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简化的3D小脑分化方案及可选的2D改良方法

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DOI：

10.3791/56888

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2017年12月9日

 , 
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

本文内容

摘要

我们描述了一种简化的hPSCs三维分化方案，该方案使用成分明确的培养基并减少生长因子，能够生成具有早期神经上皮结构且表达小脑相关标志物的细胞聚集体；此外还提供一种可选的二维改良方法，通过单层培养分化细胞以获得功能性神经元。

摘要

降低分化方案的复杂性和成本对研究人员至关重要。这一需求也与人们关注的外源性模式形成因子可能对人多能干细胞（hPSC）的脑发育或病理生理模型产生的非预期效应相一致，例如掩盖疾病表型。本文中，我们提出了两种针对hPSC的 cerebellar 分化方案，其设计具有更简化的起始方法、更少的模式形成因子以及更低的材料需求，优于以往的方案。近期，我们开发了培养程序，可生成悬浮的三维（3D）结构，与其他脑类“"类器官"”培养方案一致，包含适用于模拟脑发育的形态结构，如类似脑室下区/脑室区和菱形唇的结构。第二种方案则采用贴壁的二维单层培养程序完成分化，已证明能够生成具有功能性的 cerebellar 神经元，其产物表达 cerebellar 相关标志物，并表现出类似神经元的钙离子内流。综上，这些方案为科研人员提供了适用于不同研究目的的选择，同时也为测试其他类型的简化神经分化方案提供了基础模型。

引言

体外诱导人多能干细胞（hPSCs）向小脑谱系分化的方案最初基于模拟体内小脑发育的原理1,2,3,4。因此，这些方案需要在特定时间依次引入多种因子，以驱动前小脑模式形成及后续成熟过程。其中最为关键的因子包括WNT、骨形态发生蛋白（BMPs）和成纤维细胞生长因子（FGFs），它们在中后脑发育及峡部组织者（isthmic organizer）的形成中具有明确作用5,6,7。然而，每增加一个步骤或因子，都会提高实验操作的劳动强度和研究成本，因此开发更为简化的、同时能达到同等效果的方案具有重要意义。这一实际问题也与一个假设性问题高度契合：即细胞在体外发育过程中是否真的需要如此严密的外部调控。

在小脑分化方面，2015年发表的一项方案通过仅使用FGF2、FGF19和基质细胞衍生因子1（SDF1）进行模式诱导，解决了以往需要使用大量生长因子的问题8。该研究还采用了一种悬浮的三维培养系统，与此前的小脑分化方案有所不同。除了生成表达小脑标志物的细胞外，该技术所产生的脑"类器官"还表现出传统二维单层培养无法实现的相关形态特征，例如类似菱脑唇的结构。尽管该方法在生长因子的使用上更为简单且成本较低，但其初始步骤中诸如形成均一的拟胚体（EBs）以及在96孔板（96WPs）中进行培养等操作，使其在实验流程上较为复杂。同年发表的另一项三维培养方案则报道了利用常见且低成本的细胞培养技术成功实现向神经谱系的分化9。尽管该研究团队主要关注的是皮层而非小脑分化，但其提出的方法理念应用于小脑分化的可能性仍不可忽视。

我们最近报道了一种三维小脑分化方案，该方案采用较少的模式诱导因子（即 FGF2、4 和 8），并通过在整个过程中将细胞维持在6孔板（6WPs）中以简化实验设置，从而减少培养基的使用量10为促进颗粒细胞的生成，在最终成熟阶段使用了平滑受体激动剂（SAG）。由于SAG在促进颗粒细胞前体（GCPs）生长方面具有重要作用，因此可作为音猬因子（SHH）的一种成本较低的化学替代物，而SHH此前已被用于小脑分化方案中。 体内1,2,11,12,13分化产物与其他3D方案的结果一致，包括在形态学相关结构中存在小脑相关标志物8,9此类结果进一步印证了先前的观点，即对细节的精确模拟 在体内 环境对于复杂的三维结构可能并非必需 体外 分化方案。

除了三维培养方案外，本报告还描述了一种二维培养方案，该方案具有相同的快速启动、基础材料以及较少的生长因子种类。该方法能够从人胚胎干细胞（hESCs）或诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成表达早期神经、小脑及颗粒细胞相关标志物的细胞。此外，钙成像结果表明存在功能性的人类神经元。研究者可根据需要在两种方案之间进行选择，从而获得更高的灵活性，适用于以下研究方向：（1）特定细胞类型的生成；（2）人类脑发育及其相关结构的建模；（3）适用于单层培养条件的分析（例如，膜片钳记录）；或（4）混合神经培养中的细胞间相互作用。这两种方法操作简便且成本较低，便于刚进入hPSC领域的研究人员使用，或为需要基础hPSC操作流程以进一步探索其他分化路径的研究者提供支持。

