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胰岛表面肝素化星形PEG纳米涂层工程

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DOI：

10.3791/56879

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2018年6月23日

 ,  ,  , 
1Tianjin Key Laboratory of Biomaterial Research, Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College

本文内容

摘要

本方案旨在利用纳米涂层中N-羟基琥珀酰亚胺基团与胰岛细胞膜上氨基之间的伪生物正交化学反应，通过掺入肝素的星形PEG纳米涂层实现胰岛表面的工程化修饰。

摘要

细胞表面工程可保护移植的细胞免受宿主免疫系统的攻击，同时能够重塑细胞表面微环境，以改善移植物在移植后的功能与存活。本实验方案旨在利用超薄肝素掺杂的星形聚乙二醇（Hep-PEG）纳米涂层实现胰岛细胞的表面工程化。为制备用于胰岛表面工程的Hep-PEG纳米涂层，首先通过N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对肝素的羧酸根进行修饰，合成肝素琥珀酰亚胺酯（Heparin-NHS）。随后，通过将氨基末端功能化的八臂星形聚乙二醇（starPEG-(NH2)8）与Heparin-NHS交联，形成Hep-PEG混合物。在胰岛表面涂覆过程中，小鼠胰岛通过胶原酶消化及Histopaque梯度纯化法分离获得。分离后的胰岛与冰浴的Hep-PEG溶液孵育10分钟，使NHS基团与胰岛细胞膜上的胺基发生共价结合。Hep-PEG纳米涂层对胰岛的大小和体积影响极小，且使用Hep-PEG对胰岛进行肝素化处理，可能减轻胰岛移植过程中即刻发生的血液介导的炎症反应。该方法操作简便，条件温和，适用于活细胞的表面工程化改造，且不损害细胞活力。鉴于肝素已被证实可与多种细胞因子结合，Hep-PEG纳米涂层还提供了一个开放平台，可实现无限种类的功能性生物介质的整合以及多层化表面结构的构建，为活细胞表面生物工程提供了广泛的应用前景。

引言

基于细胞的疗法的治疗效果受限于细胞滞留率低和存活率差1,2。为了提高细胞疗法的效果，已采用多种方法对细胞表面进行工程化改造，包括酶法修饰、肽段偶联、生物正交化学以及利用生物材料进行物理包封3,4,5,6,7,8,9,10。本实验方案旨在通过在细胞表面施加一层超薄的含肝素的星形聚乙二醇（heparin-PEG）纳米涂层，采用一种"易于推广"的方法实现活细胞的表面工程化改造。本文以胰岛细胞的表面工程化为例进行展示，原因在于朗格汉斯胰岛具有高度异质性，且目前临床胰岛移植的效果仍不理想。

事实上，目前临床胰岛移植是通过将分离的胰岛直接注射到肝门静脉中进行的，由于供体材料稀缺且治疗效果有限，该手术仅适用于部分特定患者11传统上，海藻酸盐是最常用于胰岛封装和表面修饰的生物材料，但由于海藻酸盐化学稳定性较差，且易引发与炎症相关的纤维化，其应用并不理想。12,13此外，与天然胰岛100至200 µm的尺寸相比，海藻酸盐-胰岛微胶囊的尺寸更大，介于400至800 µm之间，超过了氧气的生理扩散距离。胰岛的共形封装， 即，开发了在不显著改变胰岛体积的情况下包封胰岛的技术。因此，随后发展出由聚乙二醇（PEG）、四氟乙烯、硅膜或多层纳米涂层（也称为 "逐层组装" [LBL] 技术已被报道，可实现改进 体外 胰岛存活14,15,16,17,18尽管逐层自组装法通常需要对胰岛进行长时间的操作以沉积多层结构，这可能影响胰岛的活力。此外，纳米膜的不稳定性也引发关注，这种不稳定性源于生物膜层之间的静电或共价相互作用，或纳米膜与胰岛表面之间的疏水相互作用9,14,15,16,22,23,24,25,26.

