成年皮肤来源人原代角质形成细胞的分离与培养

摘要

人类皮肤作为抵御外部环境的第一道防线。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的方法。这些分离得到的角质形成细胞可用于多种实验体系，是研究皮肤生物学中分子机制的理想模型。 体外.

摘要

角质形成细胞的主要功能是维持表皮的结构完整性，从而形成抵御外界环境的机械屏障。此外，角质形成细胞作为先天免疫系统的一部分，能够快速、非特异性地响应抗原刺激，在表皮免疫反应的启动、维持和调控中发挥关键作用。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的实验方案，并证明这些细胞在钙诱导下可发生终末分化，表现为分化标志物兜甲蛋白（involucrin）表达水平升高。此外，我们还显示，分离获得的角质形成细胞可响应IL-1β诱导的细胞内信号通路激活，表现为p38 MAPK通路的活化。综上所述，本文描述了一种从成人皮肤中分离和培养原代人角质形成细胞的方法。由于角质形成细胞是表皮中最主要的细胞类型，该方法适用于研究皮肤生物学中的分子机制 关键词：角质形成细胞，原代细胞培养，表皮，终末分化，兜甲蛋白，IL-1β，p38 MAPK，皮肤生物学 体外.

引言

皮肤是人体最大的器官，作为抵御外部环境的保护屏障。皮肤主要由两层构成：真皮层和表皮层，其中表皮层构成皮肤的最外层。表皮中最丰富的细胞类型是角质形成细胞，占表皮细胞总量的95%以上^1,2。角质形成细胞在表皮中处于不同的分化阶段，并有序地分布为基底层、棘层、颗粒层和角质层，分别对应特定的分化阶段³。角质形成细胞的主要功能是维持表皮的结构完整性，从而形成一道完整的外界屏障。

角质形成细胞也是皮肤抵御病原体的第一道防线，因此在先天免疫反应中发挥着重要作用^4,5角质形成细胞暴露于外界刺激后，会激活细胞内信号通路，进而产生多种炎症介质，包括细胞因子、趋化因子和抗菌肽。这些由角质形成细胞产生的蛋白质通过募集和激活树突状细胞、中性粒细胞及特定T细胞等免疫细胞，参与炎症反应。^6,7因此，由于角质形成细胞在多种生物过程中发挥着关键作用，本文所介绍技术的原理旨在生成一种 体外 用于研究皮肤生物学的模型。通常采用新生儿包皮来源的原代角质形成细胞培养物来研究皮肤生物学

方案

采集接受整形手术的健康成年志愿者的皮肤样本需获得所在机构伦理委员会的批准。本方案已通过丹麦中日德兰大区区域伦理委员会（M-20110027）的审批。本文所述方法参考了 Maciaq et al.¹⁰ 和 Liu 与 Karasek¹¹ 所开展的类似研究。

1. 从人皮肤中分离角质形成细胞

1. 首先配制以下溶液：50 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 0.1% 葡萄糖的 DPBS 溶液。混合后用 0.2 µm 滤器过滤除菌。配制 10 mL RPMI-1640 + 2% FBS 溶液、50 mL DPBS 以及无血清角质形成细胞培养基（KSFM）。向 500 mL KSFM 中加入 KSFM 添加剂和 250 µL 庆大霉素。使用前将所有溶液预热至 37 °C。
2. 收集接受整形手术的健康成年志愿者的皮肤组织。所用皮肤样本大小约为 10 cm × 15 cm，但可有所差异。运输过程中将皮肤样本置于含冷却元件的泡沫箱中以保持低温。如有需要，皮肤样本可在 4 °C 下保存过夜。
3. 使用无菌剪刀、手术刀和镊子去除皮肤组织下方的脂肪组织。
4. 将皮肤组织（约 10 cm × 15 cm）用针固定在培养皿上方的无菌盖上，使其呈绷紧状态。首先用干燥的无菌纱布擦拭皮肤表面，随后用浸有 70% 乙醇的无菌纱布再次....

结果

钙诱导的终末分化
人角质形成细胞在钙处理后会发生终末分化^14,15,16。原代人角质形成细胞的分离与培养按照上述方案进行。当细胞融合度达到约50–60%时，用钙（1.2 mM）或对照溶剂处理细胞，并于第0、1、2天拍摄细胞图像。图1展示了钙刺激后观察到的角质形成细胞形态学变化。

钙刺激后兜甲蛋白的表达增加
培养的人角质形成细胞生长至约50 - 60%融合度后，用钙离子（1.2 mM）或对照溶剂处理24和48小时。我们发现，随着角质形成细胞形态学变化所反映的细胞分化程度升高，分化标志物兜甲蛋白的mRNA表达在钙刺激后显著上调。与对照组相比，刺激24小时和48小时后，兜甲蛋白mRNA表达分别升高约5.5倍和3.5倍（图.......

讨论

本文介绍了如何从成人皮肤中轻松分离原代人角质形成细胞，以及如何在体外培养这些细胞。in vitro。该模型可广泛应用于表皮细胞生物学研究，对于致力于皮肤疾病研究的科研人员也具有重要价值。

本方案的优点之一在于，与从接受包皮环切术的新生男婴包皮中分离的角质形成细胞相比，成人患者的原代人角质形成细胞可来源于男性和女性，并且可涵盖任何年满18岁的个体。因此，这些细胞的生物学多样性远大于新生儿包皮来源的角质形成细胞。此外，接受整形手术（如乳房缩小术或减重手术）的患者可提供相对较大的皮肤样本。

如上所述，表皮由不同层次组成，这些层次对应角质形成细胞的特定分化阶段。为了研究皮肤生物学，此处描述的模型受限于缺乏三维微环境。该模型无法模拟表皮的不同层次以及皮肤中存在的多种细胞类型。为克服这一局限，可采用人皮肤等效模型，该模型包含多层上皮结构，其中角质形成细胞在暴露于气-液界面时发生分化，从而更接近于天然表皮^17,18

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	细胞培养基
KSFM 添加剂	ThermoFisher Scientific	37000-015	KSFM 培养基专用添加剂
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	不含钙和镁的 DPBS
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	二甲基亚砜
庆大霉素	ThermoFisher Scientific	15710-049	细胞培养基添加剂
灭菌滤器	Sartorius	16534	孔径为 0.2 µm 的注射器滤器
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T7409	用于细胞消化
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	用于灭活胰蛋白酶
镊子	-	-	任何厂商生产的镊子均可使用
剪刀	-	-	任何厂商生产的剪刀均可使用
手术刀	Swann Morton	0501	任何厂商生产的手术刀均可使用
70% 乙醇	-	-	-
纱布垫	NOBAMED	875420	任何供应商提供的纱布垫均可使用
足部削皮刀	Credo Solingen	1510	任何供应商提供的足部削皮刀均可使用
培养皿	TPP	93100	任何供应商提供的培养皿均可使用
金属滤网	-	-	自制金属滤网，孔径 1 mm
75 cm2 培养瓶	NUNC	156499	-
150 cm2 培养瓶	TTP	90151	-
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	ThermoFisher Scientific	25300-062	传代时用于细胞消化