方案

1. 准备工作

注意：所有步骤中涉及的具体物品，请参见材料表。

  1. 配制500 mL用于hPSC培养的限定培养基
    注意：步骤 2.1–2.6 使用培养基。
    1. 将hPSC培养基添加剂在4 °C过夜（o/n）解冻。从培养基瓶中移除12.5 mL hPSC基础培养基，然后向瓶中加入10 mL添加剂和2.5 mL（终浓度为100 U/L）青霉素/链霉素（Pen/Strep）。
    2. 4 °C 保存，2 周内使用。
      注意：可通过添加10 µM ROCK抑制剂（RI）和10% DMSO，使用hPSC培养基进行细胞冻存。
  2. 配制1 L用于分化培养的神经维持培养基（NMM）
    注意：步骤 3.1–4.4 请使用培养基。
    1. 将谷氨酰胺强化的DMEM/F12与神经基础培养基按1:1比例在1 L瓶中混合，然后添加（1×）N2添加剂、（1×）B27添加剂、5 µg/mL胰岛素、1.5 mM L-谷氨酰胺、100 µM非必需氨基酸（NEAA）、100 U/L青霉素/链霉素和10 µM β-巯基乙醇。
    2. 将培养基置于 4 °C 保存，并在 3 周内使用。
      注意：在向混合基础培养基中添加补充成分之前，应根据储备液浓度移除相应体积的基础培养基，以校正所添加组分所需的最终体积。
  3. 配制500 mL用于hPSC传代的0.5 mM EDTA工作液
    注意：在步骤 2.4 和 2.5 中使用培养基。
    1. 在生物安全柜中，将 49 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）从 500 mL 无菌 PBS 瓶转移至 50 mL 离心管中。向该 50 mL 离心管中加入 0.5 mL 0.5 M EDTA 和 0.9 g NaCl。轻轻混匀至溶解。
    2. 使用0.22 µm滤器对溶液进行过滤除菌，然后转移至500 mL无菌PBS瓶中。室温（RT）保存。
  4. 准备人多能干细胞（hPSC）培养板用于hPSC培养
    注意：步骤 2.1–2.6 请使用培养板。
    1. 制备50倍浓缩的适用于hPSC的黏附包被工作液（PAAC）：将一管PAAC于4 °C过夜解冻。按1:1比例用DMEM/F12稀释PAAC，并分装为每管400 µL至1.5 mL离心管中。将50倍浓缩的PAAC工作液储存于-80 °C。
      注意：(重要PAAC 在室温下会迅速凝固，因此所有组分（DMEM、离心管等）必须预先冷却 等等。) 置于冰上（或4 °C）保存。
    2. 在4 °C下解冻50倍工作浓度的PAAC溶液，然后用冷的DMEM/F12将其稀释至1倍浓度。每孔加入750 µL稀释后的PAAC至6孔板中。将培养板在37 °C孵育至少1小时。
      注意：PAAC 平板在 37 °C 培养 1 小时后，可于 4 °C 保存 1 周。使用前将平板预热至 37 °C。
  5. 准备用于分化培养的抗黏附（AA）培养板
    注意：步骤 3.1–4.1 请使用培养板。
    1. 配制5 mg/mL的聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（poly-HEMA）95%乙醇溶液，37 °C摇床过夜，直至获得澄清溶液。室温保存。
      注意：通过 0.22 µm 滤膜过滤可去除未溶解的聚羟基丙酸（poly-HEMA）。
    2. 在培养板中加入聚羟基乙酸（poly-HEMA），使其覆盖每个孔的底部。将培养板在37 °C孵育2天，并检查各孔，确保液体完全蒸发且孔壁均匀包被。包被后的板可密封后于室温保存。
  6. 准备用于分化培养的多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PLO/LAM）培养板
    注意：步骤 4.2–4.4 请使用培养板。
    1. 使用溶于无菌 PBS 的 20 µg/mL 多聚-L-鸟氨酸（PLO）包被孔板表面，37 °C 过夜孵育。吸除 PLO 溶液，用 PBS 洗涤 3 次。
      注意：（可选）包被多聚赖氨酸（PLO）的培养板可密封后于4 °C保存，待用。
    2. 使用无菌 PBS 溶解的 10 µg/mL 层粘连蛋白（LAM）覆盖多聚赖氨酸（PLO）包被的孔板表面区域。37 °C 孵育至少 2 小时，或 4 °C 过夜。移除 LAM 溶液，用 PBS 洗涤孔板 2–3 次，随后立即加入适量培养基和/或细胞。
      注意：（可选）去除的 LAM 溶液可在 4 °C 下保存，并可重复使用最多 2 次。重要) 请勿让LAM包被的表面干燥；为防止干燥，应立即加入PBS或适当的培养基。
       

2. 方案1：无饲养层的hPSC培养

注意：hESC 来自非商业组织（H01 系，参见材料表）。三个 hiPSC 对照系（hvs51、60 和 88）通过重编程来自三名健康人类患者的成纤维细胞获得（成纤维细胞来源于匿名、不可识别的供体，因此免于伦理审查委员会批准）10,17。