阻碍门静脉内胰岛移植治疗效果的另一个限制因素是植入的胰岛与血液直接接触所引发的即时血液介导的炎症反应（IBMIR），该反应可导致血小板聚集、凝血以及不良免疫效应或非预期的细胞活化9。为解决这些问题，研究制备了一种由星形聚乙二醇（starPEG）构成的超薄纳米涂层，因其具有良好的生物相容性和作为胰岛包封材料的多功能性而被选用。此外，纳米涂层中还掺入了肝素——一种高度硫酸化的糖胺聚糖——因其具备抗炎、抗凝血特性，并可通过募集促血管生成生长因子促进血管化22,23。

方案

1. 制备含肝素的星形聚乙二醇纳米涂层

  1. 肝素琥珀酰亚胺基琥珀酸酯（Heparin-NHS）的合成
    1. 称取0.69 g肝素，溶于2.0 mL冰冻去离子水中。
    2. 称取0.23 g NHS，溶于圆底烧瓶中的0.5 mL冰冻去离子水中。
    3. 称取0.77 g EDC，溶于圆底烧瓶中的0.5 mL冰冻去离子水中。
    4. 将NHS和EDC溶液混合于圆底烧瓶中，在室温下静置反应30分钟。
    5. 将EDC与NHS的混合物在5,031 × g条件下离心10分钟，以去除过量的EDC和NHS。
    6. 向混合液中加入30 mL冷乙醇，在5,031 × g条件下离心10分钟。
      1. 重复两次。
  2. 星形PEG-肝素纳米涂层的制备
    1. 取1.0 mL 10% (w/v) starPEG-(NH2)8加入圆底烧瓶中。
    2. 向同一圆底烧瓶中加入0.67 mL 10% (w/v) heparin-NHS。
    3. 将starPEG-(NH2)8与heparin-NHS的混合溶液置于25 °C孵育箱中反应20分钟，得到具有黏度的澄清溶液。
      ​注：若实验需要使用荧光标记的肝素（FAM-heparin），制备步骤相同，唯一区别是将star-PEG-(NH2)8溶解于含有5(6)-羧基荧光素N-琥珀酰亚胺酯（浓度为starPEG-(NH2)8摩尔比的0.1%）的去离子水中。
  3. 通过傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）表征肝素-PEG纳米涂层
    1. 实验开始前，用丙酮和去离子水冲洗玛瑙研钵、研杵及压片装置（直径为13 mm的小圆片），使用前将玻璃器皿在烘箱中干燥。
    2. 将约0.1–1%的肝素-PEG样品与200–250 mg细KBr粉末混合。
    3. 将肝素-PEG与KBr的混合物放入玛瑙研钵中，研磨成直径约为2 µm的小颗粒。
    4. 将混合物转移至压片装置中，在真空条件下施加高压（8 T/cm2）持续1–2分钟，制成透明压片。
    5. 小心地将样品压片从压片装置中取出，注意避免用力过猛导致裂纹。
    6. 极其小心地将样品压片转移至傅里叶变换红外光谱仪中，以测定样品的化学结构。
  4. 通过扫描电子显微镜（SEM）观察肝素-PEG纳米涂层的内部多孔结构
    1. 准备标准的48孔细胞培养板和移液器用于以下操作。
    2. 将肝素-PEG共聚物溶液移取至48孔培养板的各孔中。
    3. 将培养板在-80 °C冷冻24小时。
    4. 在真空环境（0.1 Pa）下于-50 °C冷冻干燥24小时。
    5. 将样品均匀铺展在铝制载台的粘性表面上。
    6. 对样品进行喷金处理，并在扫描电子显微镜下观察其内部多孔结构。
  5. 通过原子力显微镜（AFM）检测肝素-PEG纳米涂层表面
    1. 使用piranha溶液（70% H2SO4，30% H2O2）在80 °C下清洗硅玻璃片40分钟。
    2. 将玻璃片在甲醇中超声处理10分钟，随后在甲苯中超声处理10分钟。
    3. 通过真空干燥法干燥玻璃片。
    4. 用大量3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液（甲苯中2%）洗涤玻璃片，并轻轻振荡。
    5. 将玻璃片在甲醇中超声处理10分钟，随后在甲苯中超声处理10分钟。
    6. 使用标准移液器将100 µL 3%肝素-PEG溶液均匀涂布于玻璃片表面。
    7. 在原子力显微镜下观察肝素-PEG表面（共振频率50–80 kHz，力常数0.350 N/m，针尖半径600 nm）。

