本方案描述了用于制备光学质量玻璃表面的方法，该表面吸附有含长链烃类的化合物，可用于监测活体样本中巨噬细胞的融合，并实现对固定样本的超分辨率显微成像。
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本文内容
摘要
摘要
可视化活体样本中多核巨细胞（MGCs）的形成过程一直具有挑战性，原因是大多数活细胞成像技术需要光线透过玻璃传播，但在玻璃表面，巨噬细胞融合极为罕见。本实验方案介绍了多种光学级玻璃表面的制备方法，通过吸附含长链烃类的化合物，可将玻璃转变为促融合表面。首先，描述了用于表面修饰的洁净玻璃表面的制备方法；其次，提供了一种将含长链烃类化合物吸附至玻璃表面的方法，以将非促融合性玻璃转化为促融合基质；第三，本方案阐述了表面微图案的制备，可实现对MGC形成的高时空控制度；最后，介绍了玻璃底培养皿的制备方法。本方案应用示例包括 体外 以细胞系统作为研究巨噬细胞融合和多核巨细胞形成的模型。
引言
多核巨细胞（MGCs）的形成伴随人体多种以慢性炎症为特征的病理状态1。尽管学界普遍认同单核巨噬细胞融合形成MGCs2，但令人意外的是，极少有研究在活体样本的背景下展示出融合过程3,4。其原因在于，大多数成像技术所需的洁净玻璃表面在炎症性细胞因子诱导下并不能促进巨噬细胞融合5。事实上，若以洁净玻璃作为巨噬细胞融合的基质，通常需要使用低至中等倍率物镜（即，10 - 20X），并进行超过15小时的连续成像，才能观察到一次融合事件。
另一方面，具有促融合特性的塑料表面（例如，Permanox）或细菌培养级塑料可促进细胞融合2。然而，通过塑料成像存在困难，因为该基质较厚且会散射光线。这使得成像变得复杂，需要使用长工作距离（LWD）物镜。但与盖玻片校正物镜相比，LWD物镜通常聚光能力较低。此外，由于塑料具有双折射性，因此无法采用利用光线通过样本时偏振状态变化的技术，如微分干涉差（DIC）成像。塑料使用中的障碍还体现在无法预测巨噬细胞融合/多核巨细胞（MGC）形成将在表面的哪个位置发生。综上所述，这些限制使得巨噬细胞融合的可视化仅能依赖相差光学显微技术，且需要较长的连续成像时间（>15 小时）以及低分辨率成像。
我们最近在使用固定巨噬细胞/多核巨细胞（MGCs）进行单分子超分辨率显微镜观察时，发现了一种具有高度促融合性的玻璃表面4。这一发现令人意外，因为在白细胞介素-4（IL-4）存在条件下，洁净的玻璃表面在24小时后的融合率极低，仅为约5%，该数值由融合指数确定4。我们发现，这种促进细胞融合的能力源于十八烯酰胺（oleamide）的污染。十八烯酰胺或其他含有长链烃类化合物的吸附可使玻璃表面具备促融合性。其中促融合性最强的化合物（石蜡）被微图形化后，能够对巨噬细胞融合实现高度的时空控制，并在相同时间内观察到的融合事件数量相比使用permanox表面增加了一倍。这些具备光学质量的表面首次揭示了活体样本中MGC形成的形态学特征和动力学过程。
在本方案中，我们描述了多种可用于监测活体样本中多核巨细胞（MGCs）形成的玻璃表面的制备方法。此外，我们证明这些表面适用于远场超分辨率成像技术。表面的制备取决于实验目的，每种表面均在下文中有相应示例说明。
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方案
利用动物的实验程序已获得梅奥诊所、珍利亚研究园区和亚利桑那州立大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 准备酸洗盖玻片
注意：从许多制造商处购买的盖玻片可能不如预期洁净。建议在涉及显微镜观察的任何实验操作前，常规对成批的盖玻片进行清洗处理。
- 购买高严格性盖玻片。需特别注意选择正确的厚度（0.15 或 0.17 mm）。
注意：盖玻片厚度的选择取决于显微镜物镜，具体数值可直接在物镜筒上找到。 - 在通风良好的化学通风橱中，将盖玻片置于12 M盐酸中孵育1小时，并进行超声处理（42 kHz，70 W）。使用新鲜的12 M HCl重复此步骤两次。
- 另取一个烧杯，装入超纯水并放入盖玻片。在通风良好的化学通风橱中对盖玻片进行5–10分钟的超声处理。重复此步骤十次。
- 在通风良好的化学通风橱中，将盖玻片置于纯丙酮中孵育30分钟，并进行超声处理。重复此步骤两次。
- 另取一个烧杯，装入无菌超纯水并放入盖玻片。在通风良好的化学通风橱中对盖玻片进行5–10分钟的超声处理。重复此步骤十次。
- 在化学通风橱中，将盖玻片置于100%乙醇中孵育30分钟，并进行超声处理。重复此步骤两次。
注意：乙醇的纯度至关重要。溶解性杂质会在玻璃表面干燥残留，可能促进巨噬细胞融合。 - 如需长期保存，可将经酸清洗的盖玻片放入盛有纯乙醇的容器中；或者用氮气吹干盖玻片后，置于真空干燥器中保存。