  1. 在无饲养层条件下培养人多能干细胞
    1. 解冻人多能干细胞（hPSCs）并将其接种至PAAC培养板中（见步骤2.2），在含hPSC培养基的条件下，于37 °C、5% CO₂环境中培养hPSCs2每天更换hPSC培养基（见步骤2.3），但在解冻或传代后的当天无需更换。在显微镜下观察细胞（物镜：2.5x/0.06、5x/0.12 Ph0、10x/0.25 Ph1），以监测细胞生长速度并识别可能的分化区域图3，左上角面板显示分化示例）。
    2. 每3-4天传代一次人多能干细胞（hPSCs），或在培养物达到适当密度时进行传代 >80% 汇合度。若分化细胞比例低于 5%，采用常规 hPSC 传代方法（见步骤 2.4），否则采用轻柔法（见步骤 2.5）。当培养物不再需要时，可将 hPSC 冻存以长期保存（见步骤 2.6）。
  2. 在hPSC培养基中解冻hPSCs
    1. 将所需体积的hPSC培养基转移至无菌离心管中用于解冻过程（每支冻存管9 mL），并将培养基加入已准备好的PAAC板中以接收解冻后的细胞。在两份培养基中均补充10 µM RI。
    2. 从液氮中取出冻存管2 保存后直接放入水浴（37 °C）。当仅剩少量冰晶时，从水浴中取出，将冻存管中的内容物转移至解冻用离心管中（总体积 10 mL）。在室温下以 290 x g 离心 5 分钟。
    3. 使用血清学移液管从拟接种细胞的 PAAC 板孔中移除 PAAC 溶液（见步骤 1.4），并加入含 10 µM RI 的 hPSC 培养基。
      注意：(重要不要使用吸液针吸取PAAC溶液，否则可能凝固并堵塞通往真空泵的管路。
    4. 从离心管中移除上清液，并将细胞重悬于含有10 µM RI的hPSC培养基中。按1支冻存管/6孔板1孔的比例将细胞接种至目标培养板。于37 °C、5% CO₂条件下培养。2，且1天内不更换培养基。
      注意：在 5% O₂ 条件下启动细胞培养2 可能提高细胞存活率。
  3. 更换hPSC培养基
    1. 在无菌管中于室温或水浴中预热所需体积的hPSC培养基；建议每6孔板每孔2 mL。
      注意：（可选）通过额外添加hPSC培养基，hPSC可延长一天无需换液；但每周不得超过一次。
    2. 吸出含 hPSCs 的孔中培养基，并加入新鲜的 hPSC 培养基。
    3. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养hPSCs2.
  4. 在hPSC培养基中传代hPSCs
    1. 将所需体积的hPSC培养基转移至无菌离心管中，用于传代过程及PAAC包被板的制备以接收传代细胞。向目的板的培养基中添加10 µM RI。将培养基管置于室温或水浴中预温。
      注意：若使用未在列表中列出的其他包被材料，其制备与操作步骤将有所不同 材料表.
    2. 使用血清学移液管从拟接种细胞的 PAAC 板孔中移除 PAAC 溶液（见步骤 1.4），并加入含 10 µM RI 的 hPSC 培养基。
      注意：(重要不要使用吸液针吸取PAAC溶液，以免其凝固并堵塞通往真空泵的管路。
    3. 吸弃待传代hPSCs培养孔中的培养基，用0.5 mM EDTA洗涤细胞两次，然后加入0.5 mM EDTA，在37 °C孵育2–5分钟。
      注意：6孔板每孔1 mL的EDTA溶液足以用于洗涤和孵育。
    4. 在显微镜下观察各孔（物镜：2.5x/0.06，5x/0.12 Ph0，10x/0.25 Ph1）。若细胞开始脱落，吸除EDTA溶液，并用hPSC培养基冲洗使细胞脱落。
      注意：(重要注意吸取EDTA时不要将整个hPSC集落一并移除（不要等到整个集落开始脱落时才进行）。冲洗细胞次数不要超过5次，以免损伤hPSC并影响其多能性。此外，在从孔中冲洗细胞前，不要让细胞在含有RI的hPSC培养基中静置，否则细胞可能重新贴附于培养板上。
    5. 根据经验判断（通常与细胞融合度、克隆大小和生长速率相关），按照1:4–1:16的传代比例，将hPSCs转移至目的培养板的孔中（即，将原培养板中的1个孔内容物转移至目标板中的4个孔。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2，且1天内不更换培养基。
      注意：分裂比例可高达1:16–1:20，以防止细胞过密并改善克隆外观。
  5. 使用温和法（G法）传代人多能干细胞（hPSCs）
    1. 将所需体积的hPSC培养基转移至无菌离心管中，用于传代过程以及PAAC包被板的准备。向目的板的培养基中添加10 µM RI。将培养基管置于室温或37 °C水浴中预温。
    2. 使用血清学移液管从拟接种细胞的 PAAC 板孔中移除 PAAC 溶液（见步骤 1.4），并加入含 10 µM RI 的 hPSC 培养基。
      注意：(重要不要使用吸液针吸取PAAC，否则其可能凝固并堵塞通往真空泵的管路。
    3. 吸弃待传代hPSCs培养孔中的培养基，用0.5 mM EDTA洗涤细胞两次。第二次洗涤时，加入EDTA后等待30秒再吸弃，随后加入1 mL PBS，于37 °C孵育4–9分钟。等待期间，准备一支无菌离心管，加入4 mL PBS。
      注意：6孔板每孔1 mL的EDTA洗液已足够。
    4. 在显微镜下观察孔内细胞（物镜：2.5x/0.06，5x/0.12 Ph0，10x/0.25 Ph1）。若细胞开始脱落，轻敲培养板侧壁以帮助集落脱离。当 >50%的类器官呈游离状态，使用5 mL血清移液管将1 mL PBS中的类器官转移至含有4 mL PBS的离心管中（切勿吹打）。
      注意：(重要由于目的是净化hPSC培养物，需检查是否有分化细胞仍贴附于培养板上。此外，使用此方法时无需传代培养孔中所有的克隆，因此可保留仍贴壁的克隆。
    5. 在室温下静置5-10分钟，使细胞在管中沉降（勿离心）。小心吸除PBS，注意不要移走已沉降的hPSC。将细胞轻轻重悬于hPSC培养基中（勿吹打），按1:4至1:16的传代比例将细胞转移至目的培养板。于37 °C、5% CO₂条件下培养。2，且1天内不更换培养基。
  6. 冻存人多能干细胞
    1. 根据细胞融合度，使用培养 2-3 天（最多）的 1 孔 hPSCs，分装至 1-2 个冻存管中，于液氮中保存2.
    2. 传代结束时（步骤2.5），使用500 µL或1 mL hPSC培养基将6孔板中一个孔的细胞分别转移至1或2个冻存管中（每管500 µL）。向每根冻存管中加入500 µL含hPSC培养基、20 µM RI和20% DMSO的2x冻存液。
      注意：（可选）细胞可直接以1 mL/瓶的1×冻存液进行转移。
    3. 将冻存管放入预冷至 4 °C 的含有异丙醇的冻存盒中，立即于 -80 °C 保存。
    4. 第二天，将冻存管转移至液氮2 用于长期储存的容器。