2. 肝素-PEG纳米涂层小鼠胰岛表面工程

  1. 小鼠胰岛表面肝素-PEG纳米包被
    1. 通过胶原酶消化和Histopaque梯度纯化法提取小鼠胰岛，方法如JoVE先前报道19。
    2. 在解剖显微镜下手工挑选200个胰岛至1.5 mL离心管中。
    3. 向胰岛中加入500 µL PBS，以503 × g离心1分钟。
    4. 吸除上清液，加入250 µL肝素-PEG溶液，将混合物置于冰上孵育10分钟。反复吹打混匀，使胰岛与肝素-PEG溶液充分混合。
    5. 以503 × g离心1分钟。
    6. 去除上清液，加入500 µL PBS。反复吹打混匀。
    7. 以503 × g离心1分钟，吸除上清液，保留胰岛用于后续实验。为观察肝素-PEG包被的小鼠胰岛，使用FAM标记的肝素-PEG（FAM-heparin-PEG）按照上述步骤进行胰岛包被。
  2. 经FAM-heparin-PEG纳米包被处理的小鼠胰岛的检测
    1. 向包被后的胰岛中加入1–2 mL RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清），并将胰岛转移至无电荷的无菌细菌培养皿中。
    2. 在倒置荧光显微镜下观察FAM-heparin-PEG纳米包被胰岛的形态及荧光信号。

3. 肝素-PEG 包被小鼠胰岛与非包被胰岛的功能比较

  1. 肝素-PEG包被小鼠胰岛的存活率
    1. 挑取20个肝素-PEG包被的小鼠胰岛，放入96孔细胞培养板的一个孔中。
    2. 每个孔中加入20个肝素-PEG包被的小鼠胰岛，共填充10个孔。
    3. 挑取20个未包被的对照胰岛，放入同一块96孔细胞培养板的一个孔中。
    4. 每个孔中加入20个未包被的对照胰岛，共填充10个孔。
    5. 将200 µL添加了10%胎牛血清的RPMI 1640培养基加入含有胰岛的96孔板的每个孔中，并在培养条件下维持14天。
    6. 每2天更换一次胰岛培养基。
    7. 在培养第14天结束时，使用活/死细胞染色试剂盒对胰岛进行处理，并在倒置荧光显微镜下观察。
    8. 计数 PI+ 在倒置荧光显微镜下观察每个胰岛内的（红色）细胞。
  2. 肝素-PEG包被小鼠胰岛的血管化 体外
    1. 实验所用的塑料器皿，包括培养板和移液器吸头，均需在使用前至少预冷12小时。
    2. 将24孔板置于冷却板上。向24孔细胞培养板的每孔中加入250 µL冰上预冷的生长因子减少型Matrigel。将包被好的24孔板置于4 °C环境中至少30分钟。
    3. 在基质溶液于冰箱中凝固的同时，用胰蛋白酶消化小鼠胰岛内皮Mile Sven 1（MS1）细胞。
      1. 从组织培养瓶中移除所有培养基，用 5 mL PBS 清洗培养瓶。
      2. 吸除 PBS，加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。在标准培养箱中 37 °C 孵育 3 分钟。
      3. 轻轻敲击培养瓶底部以使细胞脱落，并加入5 mL含血清的培养基。
    4. 将细胞收集至15 mL离心管中，以1,000 x g 5 分钟。
    5. 吸除上清液，加入5 mL PBS，上下吹打混匀。
    6. 以 1,000 x 离心 g 5 分钟后离心并移除上清液。
    7. 向离心管中加入含血清的DMEM培养基，将50,000个细胞接种至基质溶液包被的24孔板的每孔中。
    8. 每孔加入5个肝素-PEG包被的胰岛或未包被的对照胰岛。
    9. 每孔加入含血清的DMEM培养基，使每孔总体积达到500 µL。
    10. 在4小时和24小时孵育后，于光学显微镜下观察管状结构的形成。
  3. 肝素-聚乙二醇包被胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌
    ​注意：为了评估纳米涂层是否会影响小鼠胰岛的功能，检测了肝素-PEG涂层胰岛与未涂层胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌情况。
    1. 挑取30个肝素-PEG包被的胰岛或未包被的对照胰岛至一个1.5 mL离心管中。每种胰岛（包被与未包被）各准备10管。
    2. 加入1 mL含2 mmol/L葡萄糖的生理盐溶液20 并在37 °C孵育2小时。
      注意：有关生理盐溶液的配方，请参见 表1孵育期间保持试管盖子松开。
    3. 尽可能移除溶液。
    4. 通过添加600 µL含20 mmol/L葡萄糖的生理盐溶液，在37 °C条件下孵育30 min，以刺激胰岛。
    5. 从每管中收集 200 µL 上清液，使用商用胰岛素 ELISA 试剂盒进行胰岛素 ELISA 定量分析。

