本方案描述了用于制备光学质量玻璃表面的方法，该表面吸附有含长链烃类的化合物，可用于监测活体样本中巨噬细胞的融合，并实现对固定样本的超分辨率显微成像。
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本文内容
摘要
摘要
可视化活体样本中多核巨细胞（MGCs）的形成过程一直具有挑战性，原因是大多数活细胞成像技术需要光线透过玻璃传播，但在玻璃表面，巨噬细胞融合极为罕见。本实验方案介绍了多种光学级玻璃表面的制备方法，通过吸附含长链烃类的化合物，可将玻璃转变为促融合表面。首先，描述了用于表面修饰的洁净玻璃表面的制备方法；其次，提供了一种将含长链烃类化合物吸附至玻璃表面的方法，以将非促融合性玻璃转化为促融合基质；第三，本方案阐述了表面微图案的制备，可实现对MGC形成的高时空控制度；最后，介绍了玻璃底培养皿的制备方法。本方案应用示例包括 体外 以细胞系统作为研究巨噬细胞融合和多核巨细胞形成的模型。
引言
多核巨细胞（MGCs）的形成伴随人体多种以慢性炎症为特征的病理状态1。尽管学界普遍认同单核巨噬细胞融合形成MGCs2，但令人意外的是，极少有研究在活体样本的背景下展示出融合过程3,4。其原因在于，大多数成像技术所需的洁净玻璃表面在炎症性细胞因子诱导下并不能促进巨噬细胞融合5。事实上，若以洁净玻璃作为巨噬细胞融合的基质，通常需要使用低至中等倍率物镜（即，10 - 20X），并进行超过15小时的连续成像，才能观察到一次融合事件。
另一方面，具有促融合特性的塑料表面（例如，Permanox）或细菌培养级塑料可促进细胞融合2。然而，通过塑料成像存在困难，因为该基质较厚且会散射光线。这使得成像变得复杂，需要使用长工作距离（LWD）物镜。但与盖玻片校正物镜相比，LWD物镜通常聚光能力较低。此外，由于塑料具有双折射性，因此无法采用利用光线通过样本时偏振状态变化的技术，如微分干涉差（DIC）成像。塑料使用中的障碍还体现在无法预测巨噬细胞融合/多核巨细胞（MGC）形成将在表面的哪个位置发生。综上所述，这些限制使得巨噬细胞融合的可视化仅能依赖相差光学显微技....
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方案
利用动物的实验程序已获得梅奥诊所、珍利亚研究园区和亚利桑那州立大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 准备酸洗盖玻片
注意：从许多制造商处购买的盖玻片可能不如预期洁净。建议在涉及显微镜观察的任何实验操作前，常规对成批的盖玻片进行清洗处理。
- 购买高严格性盖玻片。需特别注意选择正确的厚度（0.15 或 0.17 mm）。
注意：盖玻片厚度的选择取决于显微镜物镜，具体数值可直接在物镜筒上找到。 - 在通风良好的化学通风橱中，将盖玻片置于12 M盐酸中孵育1小时，并进行超声处理（42 kHz，70 W）。使用新鲜的12 M HCl重复此步骤两次。
- 另取一个烧杯，装入超纯水并放入盖玻片。在通风良好的化学通风橱中对盖玻片进行5–10分钟的超声处理。重复此步骤十次。
- 在通风良好的化学通风橱中，将盖玻片置于纯丙酮中孵育30分钟，并进行超声处理。重复此步骤两次。
- 另取一个烧杯，装入无菌超纯水并放入盖玻片。在通风良好的化学通风橱中对盖玻片进行5–10分钟的超声处理。重复此步骤十次。
- 在化学通风橱中，将盖玻片置于100%乙醇中孵育30分钟，并进行超声处理。重复此步骤两次。
注意：乙醇的纯度至关重要。溶解性杂质会在玻璃表面干燥残留，可能促进巨噬细胞融合。 - 如需长期保存，可将经酸清....