3. 方案2：三维"类器官"分化

  1. 使用改良G法传代hPSCs进行分化培养的设置
    1. 将所需体积的NMM转移至无菌管中，以用于目标孔的数量。添加4 ng/mL FGF2和10 µM RI。在室温下或37 °C水浴中预热培养基管。
      注：根据起始孔的融合度，hPSCs在分配至目标板时以2:1或3:1的比例浓缩（即，从原板2孔细胞分配至目标板1孔），最终体积为每孔2.5 mL（6WP）。
    2. 吸除待分化hPSCs孔中的培养基，使用0.5 mM EDTA洗涤细胞两次。第二次洗涤时，等待30秒后再吸除EDTA，然后加入1 mL PBS，并在37 °C孵育4–9分钟。等待期间，准备一支含4 mL PBS的无菌管。
      注：每孔（6WP）使用1 mL EDTA进行洗涤已足够。（重要）建议使用最后一次传代后培养不超过3天的hPSCs，且至少在解冻后经过1–2次传代。
    3. 在显微镜下检查孔（物镜：2.5x/0.06，5x/0.12 Ph0，10x/0.25 Ph1）。若细胞开始脱落，轻敲培养板侧面使细胞松动。用5 mL移液器将细胞转移至含4 mL PBS的无菌管中。
      注：（重要）允许轻微冲洗和吹打以分散细胞集落并收集松散细胞，但忽略仍贴附在培养板上的细胞。
    4. 将管子在室温下静置10分钟，以实现重力沉降。如有需要，可选择性地进行轻微离心（室温下不超过200 × g，离心5分钟）。
    5. 小心吸除管中的PBS，注意不要移除已沉降的hPSCs，用含4 ng/mL FGF2和10 µM RI的NMM重悬细胞，然后以2:1或3:1的比例分配至AA包被板中。在37 °C、5% CO2条件下培养，3天内无需更换培养基，除非必要（见步骤3.2.1）。
      注：（可选）为方便细胞转移，可在分配前向目标板孔中加入部分培养基，并用较小体积重悬细胞。此外，可对hPSCs进行染色和计数以确定确切的起始细胞密度。但目标板中最终体积应为每孔2.5 mL（6WP）。
  2. 在37 °C（5% CO2）条件下维持悬浮分化培养
    1. 每天检查培养板，观察培养基颜色变化、死细胞积聚、细胞聚集以及细胞贴壁情况。
      1. 可选：无论是否在预定换液时间点，若培养基变黄（包括最初3天不换液期间），应立即更换/刷新培养基，并按照培养基更换/刷新说明（步骤3.3）操作。若大多数细胞呈现死亡状态，则按照重力沉降法进行培养基更换/刷新（步骤3.4）。
        注：预期会形成类胚体（EBs）并生长为较大的细胞聚集体，但细胞或聚集体可能因非个体生长/增殖原因而聚集成大块。若观察到此现象，允许轻微吹打以分散大块聚集体。若细胞开始贴附于AA板表面，可将孔中剩余的悬浮内容物直接转移至新孔，或在换液/刷新过程中转移。切勿尝试转移已贴附于培养板的细胞。
    2. 第3天，更换为含4 ng/mL FGF2的NMM培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
    3. 第7天，更换为含1 µM视黄酸（RA）、100 ng/mL FGF8B和4 ng/mL FGF2的NMM培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
      注：（重要）RA对光敏感，需避免RA培养样品暴露于光照下。
    4. 第14天，更换为含100 ng/mL FGF8B、100 ng/mL FGF4和20 ng/mL FGF2的NMM培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
    5. 第17天，更换为含100 ng/mL FGF8B的NMM培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
    6. 第21天，更换为含100 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）和10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的NMM培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
    7. 第28天，更换为含100 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、3 ng/mL SAG、100 ng/mL神经营养因子3（NT3）和25 mM KCl的NMM培养基，之后每隔一天更换一次培养基。
    8. 第35天，收集3D类器官用于分析。
  3. 3D培养中分化培养基的更换/刷新
    1. 将所需体积的含适当组分的NMM（组分见步骤3.2.2–3.2.7中的时间表）转移至无菌管中，在37 °C水浴中预热。
    2. 倾斜培养板并轻轻摇晃，直至细胞沉降至孔底边缘。使用移液管小心吸除2 mL旧培养基，避免吸走细胞，然后加入2 mL新鲜培养基。在37 °C、5% CO2条件下培养。
      注：（重要）最终体积应为每孔2.5 mL（6WP）。若发生蒸发，不应吸除2 mL旧培养基，以免进一步干燥细胞培养物；此时应直接补充额外培养基。
  4. 通过重力沉降法更换/刷新分化培养基
    1. 将所需体积的含适当组分的NMM转移至无菌管中，在37 °C水浴中预热。
    2. 将孔内内容物转移至无菌管中，在室温下静置10分钟，以实现重力沉降。
    3. 使用移液器小心吸除管中旧培养基，注意不要移除已沉降的细胞，用含适当组分的NMM重悬细胞，然后分配至新的AA包被孔中。在37 °C、5% CO2条件下培养。
      注：（可选）为操作方便，可在分配前向目标孔中加入部分培养基，同时将分化中的细胞用较小体积重悬。最终体积应为每孔2.5 mL（6WP）。

