同源框基因是一类调控基因，常与成年个体中的肿瘤相关。我们通过免疫组织化学和实时PCR分析，研究了其在正常鼻黏膜、炎性鼻黏膜以及鼻窦肿瘤中的相对表达情况，旨在将其作为潜在的诊断和治疗靶点。
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方法文章
OTX1 和 OTX2 作为鼻腔鼻窦癌及嗅神经母细胞瘤两种潜在分子标志物的鉴定
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
OTX 同源盒（HB）基因在胚胎形态发生过程中以及成年生物体嗅觉上皮的发育过程中均有表达。这些基因发生的突变常与人类肿瘤的发生相关。目前尚无关于OTX基因与鼻腔肿瘤之间可能关联的研究数据。本研究的目的是探讨OTX1和OTX2是否可作为鼻腔肿瘤发展过程中的分子标志物。我们选取了鼻腔及鼻窦腺癌，通过免疫组织化学和实时PCR分析来研究OTX1和OTX2基因的表达情况。在所有鼻窦肠道型腺癌（ITACs）样本中，OTX1和OTX2均未表达。OTX1 mRNA仅在非肠道型腺癌（NITACs）中被检测到，而OTX2 mRNA仅在嗅觉神经母细胞瘤（ONs）中表达。我们证实，OTX1和OTX2基因的差异性表达可作为区分不同类型鼻窦肿瘤的有用分子标志物。
引言
OTX HB基因是果蝇orthodenticle基因（otd）在脊椎动物中的同源基因，编码转录因子，通常在胚胎形态发生过程中表达，但也可能在成体生物中表达并发挥不同功能。在胚胎发育过程中，它们调控细胞身份的确定、细胞分化以及体轴的定位¹。 OTX 家族包括 OTX1 和 OTX2 功能不同的基因 OTX1 参与大脑和感觉器官的发育。在成体生物中，该基因在感觉器官中表达，并在垂体前叶中以较低水平转录。2；它还在造血过程中发挥作用，在造血多能细胞和前体细胞中均有表达3. OTX2 参与头部前端的发育，其编码的蛋白质作为形态发生素，通过形成浓度梯度以时空特异性的方式激活或抑制其他基因的表达，从而调控细胞增殖与分化。在成体生物中， OTX2 仅存在于脉络丛和松果体中4.
突变 OTX 基因常与人类先天性、体细胞或代谢缺陷的表现相关。基因的获得或缺失突变可导致 OTX 如果基因无法正常调控细胞生长和/或分化，则可能促进肿瘤发生5. 在白血病和淋巴瘤以及许多实体瘤中（例如， 髓母细胞瘤6....
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方案
所有研究均按照《赫尔辛基宣言》（1975年）进行，并获得瓦雷泽因苏布里亚大学伦理委员会的批准，且已取得书面知情同意。
1. 样品采集
- 根据《头颈部肿瘤 WHO 分类》将所有人类福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本收集并划分为不同的亚组14。
注意：本研究使用的样本包括：作为对照的正常鼻窦黏膜（10 例）；内翻性乳头状瘤（IP，ICD-O 编码 8121/1）；鼻窦 ITAC（ICD-O 编码 8144/3，32 例）；NITAC（ICD-O 编码 8140/3，12 例）；腺样囊性癌（ACC，ICD-O 编码 8200/3）；多形性腺瘤（PA，ICD-O 编码 8941/3）；ON（ICD-O 编码 9522/3，13 例）；低分化神经内分泌癌（PDNEC，ICD-O 编码 8041/3，19 例）；神经内分泌肿瘤（NET，ICD-O 编码 8041/3）。
2. 免疫化学
- 脱蜡和切片复水
- 将样本载玻片置于60 °C烘箱中加热30分钟，并使用梯度乙醇将3 µm厚的FFPE切片复水至水。
- 将载玻片在二甲苯中短暂清洗10分钟，并重复此步骤一次；随后依次在100%乙醇中清洗5分钟（重复一次），....
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结果
在正常黏膜中，我们观察到OTX基因在纤毛假复层呼吸型上皮细胞以及黏膜下腺体细胞中均呈现强而均匀的核阳性反应图1A）。我们在所有 NITAC 样本中均发现 OTX1 呈现核表达（图1B），而ITACs中免疫反应性较弱或几乎未见图1C）。所有视神经中均显示出强烈的免疫反应性（图1D）；在PDNECs中，OTX的表达在阳性细胞比例和表达强度上存在差异（图1E）。采用卡方检验和/或Fisher精确检验进行免疫组织化学统计分析，结果显示ITAC样本中OTX基因的缺失具有统计学显著性（n = 23， p < 0.01).
实时荧光定量 PCR 分.......
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讨论
本研究首次表明，基于mRNA水平，HB基因OTX1和OTX2在正常的鼻窦黏膜及黏膜下腺体、炎性息肉、鼻窦施耐德乳头状瘤以及不同类型的上皮性和神经外胚层肿瘤中均有表达，包括鳞状细胞癌、非肠型鼻窦腺癌、涎腺型肿瘤、神经内分泌肿瘤和嗅神经母细胞瘤。
修改与故障排除：
为避免RNA降解，我们在病理科进行了脱蜡操作。刮取切片后，所有样本迅速冷却并保存于干冰中，直至后续使用。所有后续分析均在层流安全罩内进行，使用一套专用的带有无菌吸头的移液器，以维持无菌实验条件并防止RNA污染。
该技术的局限性：
该技术的主要局限性在于样本的可获得性，因为鼻窦腔肿瘤通常较为罕见。提取的RNA量是另一个重要问题，因为从FFPE样本中提取RNA会得到片段化的RNA，难以进行分析。
相对于现有方法的意义：
鼻腔肿瘤的诊断通常包括X射线分析、鼻腔内窥镜检查、C.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由因苏布里亚大学大型仪器中心、瓦雷多社区基金会、伦巴第山地基金会以及安娜·维拉和费利切·鲁斯科尼基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全核酸提取试剂盒（RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation） | Applied Biosystem | AM1975 | |
| 高容量cDNA反转录试剂盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit） | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan通用PCR预混液，不含AmpErase UNG（TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG） | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB探针（ACTB probe） | Applied Biosystem | 已停产。序列受版权保护 | |
| OTX1探针（OTX1 probe） | Applied Biosystem | 已停产。序列受版权保护 | |
| OTX2探针（OTX2 probe） | Applied Biosystem | 已停产。序列受版权保护 | |
| 水溶液过氧化氢（Acqueous Hydrogen Peroxide） | Merk | 1072090250 | |
| 柠檬酸盐缓冲液（Citrate Buffer） | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| 曲拉通（Triton） | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| 山羊抗OTX2抗体（Goat Anti-OTX2 Antibody） | Vector Laboratories | 已停产。目录号不可用 | |
| 兔抗山羊抗体（Rabbit Anti-Goat Antibody） | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-过氧化物酶复合物（ABC-Peroxidase Complex） | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)） | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 哈里斯苏木精（Harris Hematoxylin） | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
参考文献
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor....
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重印与许可
