本文介绍了将工程化分裂型TET2酶（CiDER）导入哺乳动物细胞的详细实验方案，用于化学诱导DNA羟甲基化及表观遗传重塑。
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本文内容
摘要
摘要
DNA甲基化是哺乳动物基因组中一种稳定且可遗传的表观遗传修饰，参与调控基因表达以控制细胞功能。DNA甲基化的逆转，即DNA去甲基化，由十一种易位（TET）双加氧酶蛋白家族介导。尽管已有大量报道表明异常的DNA甲基化和去甲基化与发育缺陷及癌症相关，但这些表观遗传变化如何直接导致基因表达的后续改变或疾病进展仍不明确，这主要归因于缺乏能够在基因组中以精确时空分辨率准确添加或去除DNA修饰的可靠工具。为克服这一难题，我们设计了一种分裂型TET2酶，通过简单添加化学物质即可实现对5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化及哺乳动物细胞中表观遗传状态后续重塑的时间控制。本文描述了将基于工程化分裂TET2酶的化学诱导型表观基因组重塑工具（CiDER）导入哺乳动物细胞的方法，并利用免疫染色、流式细胞术或点印迹法对化学诱导产生的5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）进行定量检测。这种化学诱导型表观基因组重塑工具将在不改变遗传密码的前提下广泛用于细胞系统的探究，以及在多种生物系统中研究表观基因型与表型之间的关系。
引言
DNA甲基化主要指在胞嘧啶的5号碳位点上添加一个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），该过程由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化。5mC是哺乳动物基因组中主要的表观遗传标记，通常介导转录抑制、X染色体失活以及转座子沉默1。DNA甲基化的逆转由Ten-eleven转位（TET）蛋白家族介导。TET酶属于依赖铁（II）和2-氧代戊二酸的双加氧酶，能够将5mC逐步氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）。TET介导的5mC氧化为哺乳动物基因组的表观遗传调控增添了新的层次。TET的发现激发了表观遗传学领域对TET蛋白及其主要催化产物5hmC生物学功能的广泛研究兴趣。5hmC不仅是TET介导的主动DNA去甲基化过程中的中间产物2,3,4，同时也可作为一种稳定的表观遗传标记5,6,7,8。尽管DNA羟甲基化与基因表达高度相关，且DNA羟甲基化的异常改变与某些人类疾病相关9,10,11，但DNA表观遗传修饰与表型之间的因果关系往往仍难以确立，部分原因在于缺乏可靠的工具，以精确的时间和空间分辨率在基因组中定点添加或去除DNA修饰。
本文报道了一种化学诱导型表观基因组重塑工具（CiDER）的应用，以克服研究DNA羟甲基化与基因转录之间因果关系所面临的技术难题。该设计基于以下假设：TET2的催化结构域（TET2CD）在哺乳动物细胞中表达时可被分割为两个无活性的片段，并可通过化学诱导二聚化策略恢复其酶活性（图1A）。为了构建分裂型TET2CD系统，我们依据已报道的TET2-DNA复合物晶体结构（该结构缺少低复杂性区域）12，在包含富含半胱氨酸区域和双链β-螺旋（DSBH）折叠结构的TET2CD中选择了六个切割位点。随后，将一段合成基因分别插入TET2CD的上述选定切割位点，该基因编码雷帕霉素诱导型二聚化模块——FK506结合蛋白12（FKBP12）和雷帕霉素结合域（FRB）（后者为雷帕霉素哺乳动物靶蛋白的一部分）14,15，并包含一个自剪切肽T2A多肽序列16,17。选择TET2作为工程化改造靶点基于以下考虑：首先，在包括髓系疾病和癌症在内的多种人类疾病中，常观察到TET2的体细胞突变及其伴随的DNA羟甲基化水平降低10，这些信息有助于识别需避免插入的敏感位点；其次，TET2催化结构域的大部分区域，特别是低复杂性区域，对酶活性并非必需12，因此我们能够构建一个最小化的分裂型TET2，用于可诱导的表观遗传修饰。在筛选了15个以上构建体后，我们选择了一个在哺乳动物系统中表现出最高雷帕霉素诱导酶活性恢复效率的构建体，并将其命名为CiDER18。本文描述了使用mCherry标记的CiDER在雷帕霉素诱导下实现可调控的DNA羟甲基化及表观基因组重塑的方法，并展示了在HEK293T细胞模型系统中验证CiDER介导的5hmC生成的三种实验方法。
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方案
1. 细胞培养、质粒转染与化学诱导
- 在添加了10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养贴壁细胞系（例如人胚胎肾HEK293T细胞）。
- 用CiDER质粒转染细胞。
- 转染前至少18小时，将0.3 × 106个细胞接种于6孔板的每孔中，每孔加入2.5 mL合适的DMEM培养基，于37 °C过夜培养，使细胞融合度达到60–80%。
- 使用前将转染试剂预热至室温。
- 在无菌离心管中加入250 µL无血清培养基。
