所（RR140053，授予 YH；RP170660，授予 YZ）、美国心脏协会（16IRG27250155，授予 YH）以及约翰·S·邓恩基金会合作研究奖计划提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| 雷帕霉素 | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| 多聚甲醛，16% 溶液 | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| 盐酸 | Amresco | 0369-500ML | |
| 牛血清白蛋白 | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）抗体（pAb） | Active Motif | 39769 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB 经济型真空烘箱，0.6 立方英尺（17 L） | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC，20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot 点印迹装置 | BIO-RAD | 1706545 | |
| 抗 5-甲基胞嘧啶（5mC）抗体，克隆 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| 抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL 溶液 | Gendepot | W3653-100 |
参考文献
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), ....
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