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方法文章

OTX1 和 OTX2 作为鼻腔鼻窦癌及嗅神经母细胞瘤两种潜在分子标志物的鉴定

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DOI：

10.3791/56880

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2019年2月28日

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1Department of Medicine and Surgery, University of Insubria, 2Department of Surgical and Morphological Science, University of Insubria, 3Department of Biotechnology and Life Science, University of Insubria

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

同源框基因是一类调控基因，常与成年个体中的肿瘤相关。我们通过免疫组织化学和实时PCR分析，研究了其在正常鼻黏膜、炎性鼻黏膜以及鼻窦肿瘤中的相对表达情况，旨在将其作为潜在的诊断和治疗靶点。

摘要

OTX 同源盒（HB）基因在胚胎形态发生过程中以及成年生物体嗅觉上皮的发育过程中均有表达。这些基因发生的突变常与人类肿瘤的发生相关。目前尚无关于OTX基因与鼻腔肿瘤之间可能关联的研究数据。本研究的目的是探讨OTX1和OTX2是否可作为鼻腔肿瘤发展过程中的分子标志物。我们选取了鼻腔及鼻窦腺癌，通过免疫组织化学和实时PCR分析来研究OTX1和OTX2基因的表达情况。在所有鼻窦肠道型腺癌（ITACs）样本中，OTX1和OTX2均未表达。OTX1 mRNA仅在非肠道型腺癌（NITACs）中被检测到，而OTX2 mRNA仅在嗅觉神经母细胞瘤（ONs）中表达。我们证实，OTX1和OTX2基因的差异性表达可作为区分不同类型鼻窦肿瘤的有用分子标志物。

引言

OTX HB基因是果蝇orthodenticle基因（otd）在脊椎动物中的同源基因，编码转录因子，通常在胚胎形态发生过程中表达，但也可能在成体生物中表达并发挥不同功能。在胚胎发育过程中，它们调控细胞身份的确定、细胞分化以及体轴的定位¹。 OTX 家族包括 OTX1 和 OTX2 功能不同的基因 OTX1 参与大脑和感觉器官的发育。在成体生物中，该基因在感觉器官中表达，并在垂体前叶中以较低水平转录。2；它还在造血过程中发挥作用，在造血多能细胞和前体细胞中均有表达3. OTX2 参与头部前端的发育，其编码的蛋白质作为形态发生素，通过形成浓度梯度以时空特异性的方式激活或抑制其他基因的表达，从而调控细胞增殖与分化。在成体生物中， OTX2 仅存在于脉络丛和松果体中4.

突变 OTX 基因常与人类先天性、体细胞或代谢缺陷的表现相关。基因的获得或缺失突变可导致 OTX 如果基因无法正常调控细胞生长和/或分化，则可能促进肿瘤发生5. 在白血病和淋巴瘤以及许多实体瘤中（例如， 髓母细胞瘤6侵袭性非霍奇金淋巴瘤2，乳腺癌7结直肠癌8，以及视网膜母细胞瘤9），其表达失调的 OTX HB基因的作用已有充分文献记载10此外， OTX2 无眼症和小眼球症病例中已发现突变11 由于该基因在调控眼睛发育中起关键作用。

在实体肿瘤的背景下，发现分子和表型标志物是多种肿瘤诊断、分类和治疗的重要挑战11包括起源于鼻腔和鼻旁窦的肿瘤。事实上，尽管这些区域所占解剖空间有限，但其黏膜上皮、腺体、软组织、骨、软骨以及神经/神经外胚层和造血淋巴细胞常可成为组织学上复杂且多样的肿瘤类型的起源部位。涉及鼻-鼻窦区域的不同类型肿瘤表现出多种特征，其复杂性甚至超过上呼吸道消化道或其他多数身体部位常见的肿瘤表现。12鼻窦恶性肿瘤极为罕见，全球年发病率约为每10万居民中1例，因此限制了对肿瘤发生相关通路的研究以及替代治疗策略的测试。尽管如此，影像学技术、外科手术方法和放射治疗的进步已显著改善了鼻窦癌的临床管理。此外，细胞系、动物模型以及癌症遗传谱分析的发展目前构成了未来靶向抗癌治疗的基础。13迄今为止，尚无关于 OTX1 和/或 OTX2 鼻腔、鼻旁窦和鼻咽部肿瘤中的表达。由于我们先前已观察到 OTX1 和 OTX2 参与乳腺癌的发生发展7，我们想知道这些基因是否不仅存在于正常的鼻黏膜中，还可能存在于鼻腔肿瘤中。为实现这一目标，我们从病理科获得了 "奥尔塞洛医院" 在1985年至2012年间收集的Varese地区正常黏膜以及鼻腔和鼻窦腺癌样本，均根据世界卫生组织（WHO）头颈部肿瘤分类标准进行分类。我们选择通过实时PCR和免疫组织化学分析对这些样本进行检测，并对其进行了评估 OTX1 和 OTX2 表达情况以确定它们是否可作为此类肿瘤的分子标志物。