注：此体积适用于融合度为80%的6孔板。如需调整，请根据培养板尺寸或细胞数量按比例增减培养基体积。 - 将2.5 µg编码CiDER18的质粒或TET2催化结构域（TET2CD，作为阳性对照）12,13加入无血清培养基中，用移液器轻轻混匀。
- 向稀释后的DNA混合物中加入7.5 µL转染试剂，用移液器轻轻混匀。
- 室温孵育20–30分钟。
- 更换预热的培养基，将上述混合物逐滴加入各孔中，并轻轻摇动细胞培养板，使转染试剂与DNA混合物均匀分布。
- 继续培养细胞与混合物过夜，随后将含转染试剂的培养基更换为2 mL新鲜的完全DMEM培养基。
- 化学诱导
- 将溶于DMSO的2 mM雷帕霉素储备液用合适的完全培养基稀释至20 µM工作浓度。
- 向含有2 mL培养基的转染细胞中加入20 µL稀释后的雷帕霉素，使终浓度为200 nM。
注：孵育48小时后，细胞可用于5hmC生成量的定量分析或其他下游实验。如需监测诱导效率，可每隔3小时取样一次，进行后续5hmC定量分析，方法如下文所述，并参见图1。 - 为更准确地定量5hmC诱导效率，应单独接种多个孔，以便每隔3小时监测一次细胞状态。
2. 通过免疫染色定量雷帕霉素诱导的5hmC生成
- 5hmC 免疫荧光染色
注意：加入足量固定液，固定液由含 3 N HCl 的 PBS 中加入 4% 多聚甲醛和 0.2% 表面活性剂（如 Triton X-100）组成，确保完全覆盖培养板中的所有细胞。例如，对于 6 孔板中的一个孔，500 µL 溶液已足够。所有步骤均在室温下进行。- 固定细胞：向经雷帕霉素处理的细胞中加入 PBS 配制的 4% 多聚甲醛，室温孵育 15 分钟。对照组使用表达 mCherry-CiDER 但未接受雷帕霉素处理的细胞。避免振荡。
警告：多聚甲醛具有毒性，请穿戴适当的防护装备。 - 弃去固定液。将固定后的细胞在含 0.2% 表面活性剂的 PBS 中孵育 30 分钟，以通透细胞膜。
- 弃去通透液。向通透后的细胞中加入 3 N HCl，孵育 15 分钟以变性 DNA。
- 弃去 HCl 溶液。向细胞中加入 100 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0），孵育 10 分钟以中和 pH。
- 弃去所有溶液。用 PBS 彻底清洗细胞 3–5 次，每次均彻底移除 PBS。
注意：每次洗涤均需加入足量 PBS。例如，对于 6 孔板中的一个孔，1 mL PBS 已足够。 - 加入封闭缓冲液（含 1% BSA 和 0.05% 表面活性剂（如 Tween 20）的 PBS），轻轻振荡孵育 1 小时，以封闭非特异性结合位点。
- 弃去封闭液。向细胞中加入稀释后的 5hmC 抗体（1:200），室温孵育 2 小时或 4 °C 过夜。
- 用 PBS 洗涤细胞三次，每次 15 分钟。
- 向细胞中加入稀释后的荧光素（FITC）标记的二抗（1:200），孵育 1 小时。
- 用 PBS 充分洗涤细胞三次，以去除残留抗体。
- 加入 250 ng/mL 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），染色细胞核 5 分钟，随后弃去染色液。
- 将免疫染色后的细胞样品置于载玻片或玻璃底培养皿中，用于共聚焦成像。代表性结果见 图 1B。
- 固定细胞：向经雷帕霉素处理的细胞中加入 PBS 配制的 4% 多聚甲醛，室温孵育 15 分钟。对照组使用表达 mCherry-CiDER 但未接受雷帕霉素处理的细胞。避免振荡。
- 流式细胞术
注意：以下染色步骤使用 96 孔圆底板。通常每孔加入 150 µL 试剂即可。- 将转染并经雷帕霉素诱导的细胞重悬于 FACS 缓冲液（含 1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS）中。对照组使用表达 CiDER 但未接受雷帕霉素处理的细胞。
- 按照步骤 2.1 所述方法对细胞进行固定和通透处理。
- 向细胞中加入 2 N HCl，孵育 10 分钟以变性 DNA。
- 弃去 HCl 溶液。按照步骤 2.1 所述方法对细胞进行中和和封闭处理。
- 向细胞中加入稀释后的抗 5hmC 抗体（1:200），室温孵育 1 小时或 4 °C 过夜。
- 用 FACS 缓冲液洗涤细胞三次，每次均彻底移除缓冲液。
- 加入稀释后的荧光素（FITC）标记的二抗（1:400），用于荧光激活细胞分选（FACS）分析，室温孵育 1 小时。
- 用 FACS 缓冲液洗涤细胞三次。
- 样品即可用于 FACS 分析。代表性结果见 图 1C-D。
3. 点杂交法检测5hmC和5-甲基胞嘧啶（5mC）含量
- 使用商业DNA提取试剂盒从转染并经雷帕霉素诱导的细胞中分离基因组DNA。对照组使用转染CiDER但未进行雷帕霉素处理的细胞。
- 将真空烘箱加热至80 °C，并将硝酸纤维素膜预先在双蒸水（double-distilled H2O）中浸泡，随后转移至6x SSC（saline-sodium citrate）缓冲液中浸泡10分钟。
- 将等量的DNA（总量为2 µg，溶于TE缓冲液）各60 µL加入96孔PCR板中。其余孔中每孔加入30 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）。
