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结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲 果蝇

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DOI：

10.3791/56900

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2018年4月24日

 ,  , 
1School of Life Science, University of Science and Technology of China, 2State key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

使用染色食物进行定量摄食检测，为评估摄食动机提供了一种可靠且高通量的方法。将食物消耗检测与热遗传学和光遗传学筛选相结合，是研究成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）食欲相关神经环路的有力手段。

摘要

食物摄入受到大脑的严格调控，大脑会整合机体的生理状态、食物的适口性以及营养成分，并发出指令以启动或停止进食。解析适时且适量进食决策过程的机制，对于我们理解与摄食调控相关的生理及心理障碍具有重要意义。在实验干预（例如强制增强特定靶向神经元的活性）后，需要采用简单、定量且可靠的定量方法来测量动物的食物摄入量。本文介绍了基于染料标记的摄食检测方法，以促进对成年果蝇摄食调控的神经遗传学研究。我们综述了现有的摄食检测方法，随后逐步阐述从实验设置到数据分析的具体操作流程，该方法结合了对摄食动机相关神经元的热遗传学与光遗传学操控，以及染料标记食物摄入检测技术。此外，我们还讨论了本方法相较于其他摄食检测手段的优势与局限性，以帮助读者选择合适的实验方案。

引言

量化摄入食物的量对于评估大脑在响应内部需求（如饥饿状态）和外部因素（如食物质量和适口性）时对摄食行为的多种调控机制至关重要1,2,3,4,5,6,7,8,9。近年来，解析果蝇（Drosophila）摄食调控神经基础的研究推动了多种实验方法的发展，这些方法可用于直接量化摄入的食物量，或作为摄食动机的指标10,11,12,13,14,15,16。

CApillary FEeder（CAFE）实验法12,13 被开发用于测量果蝇在玻璃微毛细管中摄取的液态食物量。CAFE 实验法具有高度敏感性和可重复性17，简化了摄食量的测定过程，尤其适用于长期摄食的定量分析18。然而，该实验要求果蝇爬至微毛细管尖端并倒挂取食，这一行为限制使其不适用于所有品系。此外，由于用于 CAFE 实验的果蝇必须在液态食物上培养，这种培养条件对代谢状态的影响或潜在的营养不良问题仍有待明确。

Proboscis Extension Response（PER）实验11,14通过统计果蝇对食物液滴轻触产生吻部伸展反应的频率来进行检测。该实验已被证实是评估单只果蝇摄食动机以及食物适口性和成分影响的有效方法18,19。然而，该方法并不能直接定量摄食量。

最近开发了一种半自动方法——手动喂食实验（manual feeding assay, MAFE）15。在MAFE中，通过微毛细管手动喂食一只固定不动的果蝇。由于可以同时监测喙伸展反应和食物摄入情况，MAFE适用于评估营养物质的价值以及药理学干预的影响。然而，固定果蝇可能会对其行为表现（包括摄食行为）产生负面影响。

此外，果蝇喙管与活动检测器（FlyPAD）10 被开发用于自动量化摄食行为。利用机器视觉方法，FlyPAD 记录果蝇与食物之间的物理接触，以喙管伸展的频率和持续时间作为摄食动机的指标。FlyPAD 提供了一种高通量的方法来监测自由活动果蝇的摄食行为，但该系统的灵敏度和稳健性仍有待更多研究进一步验证12。

标记策略常用于估算果蝇的食物摄取量。通常使用化学示踪剂对食物进行标记，果蝇取食后，通过检测摄入示踪剂的量来计算食物摄入量。放射性示踪剂16,17,20,21,22,23,24,25可在不均质化果蝇个体的情况下透过体壁进行检测。该方法具有极低的变异性和高灵敏度18，适用于长期的食物摄入研究。然而，使用该检测方法时，需考虑可用放射性同位素的可获得性以及不同物质在吸收和排泄速率上的差异。