2. 融合性光学质量表面的制备
- 将不含DMSO的高熔点石蜡溶解于超纯甲苯中。
注意：储备液浓度为10 mg/mL，使用超纯甲苯按1:9稀释，得到1 mg/mL的工作液。
注意：甲苯具有致畸性，操作时应小心谨慎。甲苯废弃物应根据机构的化学品卫生管理计划进行处理。 - 取适量石蜡工作液，均匀覆盖于干燥且经酸清洗的盖玻片表面。倾去多余溶液，并用氮气或空气吹干盖玻片。如需批量处理，可使用适配盖玻片的考普林染色缸（Coplin jar）。
- 使用无尘擦拭布沿x轴方向擦拭3次，再沿y轴方向擦拭3次，对盖玻片进行抛光处理（参见材料表）。
- 在实验开始前，立即用无菌超纯水清洗盖玻片，随后在生物安全柜中用紫外光照射15–30分钟进行灭菌。也可选用环氧乙烷或γ射线辐照对盖玻片进行灭菌。
3. 微图案化含碳氢化合物以将融合限定在预定区域
- 将酸清洗后的盖玻片干燥，并将其固定在平坦的表面上。
- 使用镊子小心地将金质透射电子显微镜定位网格浸入烃类化合物的工作溶液中。选择符合实验最终目标的烃类化合物（见表1）。用滤纸轻轻轻敲网格以吸去多余溶液，然后立即将网格置于盖玻片中央。待甲苯挥发干燥2分钟后，再进行下一步操作。
- 轻轻翻转盖玻片，确认网格已牢固附着于玻片表面。如果网格脱落，则使用新的盖玻片重复步骤3.2。
注意：若无等离子清洗仪，请跳过步骤3.4。 - 通过真空气体等离子体处理对盖玻片进行等离子清洗。
注意：定位网格起到掩模作用，保护其下方吸附的长链烃类区域免受等离子体影响；而未被网格覆盖的区域则因暴露于等离子体而失去融合能力。盖玻片暴露于等离子体的时间应通过实验经验确定。 - 使用尖头镊子小心地从玻片表面移除网格，以暴露出微米级图案。
4. 制备玻璃底培养皿
- 使用阶梯钻头在35-mm塑料培养皿底部钻一个6 - 10 mm的圆形孔。
注意：必须使用阶梯钻头以形成光滑的边缘。如果边缘过于粗糙，盖玻片将无法平整地贴合到培养皿底部。不平整的表面会增加显微镜观察的难度。 - 根据制造商说明，小心混合并脱除硅橡胶弹性体中的气泡（即，聚二甲基硅氧烷；PDMS）
- 在边缘附近均匀涂抹一层薄薄的弹性体即，围绕该孔洞进行切割。
注意：弹性体应呈现为围绕孔洞的连续薄带状结构。 - 轻轻将融合性盖玻片（见第2节）或干燥的酸清洗盖玻片（见第1节）覆盖在培养皿上，以封住被弹性体包围的孔洞。确保盖玻片与培养皿底部齐平，并延伸超出孔洞直径，使玻璃的大部分区域与塑料表面接触。将弹性体在50 °C下烘烤2–3小时以固化。
- 若偏好使用促融合玻璃，请对培养皿进行紫外灭菌，并按照标准操作规程培养细胞。然而，若需使用微图案，则进入步骤3.2进行微图案制备（微图案化过程中使用的气体等离子体可对培养皿灭菌，并使PDMS与玻璃强烈结合）。
5. 收集巯基乙酸盐诱导的巨噬细胞
- 按照先前描述的方法3,4,6，向8周龄的C57BL/6小鼠注射0.5 mL无菌的4%巯基乙酸肉汤溶液。
- 72小时后，根据批准的动物护理与使用指南实施安乐死，并用含5 mM乙二胺四乙酸的冰磷酸盐缓冲液进行腹腔灌洗以收集巨噬细胞。
- 以300 x g离心3分钟，将巨噬细胞沉淀重悬于1 mL DMEM:F12培养基中，该培养基添加有15 mM HEPES、10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（培养液）。
注意：随后使用Neubauer血细胞计数板对细胞进行计数。将巨噬细胞稀释至适当浓度后接种于材料表面。研究人员应根据实验目的仔细确定接种于特定表面的细胞数量。可参考原始文献中已知的标准方法。 - 30分钟后，用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的HBSS洗涤材料表面，以去除未贴壁的细胞，随后更换为新鲜培养液，并将培养物放回培养箱（37 °C，含5% CO2的空气环境）。
- 2小时后，吸除培养液，更换为添加有10 ng/mL IL-4的培养液。细胞成像操作详见其他文献4。
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结果
材料的理化参数对巨噬细胞融合程度具有显著影响7,8,9,10。此外，已知表面污染物可促进巨噬细胞融合11。因此，使用洁净的盖玻片作为巨噬细胞融合的阴性对照至关重要。按照方案1所述方法清洗后，盖玻片极为平整，无明显表面特征；而长链烃类吸附后经表面抛光处理，则可形成一定程度的纳米级形貌（图1）。
在洁净的盖玻片表面，巨噬细胞的融合率极低（图2）。相比之下，在存在IL-4的情况下培养24小时后，接种于吸附有长链烃类化合物表面的巨噬细胞发生显...