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方案

所有研究均按照《赫尔辛基宣言》（1975年）进行，并获得瓦雷泽因苏布里亚大学伦理委员会的批准，且已取得书面知情同意。

1. 样品采集

  1. 根据《头颈部肿瘤 WHO 分类》将所有人类福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本收集并划分为不同的亚组14。
    注意：本研究使用的样本包括：作为对照的正常鼻窦黏膜（10 例）；内翻性乳头状瘤（IP，ICD-O 编码 8121/1）；鼻窦 ITAC（ICD-O 编码 8144/3，32 例）；NITAC（ICD-O 编码 8140/3，12 例）；腺样囊性癌（ACC，ICD-O 编码 8200/3）；多形性腺瘤（PA，ICD-O 编码 8941/3）；ON（ICD-O 编码 9522/3，13 例）；低分化神经内分泌癌（PDNEC，ICD-O 编码 8041/3，19 例）；神经内分泌肿瘤（NET，ICD-O 编码 8041/3）。

2. 免疫化学

  1. 脱蜡和切片复水
    1. 将样本载玻片置于60 °C烘箱中加热30分钟，并使用梯度乙醇将3 µm厚的FFPE切片复水至水。
    2. 将载玻片在二甲苯中短暂清洗10分钟，并重复此步骤一次；随后依次在100%乙醇中清洗5分钟（重复一次），再分别用95%、85%和75%乙醇依次清洗。最后用蒸馏水冲洗载玻片5分钟。
  2. 阻断内源性活性
    1. 将载玻片置于3%的水溶性过氧化氢溶液中12分钟，以阻断内源性活性。
  3. 抗原修复
    1. 采用微波处理法，在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6）中处理10分钟进行抗原修复。
  4. 与一抗孵育
    1. 用TBS缓冲液（pH 7.4）洗涤切片，然后加入封闭液孵育10分钟。
    2. 再次用TBS缓冲液（pH 7.4）洗涤切片，然后加入0.2% Triton X。
    3. 在4 °C条件下与山羊抗人OTX2抗体（1:100稀释）孵育过夜。
  5. 与二抗孵育
    1. 室温下与生物素标记的兔抗山羊二抗（1:200稀释）孵育1小时，随后加入ABC-过氧化物酶复合物（参见材料表）。
  6. 显色免疫反应
    1. 使用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐显色，并用哈里斯苏木精对细胞核进行复染。
  7. 封片与成像
    1. 使用递增浓度的乙醇梯度脱水，并用萜类来源的透明剂透明（参见材料表）。将切片封固于封片介质中，置于显微镜载玻片上，通过光学显微镜观察切片。

3. RNA 提取与逆转录

  1. RNA 提取
    1. 通过执行免疫沉淀实验方案的第一步（参见第 2.1 节）从切片中提取 RNA，并将玻片保存在蒸馏水中。将未染色切片与相应的苏木精-伊红染色切片进行比对，以识别感兴趣的组织片段。
    2. 使用专用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的商业化 RNA 提取试剂盒（见材料表），并按照制造商说明书进行 RNA 提取。
  2. RNA 逆转录
    1. 使用商业化试剂盒按照操作说明将 RNA 逆转录为 cDNA（见材料表）。为进行多项分析，至少对 1,000 ng 总 RNA 进行逆转录。