- 在96孔板中进行垂直方向的两倍梯度稀释：将第1行每孔中的30 µL溶液转移至第2行对应列的孔中，混匀后继续将30 µL溶液转移至下一行的对应孔，依此类推直至达到板的边界。最后一行转移后弃去多余的30 µL溶液。
- 向每孔中加入20 µL 1 M NaOH和10 mM EDTA，密封PCR板，并在95 °C加热10分钟，以彻底变性DNA双链。
- 立即将样品置于冰上冷却，向每孔中加入50 µL冰浴预冷的2 M醋酸铵（ammonium acetate，pH 7.0），并在冰上孵育10分钟。
注意：步骤3.7–3.10涉及使用真空装置。 - 将已预浸泡的膜安装至点印迹（dot blot）装置中，并使用完全真空去除残留缓冲液。
- 向点印迹装置的每孔中加入200 µL TE缓冲液以洗涤膜，开启真空以去除TE缓冲液。
- 将前序步骤（3.1–3.6）中制备的变性DNA加入点印迹装置的每孔中。 开启真空以去除溶液。
- 向每孔中加入200 µL 2x SSC，洗涤膜，并使用真空彻底去除残留液体。
- 拆卸点印迹装置，取出膜，并用20 mL 2x SSC冲洗整张膜。
- 将膜在空气中干燥20分钟。
- 在真空条件下于80 °C烘烤膜2小时。
- 向膜中加入封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液），室温孵育1小时。
- 弃去封闭液，向膜中加入稀释后的5hmC抗体（1:5,000）或5mC抗体（1:1,000），4 °C孵育过夜。
- 用TBST缓冲液洗涤膜三次，每次10分钟，以去除未结合的抗体。彻底清除TBST。
- 向膜中加入HRP标记的二抗（抗兔HRP(5hmC)稀释至1:10,000，抗鼠HRP(5mC)稀释至1:3,000），室温孵育1小时。
- 用TBST缓冲液洗涤膜三次，每次10分钟。
- 向膜中加入ECL化学发光底物，使用化学发光检测仪显影5hmC信号。代表性结果见图1E。
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结果
化学诱导的5mC向5hmC转化可通过单细胞水平的免疫染色、对转染后（mCherry阳性）细胞群体的流式细胞术分析，或如图1所示的更定量的点杂交实验进行验证。本研究中始终使用TET2的催化结构域（TET2CD）作为阳性对照。有关雷帕霉素诱导的5hmC全基因组变化及染色质可及性的详细信息，请参见参考文献18-20。
图1：CiDER介导的HEK293T细胞中可诱导DNA羟甲基化。（A）基于分裂型TET2酶构建的化学诱导表...
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讨论
本文展示了利用工程化的分裂型TET2酶实现对DNA羟甲基化的时间控制。自从发现TET家族的5-甲基胞嘧啶双加氧酶以来，已有大量研究致力于解析TET蛋白的生物学功能及其主要催化产物5hmC1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。然而，对基因组中DNA修饰实现时间上精确控制仍是该领域面临的一项重大挑...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢美国国立卫生研究院基金（R01GM112003，授予 YZ）、威尔奇基金会（BE-1913，授予 YZ）、美国癌症协会（RSG-16-215-01 TBE，授予 YZ）、德克萨斯州癌症预防与研究研究所（RR140053，授予 YH；RP170660，授予 YZ）、美国心脏协会（16IRG27250155，授予 YH）以及约翰·S·邓恩基金会合作研究奖计划提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| 雷帕霉素 | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| 多聚甲醛，16% 溶液 | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| 盐酸 | Amresco | 0369-500ML | |
| 牛血清白蛋白 | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）抗体（pAb） | Active Motif | 39769 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB 经济型真空烘箱，0.6 立方英尺（17 L） | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC，20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot 点印迹装置 | BIO-RAD | 1706545 | |
| 抗 5-甲基胞嘧啶（5mC）抗体，克隆 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| 抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL 溶液 | Gendepot | W3653-100 |
参考文献
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