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讨论
需要鉴定并进一步开发能够促进巨噬细胞融合的光学级玻璃表面，其原因在于，直到最近，尚无已发表的研究能够在活体标本背景下直接观察巨噬细胞的融合过程3,4。这是因为通常使用的促融合塑料表面需要长工作距离（LWD）物镜，且主要局限于相差光学成像。通过设计一种光学级玻璃表面，克服了这些障碍，该表面不仅显著促进了巨噬细胞的融合速率，而且对多核巨细胞（MGCs）的形成实现了出人意料的空间控制。
尽管该技术能够利用先进的成像方法来监测巨噬细胞融合，但仍存在一定的局限性。尽管经抛光的表面吸附了长链烃类（例如油酰胺，石蜡 等等。）与具有促融合性的塑料表面相比，可产生极高的巨噬细胞融合率，但融合仍是一个空间上随机的过程（图2）。这一限制使得无法使用高倍物镜观察活体样本的融合过程，因为无法预知融合发生的位置。为克服这一限制，我们对石蜡进行微图案化处理，以将融合过程限制在预定区域
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Ugarova实验室成员以及代谢与血管生物学中心的研究人员对本研究工作的有益讨论。James Faust谨向2015年欧洲分子生物学实验室超分辨率显微镜课程的授课教师表示感谢。我们感谢Janelia研究所的Satya Khuon在LLSM样品制备方面提供的帮助。在本研究的审稿和拍摄阶段，James Faust得到了T32基金（5T32DK007569-28）的支持。本研究中的晶格光片显微镜部分由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）和贝蒂与戈登·摩尔基金会资助。T.U.的研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金HL63199资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| 定位网格 | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | 任何金质透射电镜网格均可使用 |
| 盖玻片（22×22 mm） | Thor Labs | CG15CH | 仅使用高严格性盖玻片 |
| 石蜡 | Sigma Aldrich | 17310 | |
| 凡士林 | Sigma Aldrich | 16415 | 若替代使用，必须不含α-生育酚 |
| 油酰胺 | Sigma Aldrich | O2136 | 需新鲜配制 |
| 异丙醇 | Sigma Aldrich | 278475 | |
| 甲苯 | Sigma Aldrich | 244511 | |
| 丙酮 | VWR International | BDH1101 | |
| 乙醇 | Electron microscopy sciences | 15050 | 使用低溶解固体含量的乙醇 |
| 盐酸 | Fischer Scientific | A144C-212 | 用于盖玻片的酸洗处理 |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | 按1:10比例混合，并在50 °C下固化4小时 |
| 35 mm培养皿 | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont 5号镊子 | Electron microscopy sciences | 72705 | 适用于第3.5节中移除透射电镜网格 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-0092 | 含15 mM HEPES |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strept） | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA溶液 | Sigma Aldrich | A9576 | 以0.1%浓度溶于HBSS中，用于洗涤非贴壁巨噬细胞 |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | 分装为10 μg/mL，储存于-20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | 适用于固定样品或无需对比剂的技术 |
| eGFP-LifeAct小鼠 | n/a | n/a | 适用于活体荧光成像 |
| Kimwipe纸巾 | Kimberly Clark | 34155 | 用于抛光吸附碳氢化合物的表面 |
参考文献
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