4. 方案3：替代的二维分化培养

  1. 按照第3节中的步骤开始并维持培养，采用3D方案至第12天
    1. 按照步骤 3.1–3.2.3 操作，并根据步骤 3.3 和 3.4 更换或更新培养基。
  2. 转换为并维持二维单层培养
    1. 在分化第13天，按照重力分离法更换/更新培养基的说明（步骤3.4）操作，仅将细胞/聚集体接种至PLO/LAM包被的培养板（见步骤1.6），每孔终体积为2.5 mL（6孔板）。
      注意：在初始铺板时，可在培养基中添加 10 µM RI，以促进细胞贴壁和存活。重要应尽量将细胞均匀铺布于孔中，避免孔板上细胞密度过低或过密，并根据需要进行传代（见步骤4.4）。建议使用PLO/LAM包被板的规格（即6孔板，12孔板 等等。必须根据细胞系的增殖速率和产物用途通过实验确定，说明书将提供适用于6孔板的体积，每增加一倍孔数时，体积相应减半即，6孔板每孔2 mL，12孔板每孔1 mL， 等等。)
    2. 第14天，将培养基更换为含有100 ng/mL FGF8B、100 ng/mL FGF4和20 ng/mL FGF2的NMM。每隔一天更换一次培养基，具体操作如步骤4.3所述。
    3. 第17天，将培养基更换为含100 ng/mL FGF8B的NMM。每隔一天更换一次培养基，具体操作如步骤4.3所述。
    4. 第21天，将培养基更换为含100 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF的NMM。按照步骤4.3所述，每隔一天更换一次培养基。
    5. 第28天，将培养基更换为含有100 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、3 ng/mL SAG、100 ng/mL NT3和25 mM KCl的NMM培养基。按照步骤4.3所述，每隔一天更换一次培养基。
    6. 在第35天，收集细胞进行分析，或继续在与步骤4.2.5相同的培养基中进行长期培养（潜在上限未测试）。
  3. 更换/更新二维培养的分化培养基
    1. 将含有适当组分的所需体积的NMM（组分添加步骤参见4.2.2–4.2.5）转移至无菌试管中，在37 °C水浴中温育。
    2. 从孔板中吸除培养基，然后加入 2 mL 新鲜培养基。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2.
      注意：（可选）可保持每孔6孔板终体积为2.5 mL，用移液器移除2 mL旧培养基，并加入2 mL新鲜培养基。保留部分旧培养基并避免细胞暴露于空气中，可能减少换液过程中对细胞的刺激。
  4. 2D 分化培养
    1. 将所需体积的含适当组分的 NMM（组分添加时间参见步骤 4.2.2–4.2.5）转移至无菌离心管中，用于传代过程；另取部分单独用于制备 PLO/LAM 包被的培养板，以接收传代后的细胞。向目的培养板中的培养基补充 10 µM RI。将装有培养基的离心管置于室温或 37 °C 水浴中预温。为节约试剂，传代过程中可用 NMM 单独洗涤细胞。
      注意：(重要如果细胞产物将用于钙成像实验，务必在分化结束前2至6天进行传代。
    2. 吸弃待传代孔中的培养基。每孔加入 300 µL 基于胰蛋白酶的解离试剂（参见 材料清单)，轻轻晃动培养板以覆盖各孔，随后立即去除解离试剂。
    3. 室温静置 2 分钟，轻敲培养板侧壁以松动细胞。每孔加入 600 µL 确定浓度的胰蛋白酶抑制剂（DTI），将含 DTI 的细胞悬液转移至含 5 mL NMM 的无菌离心管中。
    4. 在室温下以290 × g离心15分钟。吸除上清液，并向管中加入5 mL NMM。
    5. 在室温下以290 × g离心15分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于含有RI的适当培养基中。
    6. 根据初始汇合度、增殖速率以及从原培养皿到目标培养皿的尺寸差异，按1:1至1:12的传代比例将细胞接种至PLO/LAM培养板上，并在37 °C、5% CO₂条件下培养2.

结果

减少生长因子的二维和三维小脑分化方案的可视化概述
图1展示了二维和三维小脑分化方案的整体时间线，标明了外源性因子及铺板时间。人类多能干细胞（hPSCs）进行三维小脑分化过程的典型进展如图2所示：hESC系H01在第0天以集落形式开始于无饲养层培养体系中（图左上）；第2天形成拟胚体（EB）（图中上）；在第14天经视黄酸（RA）和成纤维细胞生长因子8（FGF8）诱导神经化后，发育为具有明显腔隙的较大细胞聚集体（图右上）；第28天形成大小和形状各异的细胞聚集体（图左下）；同一聚集体在第28天呈现出更复杂的结构（图中下）；到第35天，这些结构继续发生形态学变化（图右下）。人类多能干细胞进行二维小脑分化过程的典型进展如图3所示：hESC系H01在第0天以集落形式存在于无饲养层培养体系中（图左上，圆圈标示出集落中已分化细胞区域）；第2天形成拟胚体（图中上）；在第13天经RA和FGF8诱导神经化后，发育为具有明显腔隙的较大细胞聚集体（图右上）；第14天铺板后以贴壁细胞形式增殖（图左下）；至第35天，在低倍（图中下）和高倍（图右下）显微镜下可见细胞形成形态更复杂/成熟的单层结构。

三维类器官表现出早期神经上皮的标志物和结构
图2（左下图）和图4展示了在培养过程中观察到的三维细胞聚集体形态的异质性，这种异质性源于不同的生长和/或成熟速率，以及聚集体之间随机的融合或分裂。尽管存在异质性，每次分化均能产生表达早期神经和神经元标志物的聚集体，包括小脑颗粒细胞标志物ZIC1，免疫细胞化学（ICC）染色结果如图5所示。更重要的是，图5和图6表明，仅通过简化三维培养条件并减少生长因子，即可生成具有与大脑发育相关复杂结构（如早期神经上皮和菱唇）的细胞聚集体。