结果

肝素-PEG纳米涂层通过使用EDC和NHS作为偶联剂，将starPEG-(NH2)8与肝素偶联而合成（图1）。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）检测肝素-PEG纳米涂层的化学结构，如图2所示，在3,300–3,600 cm-1处可观察到肝素的特征峰，对应于肝素的羟基（图2 红色）。3,300–3,600 cm-1处峰强度的降低（图2 蓝色）表明starPEG-(NH2)8的酰胺基团与肝素的羰基发生了偶联。1,650 cm-1处峰的强度也有所降低，该峰对应于酰胺羰基的伸缩振动，表明肝素的羧酸根与琥珀酰亚胺琥珀酸酯以及starPEG-(NH2)8的氨基之间发生了充分反应。通过原子力显微镜检测肝素-PEG纳米涂层的表面结构，根据Lou et al.的研究，该纳米涂层高度约为30 nm，宽度为2 µm，具有直径在100至200 nm之间的微小多孔结构（暗斑）10。扫描电子显微镜获得的数据也证实了肝素-PEG具有高度互联的多孔结构（图3），提示其可能适用于体内递送过程中细胞的存活。

对分离的小鼠胰岛进行表面包被的结果如图4所示，绿色荧光显示的纳米包被薄层均匀地沉积在包被胰岛的表面，未引起胰岛体积/大小的明显变化。在包被过程中，建议将胰岛置于冰上以维持其活性。同样，包被时间（本实验中为10分钟）也经过优化，以确保胰岛活性的保持。值得注意的是，为了更清晰地观察纳米包被，采用电子显微镜检测包被胰岛的横切面会更为合适（如先前报道9,16），尽管所得数据来自固定并包埋的胰岛，而非培养中的活胰岛。

关于包被胰岛的存活与功能，已对胰岛的再血管化及其功能进行了评估 体外考虑到肝素的有益特性，将肝素功能化修饰于胰岛表面可促进胰岛在培养过程中的再血管化，从而提高其存活率。我们观察到，经肝素-PEG包被的小鼠胰岛在培养中表现出良好的胰岛活力图5）。与经肝素-PEG包被的胰岛共培养的小鼠胰岛内皮细胞（MS1）也显示出显著更成熟的血管形成，表现为细长的微血管样结构和网状血管结构（图6).