4. 实时 PCR 与数据分析

  1. 实时荧光定量 PCR
    1. 使用基于探针的技术（参见材料表）和热循环仪进行定量实时荧光定量 PCR 分析（qRT-PCR）。
  2. PCR 反应体系的配制
    1. 在总反应体积为 25 µL 的体系中，加入 12.5 µL 基于探针的预混液、OTX1、OTX2 和 ACTB 探针各 1.25 µL（参见材料表）、50 ng cDNA，并用无核酸酶水补足体积。
    2. 以 ACTB 基因为内参对照，对所有反应设置三个重复，用于基因表达水平的标准化。
    3. 将反应板在 1,109 × g 离心 3 分钟，并在避光条件下于 4 °C 保存，直至进行实验。
  3. 热循环仪程序设置
    1. 设置热循环仪程序：首先在 50 °C 进行 2 分钟的初始热启动，接着在 95 °C 保持 10 分钟；随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒，最后在 60 °C 延伸 1 分钟。
  4. 基因表达水平分析
    1. 采用相对循环阈值（ΔCt）法对基因表达水平进行标准化处理，以 ACTB 基因为内参对照。
    2. 使用 2-ΔCt 法计算基因表达水平，并绘制结果图表。
  5. 统计学分析
    1. 采用 Student's t-检验进行统计学分析，当 p < 0.05 时认为差异具有统计学意义。

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结果

在正常黏膜中，我们观察到OTX基因在纤毛假复层呼吸型上皮细胞以及黏膜下腺体细胞中均呈现强而均匀的核阳性反应图1A）。我们在所有 NITAC 样本中均发现 OTX1 呈现核表达（图1B），而ITACs中免疫反应性较弱或几乎未见图1C）。所有视神经中均显示出强烈的免疫反应性（图1D）；在PDNECs中，OTX的表达在阳性细胞比例和表达强度上存在差异（图1E）。采用卡方检验和/或Fisher精确检验进行免疫组织化学统计分析，结果显示ITAC样本中OTX基因的缺失具有统计学显著性（n = 23， p < 0.01).

实时荧光定量 PCR 分...

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讨论

本研究首次表明，基于mRNA水平，HB基因OTX1和OTX2在正常的鼻窦黏膜及黏膜下腺体、炎性息肉、鼻窦施耐德乳头状瘤以及不同类型的上皮性和神经外胚层肿瘤中均有表达，包括鳞状细胞癌、非肠型鼻窦腺癌、涎腺型肿瘤、神经内分泌肿瘤和嗅神经母细胞瘤。

修改与故障排除：

为避免RNA降解，我们在病理科进行了脱蜡操作。刮取切片后，所有样本迅速冷却并保存于干冰中，直至后续使用。所有后续分析均在层流安全罩内进行，使用一套专用的带有无菌吸头的移液器，以维持无菌实验条件并防止RNA污染。

该技术的局限性：

该技术的主要局限性在于样本的可获得性，因为鼻窦腔肿瘤通常较为罕见。提取的RNA量是另一个重要问题，因为从FFPE样本中提取RNA会得到片段化的RNA，难以进行分析。

相对于现有方法的意义：

鼻腔肿瘤的诊断通常包括X射线分析、鼻腔内窥镜检查、C...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由因苏布里亚大学大型仪器中心、瓦雷多社区基金会、伦巴第山地基金会以及安娜·维拉和费利切·鲁斯科尼基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全核酸提取试剂盒（RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation）Applied BiosystemAM1975
高容量cDNA反转录试剂盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit）Applied Biosystem4368814
TaqMan通用PCR预混液，不含AmpErase UNG（TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG）Applied Biosystem4326614
ABI Prism 7000 Applied Biosystem270001857
ACTB探针（ACTB probe）Applied Biosystem已停产。序列受版权保护
OTX1探针（OTX1 probe）Applied Biosystem已停产。序列受版权保护
OTX2探针（OTX2 probe）Applied Biosystem已停产。序列受版权保护
水溶液过氧化氢（Acqueous Hydrogen Peroxide）Merk1072090250
柠檬酸盐缓冲液（Citrate Buffer）Sigma-Aldrich20276292
曲拉通（Triton）Sigma-Aldrich101473728
TrisMerk108382
NaClMerk106404
山羊抗OTX2抗体（Goat Anti-OTX2 Antibody）Vector Laboratories已停产。目录号不可用
兔抗山羊抗体（Rabbit Anti-Goat Antibody）Vector LaboratoriesBA5000
ABC-过氧化物酶复合物（ABC-Peroxidase Complex）Vector LaboratoriesPK6100
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）（3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)）Sigma-AldrichD5905
哈里斯苏木精（Harris Hematoxylin）Bioptica0506004/L
PertekKaltek SRL1560
BioClearBiopticaW01030799

参考文献

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