使用无毒食用色素对食物摄入进行标记和追踪是一种更安全、更简便的替代方法2,3,26,27,28。果蝇在摄食含有可溶性且不可吸收染料的食物后被匀浆化，随后使用分光光度计定量测定摄入染料的量3,24,28,29。该标记策略操作简便且效率高，但存在局限性。由于果蝇在开始进食后15分钟内即开始排泄，因此根据摄入染料估算的食物摄入体积小于实际体积17。此外，该检测通常在60分钟内评估食物摄入情况，仅适用于短期摄食行为的研究24,28。而且，多种内外部因素，如基因型17、性别17、交配状态17、饲养密度30、昼夜节律31,32以及食物质量3,8,16，均会影响食物摄入量。因此，可能需要根据具体的实验条件调整摄食持续时间。除了有助于量化食物摄入外，食用色素还被用于评估食物选择行为2,19,27，以及在CAFE实验中可视化微毛细管中的弯月面12。

本文介绍了一种将神经元活性操控与染料标记方法相结合的实验方案。该策略已在我们针对成年果蝇摄食调控的神经遗传学研究中被证明具有实用价值24。视觉评分法可快速估算食物摄入量，因此适用于在短时间内对大量品系进行筛选。筛选获得的候选品系随后可通过比色法进行详细分析，以在后续研究中提供客观且精确的定量结果。

除了摄食实验外，我们还描述了热遗传学方法27,33,34,35 光遗传学36 强行激活目标神经元的方法 果蝇通过热遗传学操作激活神经元简单且便捷 果蝇 瞬时受体电位锚蛋白1（dTRPA1），是一种温度和电压门控阳离子通道，当环境温度升至23 °C以上时可增加神经元兴奋性33,37；然而，在高温下测试动物可能会对行为产生不良影响。另一种有效激活神经元的方法是 果蝇 使用CsChrimson进行光遗传学实验36，这是一种通道视紫红质的红移变体，可在光照下增加神经元的兴奋性。与热遗传学相比，光遗传学具有更高的时间分辨率，且对动物行为的干扰更小。将摄食量的定量测量与神经元活动的调控相结合，是研究摄食神经机制的有效方法。

我们详细描述了取食室的制备以及待测果蝇的准备。以Taotie-Gal4果蝇为模型24，介绍了通过热遗传学和光遗传学方法激活神经元的操作。本方案还描述了两种使用染料标记食物来定量检测摄食量的实验方法。

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方案

1. 准备饲喂室

注意：用于染料标记摄食实验的摄食室由两部分组成：外部容器（作为盖子）和内部容器（作为食物来源）。

  1. 将外部容器改为用于培养黑腹果蝇（Drosophila）的玻璃小瓶（内径为31.8 mm，高度为80 mm）（图1A，1C）。在容器底部覆盖一层1%琼脂糖（5 mL），以保持喂养装置的适当湿度，并为果蝇提供柔软的行走基质（图1B）。该容器由此提供一个受控但接近自然的环境，使果蝇所受压力和干扰最小化。
    1. 准备外部容器：将0.5 g琼脂糖悬浮于50 mL双蒸水中，频繁搅拌并加热，在带加热板的磁力搅拌器上煮沸至完全溶解。
    2. 当1%琼脂糖冷却至约60 °C时，取5 mL倒入空的外部容器中（图1B），保持容器敞开直至冷却至室温，形成琼脂糖垫。
  2. 制备染料标记食物。染料标记食物的成分根据不同的实验目的而变化。以下为仅含蔗糖的染料标记食物的制备示例：
    1. 将0.5 g琼脂糖加入50 mL双蒸水中，频繁搅拌并加热，在带加热板的磁力搅拌器上煮沸至完全溶解。
    2. 当上述1%琼脂糖冷却至约60 °C时，向其中加入1.71 g蔗糖，得到100 mM蔗糖溶液。
    3. 向琼脂糖溶液中加入0.25 g蓝色染料（二钠盐依柔红），得到0.5%（w/v）的染料标记食物。
  3. 准备内部容器。将空的内部容器置于平坦的水平面上，然后向每个食物容器中加入750 µL蓝色染料标记食物，静置至少5分钟使其凝固。
    注意： 内部容器为小型塑料培养皿，内径为13.6 mm，高度为7.5 mm（图1A，1C）。其内填充染料标记食物后，置于外部容器中琼脂糖垫的中央位置。
  4. 将装有食物的内部容器转移至已准备好的外部容器中，并置于琼脂糖垫的中央。让喂养室在室温下保持敞开状态40分钟，直至外部容器壁上无冷凝水珠。
    注意： 容器壁干燥是必要的，以防止果蝇接触水滴后粘附在壁上。
  5. 准备不含染料的食物喂养室（成分相同但不加染料），用于背景校正。