纳米涂层处理对肝素-PEG包被胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力无影响。当胰岛灌注含有亚刺激浓度葡萄糖（2 mmol/L）的生理盐溶液时，所有处理组均观察到胰岛素分泌水平较低。 图7当使用超生理浓度的葡萄糖（20 mmol/L 葡萄糖）刺激胰岛时，所有处理组均观察到胰岛素分泌增加。

聚合物合成示意图；化学反应：EDC/NHS、PEG-NH₂、FAM标记；化合物结构。
图1： 用于胰岛表面工程的Hep-PEG纳米涂层的化学结构。 胰岛涂层通过肝素-NHS与细胞膜上的伯胺以及星型PEG-(NH2)8之间的共价交联实现。每个肝素分子含有多个羧基，这些羧基被修饰为各连接一个NHS基团。NHS活化的羧基将与蛋白质中的伯胺反应形成酰胺键，从而稳定Hep-PEG纳米涂层与胰岛的结合。请点击此处查看该图的放大版本。

FTIR光谱图；Hep-PEG、肝素、星形PEG光谱；吸收分析。
图2： 星形PEG-(NH2)8、肝素及Hep-PEG纳米涂层在干燥状态下的红外光谱。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米多孔结构，电子显微镜图像，卷状样品；材料分析，500 nm 尺度。
图 3： 干燥状态下 Hep-PEG 的扫描电子显微镜图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

肝素-FAM 胰岛显微图像；荧光与明场对比；肝素效应分析。
图 4： 荧光显微镜下肝素-PEG 包被胰岛的代表性图像。
肝素预先用 FAM 标记（显示为绿色）。图像代表 100 个胰岛。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

胰岛细胞分析；对照组与肝素化胰岛的散点图、荧光显微镜图像；存活率研究。
图 5： 经肝素-PEG 包被的胰岛表现出良好的胰岛存活率。（A） 数据以均值±均值标准误表示，每组 n = 50 个胰岛。（B） 活细胞显示为绿色，死细胞显示为红色。比例尺 = 100 µm。图像代表 50 个胰岛的典型结果。请点击此处查看该图的放大版本。

胰岛细胞形态学实验，对照组与肝素化组；4小时和24小时时间点的显微镜图像。
图6： 肝素-PEG纳米涂层促进胰岛内血管再生。 MS1细胞与经肝素-PEG涂层处理的胰岛及未涂层对照胰岛共培养后的Matrigel管形成图像。图像分别在4小时和24小时拍摄。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

比较对照组与肝素化胰岛在不同葡萄糖浓度下胰岛素分泌的柱状图
图7： 肝素-PEG纳米包被对胰岛胰岛素分泌功能无影响。 将肝素-PEG包被的胰岛与未包被的对照组胰岛（每组各30个）分别暴露于2 mmol/L（白色柱）或20 mmol/L（黑色柱）葡萄糖中，持续30分钟。在20 mmol/L葡萄糖刺激下，包被组与对照组胰岛的胰岛素分泌水平相当。数据以均值±均值标准误表示，n = 10。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在本文中，我们展示了一种 "易于采用" 通过伪生物正交化学法在活细胞表面构建含肝素的星形PEG纳米涂层 N纳米涂层中的羟基琥珀酰亚胺基团与胰岛细胞表面膜上的氨基之间的反应。事实上，细胞膜内的氨基具有高度反应性，因此早期研究已报道了初级氨基与活化基团之间的相互作用。 N在生理条件下，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯14,16,21此外，大量研究报道，在胰岛包封过程中加入肝素（一种高度硫酸化的糖胺聚糖，也是细胞外基质的重要组分），可促进移植后的血管再生，并减轻即刻性血液介导的炎症反应（IBMIR）。22,23考虑到聚乙二醇（PEG）的生物相容性以及肝素的多价特性，我们在纳米涂层制备过程中采用八臂 PEG 以实现肝素的最大载量。肝素经-NHS 修饰后，可与- NH₂ 基团发生后续反应。2 胰岛细胞膜上的基团。通过促进-NH之间的共价键形成2 （细胞膜）以及Hep-PEG的-NHS基团，胰岛将易于发生 "包被的" 通过掺入肝素的聚乙二醇在胰岛外表面形成一层纳米级薄膜（纳米包衣）。