二维培养产物表达小脑标志物并具有功能性神经元活性
尽管二维培养无法重现复杂的三维结构，但其仍可生成表达早期神经及神经元标志物的细胞，包括小脑颗粒细胞标志物 ZIC1，免疫细胞化学染色结果如图7所示。通过 RT-PCR 进行的基因表达分析结果（见图8）支持免疫细胞化学染色的结果，但早期颗粒细胞标志物ATOH1的表达在不同实验及细胞系之间存在差异。钙成像在二维培养中更易于操作。如图9、补充视频1和补充视频2所示，经电刺激的细胞表现出典型的神经元放电模式相关的钙内流，提示已生成具有功能性的神经元。

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图1：分化方案的时间线（从分化第0天开始）。 实线框表示向培养基中添加特定因子的时间，虚线框表示可选的二维修饰所需的包被培养板操作。对于FGF2，向下的箭头表示较低浓度（4 ng/mL），向上的箭头表示较高浓度（20 ng/mL）。该图经Holmes和Heine10修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：三维培养方案的代表性明场图像。 d0时的hESC集落，d2时的拟胚体（EBs），d14诱导后的细胞聚集体，d28时不同大小和形态的聚集体（编号1-5），d28时一个具有独特可识别特征的单个聚集体（由字母a-c标示），以及同一聚集体在d35时这些特征的可见变化。比例尺 = 100 µm。该图改编自Holmes和Heine10。请点击此处查看此图的放大版本。

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图3：二维培养方案的代表性明场图像。 分别为第0天的hESC集落、第2天的拟胚体（EBs）、第13天诱导后的细胞聚集体、第14天接种后的聚集体，以及第35天成熟后的细胞形态，图像放大倍数为5倍和20倍。左上角图中的白色圆圈标示出hESC集落中已分化细胞的区域。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

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图4：明场图像显示3D培养中聚集体的大小和结构复杂性差异。 分别为（A）第8天的hESC聚集体，以及（B）第35天的hiPSC聚集体。后者由三张独立图像拼接而成，以展示整个聚集体的全貌。两个聚集体均可能受到较小聚集体融合或部分结构脱落（断裂）的影响。比例尺 = 200 µm。该图改编自Holmes和Heine10。请点击此处查看该图的高清版本。

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图5：3D类器官的免疫细胞化学图像显示相关标志物和结构。 在培养第35天，3D类器官表现出以下特征：第一行显示神经玫瑰花环样结构腔内表达PAX6（绿色）和TBR2（红色）；第二行显示DCX（绿色）和NeuN（红色）从类似脑室区（VZ）的外缘区域向外扩散；第三行左侧为小脑神经上皮相关标志物KIRREL2，右侧为小脑颗粒细胞相关标志物ZIC1。该实验使用四种不同的人多能干细胞（hPSC）系重复进行：hESC系H01（n = 5），以及iPSC系hvs88（n = 4）、hvs60（n = 3）和hvs51（n = 1）。箭头指示类似菱唇（RL）的结构。比例尺 = 100 µm。本图转载自Holmes和Heine10。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：三维产物中大规模的室管膜区样结构。 在培养第35天，人胚胎干细胞（hESC）来源的细胞聚集体表达PAX6（绿色）和TBR2（红色），这两种标记物通常与体内室管膜区（VZs）和室下区（SVZs）中发现的早期神经元相关。in vivo。（上图）星号（*）标记了类似室管膜区（VZ）的顶端侧面，该区域沿聚集体边缘分布，括号表示室管膜区/室下区（VZ/SVZ）的深度或分层。（中图）合并信号显示，PAX6+/TBR2-细胞呈散在分布，并向室管膜区右上方逐渐增大。（下图）中图矩形框所示区域的高倍放大图像。比例尺 = 100 µm。本图经 Holmes 和 Heine10 修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：二维培养产物的免疫细胞化学图像显示相关标志物。 在培养第35天，来自人胚胎干细胞（hESCs，上排）和人诱导多能干细胞（hiPSCs，下排）的二维培养产物中可见表达颗粒细胞标志物ZIC1和迁移性小脑神经元标志物TAG1的细胞（左列）；以及表达神经元标志物神经丝蛋白（NF）和TAG1的细胞（右列）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：二维培养产物的RT-PCR结果。 在二维培养方案结束时，对hESC系H01（上排）和hiPSC系hvs60（下排）进行mRNA表达分析，通过凝胶电泳检测以下基因的表达：颗粒细胞标志物ZIC1、颗粒细胞标志物ATOH1、迁移性小脑神经元标志物TAG1、浦肯野细胞标志物Calbindin（CALB）、电压门控钙通道CACNA1A（C-1A）、CACNA1E（C-1E）、γ-氨基丁酸（GABA）B受体1（G-Br1），以及看家基因EIF4G2。

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图9：二维分化产物的钙成像/分析。 在培养第35天，将hPSC分化产物与荧光染料Fluor5孵育后，在显微镜下记录2分钟。在30秒时，以10 Hz频率对细胞进行10秒的电刺激。（A）静态图像显示hESC在0秒（左图）及电刺激开始后30秒（右图）的情况。箭头指示用于分析钙离子内流的感兴趣区域（ROI）。（B）图形分析显示ROI的相对荧光强度随时间的变化（荧光变化量 = (F-F0)/F0，其中F0 = (∑F1-n)/n），在刺激前、刺激中和刺激后均出现类似神经元的尖峰信号。黑色横条表示电刺激持续时间。比例尺（白色）= 50 µm。hESC的完整记录（如图所示）和一个hiPSC细胞系的记录（未显示）分别见于补充视频1和补充视频2。视频为AVI格式，播放速度为4倍速。请点击此处查看该图的高清版本。