2. 果蝇的准备

注意：通常使用羽化后5至10天的成年雌蝇进行喂养实验。建议准备不同基因型的果蝇（包括遗传对照），并平行开展测试。20只果蝇（来自一个喂养室）产生一个数据点。

  1. 考虑饲养成虫果蝇时的种群密度。通常根据果蝇品系及培养瓶的尺寸，通过调整亲代果蝇的数量来控制种群密度。例如，将15只雄性与30只雌性Canton-S果蝇转移至一个培养瓶（直径31.8 mm，高度80 mm）中，让雌蝇产卵一天后移除成虫。
  2. 准备果蝇用于热遗传学激活。
    1. 使用 Gal4/UAS 系统38 表达 dTRPA133 通过将 UAS-dTrpA1 果蝇与不同的 GAL4 驱动子品系杂交，在多种神经元中图2B).
    2. 将成虫置于标准培养基中，在22 °C、60%相对湿度及12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。
    3. 在取食实验前两天，使用CO₂麻醉果蝇并进行分选和收集。2 在体视显微镜下将果蝇转移至新鲜食物小瓶中，每瓶保持20只果蝇的密度。
  3. 准备果蝇以进行光遗传学激活。
    1. 使用Gal4/UAS系统38 表达CsChrimson36 通过将UAS-CsChrimson果蝇与不同的GAL4驱动品系杂交，实现在不同神经元中的表达。
    2. 收集羽化后24小时内新羽化的果蝇，并将其转移至含有400 µM全反式视黄醛的标准食物小瓶中。
    3. 为防止过早激活，用铝箔纸包裹培养管，然后将其放入暗盒中，以保护果蝇免受不必要的光照刺激。将果蝇置于25 °C、60%湿度的黑暗环境中培养4至6天。
    4. 在进食实验开始前两天，用 CO₂ 麻醉后对雌性果蝇进行分选2 在体视显微镜下将果蝇转移至培养皿中。收集20只果蝇至一个培养瓶内，并在进食测试前置于黑暗环境中。
    5. 在弱光条件下尽快完成所有操作，以避免环境光造成的影响。使用放置在远离工作区域的LED灯，工作区域的光强为5 µW/cm2.
      注意： 使用饥饿处理的 以Canton-S果蝇作为摄食实验的阳性对照。在摄食测试前24小时，将这些果蝇置于1%琼脂糖上饥饿处理。这些果蝇的食物摄入水平有助于评估每日实验的波动情况。

3. 热遗传学激活

  1. 每天在同一时间进行所有喂养实验，大约在授时因子时间4 - 631,32，以尽量减少昼夜节律带来的差异。
  2. 准备一个培养箱（或带有温控加热器的小型房间）作为加热环境。
  3. 在行为实验前，将准备好的 feeding chambers 在实验温度（30 °C）下平衡 2 小时，以确保 feeding chamber 内温度相对均匀。
  4. 开始喂食过程时，轻轻敲击，将20只果蝇从其原培养管中转移到预热的喂食室中。在30 °C条件下继续喂食60 min。 图3A) .
    注意： 频繁开启和关闭培养箱门等扰动会不利地影响进食行为，因此应尽量减少。
  5. 在60分钟时停止喂食，将喂食室于-80 °C（或-20 °C）冷冻30分钟。
    注意： 冷冻有助于同时停止所有腔室中的喂食。将果蝇在 -80 °C 下冷冻有两个目的：一是安乐死果蝇，二是保存样本直至匀浆，可保存长达一周。
  6. 对于温度对照组，将20只果蝇转移至室温下的摄食室，其中放置染色食物，于22 °C开始摄食过程，持续60 min。
  7. 通过将培养室在 -80 °C（或 -20 °C）下冷冻 30 分钟，停止温度对照组的喂养。