本方法与先前发表的同样选用聚乙二醇（PEG）作为胰岛微包封主要聚合物的方法不同，其采用了纳米涂层上的-NHS基团与胰岛细胞膜上的-NH2之间的伪生物正交化学反应。考虑到胰岛/细胞包封层的稳定性，尤其是在血浆等复杂环境中的稳定性，对移植后的血管重建和细胞存活至关重要，因此-NHS与-NH2之间形成的连接相比PEG与细胞膜之间的疏水相互作用24、静电相互作用9,15,24,25,26 或生物素-链霉亲和素之间的生物连接14更为稳定。

此外，与依赖层层自组装（LBL）方法、需要较长胰岛操作时间以实现多层沉积的胰岛包被方法相比14,16,25，本技术所需的处理步骤更少，且分离胰岛的包被时间极短。这两个因素对于移植后胰岛的存活至关重要，因为在酶消化过程中细胞外基质（ECM）受损，导致胰岛分离后其活力通常已受到损害。然而，本方法的一个局限性在于，与LBL方法不同，目前尚无法通过增减沉积层数来调控Hep-PEG纳米涂层的厚度。

此外，由于-NHS与-NH2之间的化学反应条件温和，该方法不仅适用于胰岛细胞，还可广泛应用于大多数细胞治疗中的活细胞表面工程。同时，考虑到肝素已知可与多种细胞因子及生物活性分子相互作用，Hep-PEG纳米涂层还提供了一个开放的平台，有望整合无限种类的生物介质，并为更复杂的细胞表面工程提供界面。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢国家自然科学基金（31770968）和天津市应用基础与前沿技术研究计划（17JCZDJC33400）的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
PBSHycloneAAJ207798
链脲佐菌素SigmaS0130
HistopaqueSigma10831
RPMI 1640GIBCO, by Life Technologies31800022
胎牛血清GIBCO, by Life Technologies16000-044
青霉素-链霉素GIBCO, by Life Technologies15140
细胞解离液GIBCO, by Life Technologies13150-016
DMEMGIBCO, by Life Technologies12800017
D-(+)-葡萄糖溶液SigmaG8644
488鬼笔环肽SigmaA12379
CFSESigma21888-25mg-F
Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒DojindoAD10
DAPI 氟封片剂SouthernBiotech0100-20
梭菌胶原酶，XI型SigmaC7657
肝素Sigma-AldrichH3149
NHSSigma-Aldrich56480
EDCSigma-Aldrich3449
8臂PEGJ&K Scientific Ltd1685176
FAMSigma-AldrichM041100
5(6)-羧基荧光素N-琥珀酰亚胺酯Sigma-Aldrich21888
KBrJ&K Scientific Ltd32036
3-氨丙基三乙氧基硅烷 Sigma-AldrichA3648
甲苯J&K Scientific LtdS-15497-20X
活/死细胞染色试剂盒Biovision, USK501
BD MatrigelTM，基底膜基质，生长因子减少型BD Bioscience354230
氯化钠，99.5%J&K Scientific Ltd105864
氯化钾，99%，超纯J&K Scientific Ltd991468
碳酸氢钠，99.7%，ACS级试剂J&K Scientific Ltd988639
六水合氯化镁，99%，ACS级试剂J&K Scientific Ltd182158
磷酸二氢钾，99%，超纯J&K Scientific Ltd128839
七水合硫酸镁，99%，分析纯J&K Scientific Ltd119370
氯化钙溶液（体积法），1.0 M CaCl2J&K Scientific Ltd21114
牛血清白蛋白Sigma-AldrichV900933
大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒Millipore-lincoEZRMI-13K

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