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结果
材料的理化参数对巨噬细胞融合程度具有显著影响7,8,9,10。此外，已知表面污染物可促进巨噬细胞融合11。因此，使用洁净的盖玻片作为巨噬细胞融合的阴性对照至关重要。按照方案1所述方法清洗后，盖玻片极为平整，无明显表面特征；而长链烃类吸附后经表面抛光处理，则可形成一定程度的纳米级形貌（图1）。
在洁净的盖玻片表面，巨噬细胞的融合率极低（图2）。相比之下，在存在IL-4的情况下培养24小时后，接种于吸附有长链烃类化合物表面的巨噬细胞发生显.......
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讨论
需要鉴定并进一步开发能够促进巨噬细胞融合的光学级玻璃表面，其原因在于，直到最近，尚无已发表的研究能够在活体标本背景下直接观察巨噬细胞的融合过程3,4。这是因为通常使用的促融合塑料表面需要长工作距离（LWD）物镜，且主要局限于相差光学成像。通过设计一种光学级玻璃表面，克服了这些障碍，该表面不仅显著促进了巨噬细胞的融合速率，而且对多核巨细胞（MGCs）的形成实现了出人意料的空间控制。
尽管该技术能够利用先进的成像方法来监测巨噬细胞融合，但仍存在一定的局限性。尽管经抛光的表面吸附了长链烃类（例如油酰胺，石蜡 等等。）与具有促融合性的塑料表面相比，可产生极高的巨噬细胞融合率，但融合仍是一个空间上随机的过程（图2）。这一限制使得无法使用高倍物镜观察活体样本的融合过程，因为无法预知融合发生的位置。为克服这一限制，我们对石蜡进行微图案化处理，以将融合过程限制在预定区域
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Ugarova实验室成员以及代谢与血管生物学中心的研究人员对本研究工作的有益讨论。James Faust谨向2015年欧洲分子生物学实验室超分辨率显微镜课程的授课教师表示感谢。我们感谢Janelia研究所的Satya Khuon在LLSM样品制备方面提供的帮助。在本研究的审稿和拍摄阶段，James Faust得到了T32基金（5T32DK007569-28）的支持。本研究中的晶格光片显微镜部分由霍华德·休斯医学研究所（HHMI）和贝蒂与戈登·摩尔基金会资助。T.U.的研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金HL63199资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| 定位网格 | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | 任何金质透射电镜网格均可使用 |
| 盖玻片（22×22 mm） | Thor Labs | CG15CH | 仅使用高严格性盖玻片 |
| 石蜡 | Sigma Aldrich | 17310 | |
| 凡士林 | Sigma Aldrich | 16415 | 若替代使用，必须不含α-生育酚 |
| 油酰胺 | Sigma Aldrich | O2136 | 需新鲜配制 |
| 异丙醇 | Sigma Aldrich | 278475 | |
| 甲苯 | Sigma Aldrich | 244511 | |
| 丙酮 | VWR International | BDH1101 | |
| 乙醇 | Electron microscopy sciences | 15050 | 使用低溶解固体含量的乙醇 |
| 盐酸 | Fischer Scientific | A144C-212 | 用于盖玻片的酸洗处理 |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | 按1:10比例混合，并在50 °C下固化4小时 |
| 35 mm培养皿 | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont 5号镊子 | Electron microscopy sciences | 72705 | 适用于第3.5节中移除透射电镜网格 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-0092 | 含15 mM HEPES |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strept） | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA溶液 | Sigma Aldrich | A9576 | 以0.1%浓度溶于HBSS中，用于洗涤非贴壁巨噬细胞 |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | 分装为10 μg/mL，储存于-20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | 适用于固定样品或无需对比剂的技术 |
| eGFP-LifeAct小鼠 | n/a | n/a | 适用于活体荧光成像 |
| Kimwipe纸巾 | Kimberly Clark | 34155 | 用于抛光吸附碳氢化合物的表面 |
参考文献
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).
- Helming, L., Gordon, S.
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重印与许可