补充视频 1：hESC 系 H01 来源的二维分化产物的钙成像视频。在培养第 35 天，将 hESC 系 H01 的分化产物与 fluor5 染料孵育后，在显微镜下记录 2 分钟的钙成像。在 30 秒时，细胞以 10 Hz 频率进行 10 秒的电刺激。图像采集速率为每秒 2 帧，后处理为每秒约 7 帧的 AVI 视频，最终生成时长约 30 秒、速度约为原速 4 倍的视频。请点击此处下载该文件。

补充视频 2：hvs51 人诱导多能干细胞系来源的二维分化产物的钙成像视频。在培养第 35 天，将 hvs51 人诱导多能干细胞系的分化产物与 fluor5 染料孵育后，在显微镜下记录 2 分钟。在 30 秒时，细胞以 10 Hz 频率进行 10 秒的电刺激。记录速率为每秒 2 帧，后期处理为每秒约 7 帧的 AVI 视频，最终生成时长约 30 秒、速度约为实际 4 倍的视频。请点击此处下载该文件。

讨论

复杂性和成本是干细胞研究人员在选择或开发分化方案时需要考虑的重要因素。尤其值得注意的是，目前尚不明确在诱导生成目标细胞类型时，究竟需要多大程度的外部干预；换言之，若仅提供充足营养，人多能干细胞（hPSCs）在多大程度上能够自主构建其发育所需的微环境。外源因子的引入 体外 可能会产生所需的目标细胞产物，但也可能干扰细胞原本应表现出的内在发育潜能 体内这些考虑因素至关重要，特别是当目标是利用患者来源的iPSC进行疾病建模时。广泛使用模式化诱导和/或生长因子可能会掩盖疾病的表型特征。本报告中详述的实验方案遵循既往研究的趋势，旨在降低复杂性、成本以及对外源性模式化因子的依赖。8,9.

根据Muguruma报道的结果 等人， 根据我们最近的研究，似乎无需刻意模拟即可实现向小脑命运的分化 体内 条件，正如之前的研究所做的那样1,2,3,4,8,10有趣的是，这两项研究使用了不同的生长因子组合，表明这些组合中的任一组都不是必需的，尽管两者都使用了FGF2。我们进行了额外的实验，选择性地从方案中去除FGFs，结果表明细胞在无外源性FGFs的情况下仍能生成相同产物。10我们研究之间的差异可能源于所使用的人多能干细胞系和培养方法不同，采用视黄酸（RA）诱导神经分化，并添加了支持颗粒细胞存活与成熟的成分（BDNF、GDNF、SAG 和 KCl）。11-14此外，与Muguruma相比，该方法的启动过程更为简单。 等，被采用。他们的方案首先在96孔板中生成均一的拟胚体（EBs），从而在物理和化学上将彼此隔离开来。而本实验方案在6孔板中进行EB形成，使所有PSCs相对聚集在一起，允许它们自由相互作用。这种差异可能如何不同地影响EB及其后续类器官的物理与化学微环境（包括信号分子的内在产生），目前尚不明确，有待进一步探索。此外，尽管我们展示了与小脑起源相关基因的表达——提示具有小脑特征——且这些结构在形态上与Muguruma报道的结构相似， 等我们不能排除生成具有非小脑身份的类神经元结构的可能性。未来的研究可使用大量抗体组合，如Muguruma等人所报道的那些抗体 等 (即，ATOH1，CALB， 等等。将使此类指认以及两种方案产物间的比较更具结论性。

在3D培养方案中，为确保获得足够数量的终末产物用于分析，起始培养时必须具备并维持足够数量的细胞。由于在方案早期存在显著的细胞死亡现象，我们建议在培养的前3天内，每孔起始的拟胚体（EB）数量应超过500个（图1）。对于无饲养层培养条件下人多能干细胞（hPSCs）的集落大小而言，这一目标通常不难实现；但对于仍在使用饲养层依赖性方法的研究者而言，可能较难达到。鉴于细胞数量庞大，需密切观察培养基颜色变化（提示pH改变）以及死细胞的积累。上述问题必须及时纠正，以防止培养体系崩溃。此外，细胞和聚集体可能出现团聚，形成巨大的结构。尽管这些大聚集体仍可能用于分析，但产物数量将显著减少，因此可通过轻柔吹打将其分散为较小的聚集体，这可能是有益的。然而，应避免干扰正常的聚集体，因为它们本身可生长至较大尺寸（图4）。如果聚集体过于稀疏，建议合并孔间培养物，以避免聚集体完全孤立。产物在数量、大小和形态上的变异性是3D细胞培养中公认的问题，即使是从均一、单个拟胚体形成步骤开始的方案也存在此类问题，这提示较为简化的起始流程（例如本文所述方案）可能更具实用性8,15。尽管这种异质性是研究人员在分析过程中必须注意的问题，但本方案所获得的产物与其他3D培养方案报道的结果具有一致性8,9,15。根据其大小和形态特征，这些产物处于神经玫瑰花环样结构至脑类器官的范围之内，如Kelava和Lancaster近期综述中所述15，其中大多数最符合球状体（spheroid）的分类。尤为显著的是，观察到存在提示神经玫瑰花环结构的三维构造，包括管腔、（亚）室管膜区以及菱脑唇样特征（图5和 图6），这些结构已被其他研究团队所识别8,15,16,17。由于每次实验均至少产生一个具有假定的VZ/SVZ结构及小脑相关标志物（ZIC1、KIRREL2）的聚集体，因此这些可作为判断本方案3D分化是否成功的有效标准，而菱脑唇样特征则提供进一步支持证据。本研究未测试超过35天的延长培养，但可进一步探索以确定该技术所能支持的生长极限、结构复杂性及成熟度。

二维培养方案采用与三维方案相同的非黏附性胚状体（EB）形成和神经诱导过程，因此上述注意事项同样适用。一旦接种，还需考虑另一组因素。EB应迅速贴壁，以便细胞向外增殖生长。如果存在贴壁困难的问题，可尝试添加ROCK抑制剂（RI）（若尚未使用）、减少培养基体积，或对PLO/LAM的浓度进行实验性调整。需注意避免细胞在孔中生长过密或过稀（理想状态为20%-80%融合度），每日监测并及时传代至关重要，以防止过度融合或细胞漂浮。与三维方案不同，在培养过程中不应出现明显的细胞死亡，尽管可能存在局部生长不良或增殖速率减慢的情况。传代会影响细胞的成熟状态（例如，会去除细胞突起以及细胞间已形成的网络结构），因此在计划收集或分析细胞时应充分考虑此因素。例如，进行钙成像实验时，建议在分析前2至6天内进行传代。传代时间距离分析过近可能导致细胞尚未充分连接或成熟，而间隔过长则可能导致细胞过度拥挤，从而影响成像效果。尽管不同实验之间可能存在一定变异性，但结果与最初报道的二维小脑分化方案一致1,2。免疫细胞化学染色和基因表达分析证实存在表达颗粒细胞标志物ZIC1的细胞，同时也检测到其他神经及小脑细胞类型的标志物（图7 和 图8）。钙成像实验通过电刺激经fluor5染料孵育的细胞，显示了功能性神经元活动（图9、补充图1 和 补充图2），但尚不能确定这些细胞是否为颗粒细胞。可以认为，若延长培养时间至35天以上，给予细胞更充分的成熟时间，功能性神经元活动的水平有望进一步提高。这一可能性有待未来进一步探索。

除了上述建议的研究方向外，还值得探究2D与3D培养方案在产物特性（数量与质量）上的差异。在2D方案中尚未检验外源性FGF的作用，了解在接种后缺乏3D结构及其相关信号通路的情况下，2D培养是否对早期模式化化合物具有更高或更低的依赖性，将具有重要意义。更简化的方案（例如，无RA、BDNF、SAG）同样值得作为进一步研究的方向。最后，未来的研究可借助新的研究工具，以更准确地表征（并评估）人类特异性小脑神经元亚型的生成效率。

在考虑上述注意事项的前提下，这两种已报道的方案均可用于小脑分化，其产物适用于不同目的。这些方案可为研究人员开展预实验、检测细胞系进行此类分化的可行性，或作为其他类型靶向神经分化的基础模型提供实用的起点。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Gerbren Jacobs和Jurjen Broeke提供的专业技术支持，感谢Prisca Leferink在两个对照iPSC细胞系的建立与表征工作中所做出的贡献，以及感谢Lisa Gasparotto对本实验操作流程的示范。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F12+GlutamaxGibco31331-028含谷氨酰胺的DMEM/F12培养基
Neurobasal培养基Gibco21103-049神经基础培养基
N2添加剂Gibco17502-048
B27添加剂Gibco17504001
胰岛素ImgenPT468-B
L-谷氨酰胺Gibco25030-024
非必需氨基酸（NEAA）Gibco11140-035
β-巯基乙醇Gibco21985-023
多聚-L-鸟氨酸SigmaP3655
聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）SigmaP3932又称Poly-Hema
层粘连蛋白SigmaL2020
E8培养基及添加剂GibcoA1517001人多能干细胞培养基及添加剂
青霉素/链霉素Gibco15140-122
氯化钠SigmaS-5886
y-27632（ROCK抑制剂）SelleckChemS1049-10mg
DMSOSigmaD-2650
GeltrexGibcoA1413302适用于人多能干细胞的粘附涂层（PAAC）
0.5 M EDTAGibco15575-020
0.2 μm滤器VWR28145-77
1.5 mL Eppendorf离心管VWR525-0130
DMEM/F12Gibco21331-020
乙醇VWR83804360
Parafilm封口膜SigmaPM996培养板包裹用
冻存管ThermoFisher368632
TrypLEGibco12563-029基于胰蛋白酶的细胞解离试剂
定义型胰蛋白酶抑制剂（DTI）GibcoR-007-100
FGF-2Peprotech100-18B
FGF-4R&D Systems100-31
FGF-8BPeprotech100-25
视黄酸SigmaR2625
脑源性神经营养因子Peprotech450-02
胶质细胞源性神经营养因子Peprotech450-10
氯化钾SigmaP5405
神经营养因子3Peprotech450-03
Smoothened激动剂（SAG）Cayman11914CAS 912545-86-9
Axiovert 40C显微镜Zeiss明场成像显微镜
AxiocamZeiss明场成像—图像采集
Eppendorf Centrifuge 5810离心机Eppendorf521-0996细胞培养用离心机
PBS（磷酸盐缓冲液）Braun Medical3623140
5 ml移液管VWR612-4950
10 ml移液管VWR612-4951
6孔培养板VWR734-2323
12孔培养板VWR734-2324
人胚胎干细胞（hESCs）WiCELL品系H01

参考文献

  1. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

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FGF2 ROCK

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