4. 光遗传学激活

  1. 每天在同一时间进行所有喂食实验，大约在昼夜节律时间 4 - 631,32，以尽量减少因昼夜节律引起的变异。
  2. 通过轻柔敲击，将 20 只果蝇从一个试管小心转移至喂食室，然后将喂食室侧向放置于照明装置上（图 4A，4B）。
    1. 进行光遗传学操作时，使用橙色 LED 阵列（607 nm）作为光刺激源，并在 LED 上方固定一块水平的有机玻璃板，用于在照明期间支撑喂食室。将整个装置置于 25 °C、60% 湿度的培养箱中（图 4A，4B）。
    2. 将遗传对照果蝇与 Taotie>CsChrimson 果蝇平行进行刺激，但置于不同的喂食室中。
  3. 使用橙色背光持续照射 60 分钟，以维持喂食过程。
    1. 通过实验确定光遗传学实验的最佳光照强度36。对于 Taotie>CsChrimson 果蝇，2.2 mW/mm2 的强度会引发麻痹（运动停止和姿势控制丧失），因此在喂食测试期间，应使用 0.1 mW/mm2 的中等强度刺激 Taotie>CsChrimson 果蝇。
  4. 将喂食室在 -80 °C（或 -20 °C）冷冻 30 分钟，以终止喂食过程。

5. 食物消耗量的视觉评估

注意： 视觉评分法可对食物消耗量进行半定量估算。尽管该方法的客观性不如光学方法，但它能够及时检测大量果蝇品系，适用于遗传筛选的初筛阶段，可快速缩小候选范围，以便进行后续实验。

  1. 饲喂过程结束后，在体视显微镜下，于 CO2 麻醉垫上对果蝇进行麻醉并评分。根据每只果蝇腹部内染料标记食物的体积和着色强度，分别给予评分（图2A）。
    注：视觉评估标准：评分系统共分为4个等级，对应腹部内染色食物的不同体积和着色强度。
    1. 腹部未检测到染料标记食物的果蝇记为0分；腹部染料着色微弱（ barely detectable）或染色食物体积占腹部总体积不足三分之一的果蝇记为1分。
    2. 腹部一半区域充满明显着色食物的果蝇记为2分。
    3. 腹部超过一半区域充满明显染色内容物的果蝇记为3分（图2A）。
  2. 计算各实验条件下不同评分果蝇所占的比例（图2B）。

6. 食物摄取量的比色定量分析

  1. 停止喂食后，将喂食室中的全部20只果蝇倒入一张称量纸上，然后用软毛刷将其转移至1.5 mL离心管中。
    注意：不要同时将所有喂食室从-80 °C冰箱中取出，以免因低温容器壁上产生冷凝水而导致果蝇粘附在容器壁上。
  2. 向离心管中加入500 µL PBST，使用研磨仪在60 Hz条件下匀浆5秒。
    1. 通过观察确认匀浆是否充分：当无法检测到明显的组织碎片时，即视为匀浆完全。
  3. 将含有匀浆液的离心管在13,000 rpm条件下离心30分钟，以去除细胞碎片。
  4. 离心结束后，将100 µL上清液转移至96孔板的一个孔中。
  5. 所有样品加样完成后，将96孔板放入酶标仪中，于630 nm波长下测定各样品的吸光度。
  6. 为消除背景吸光度，需从摄食蓝色染料食物果蝇的上清液吸光度中减去摄食无染料食物果蝇上清液的吸光度。
    注意：此步骤为可选，具体取决于所用食物的成分。当未添加染料的果蝇食物在630 nm处产生吸光度时，必须执行此步骤以消除背景干扰。

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结果

热遗传学筛选。

异常增加的食欲会导致食物摄入量升高，无论生理需求如何。我们利用这一方案设计了一种高通量行为筛选方法，以获得与饥饿和饱食状态相关的神经元的遗传学工具（图1）。该筛选获得了Taotie-Gal424。当在30 °C条件下强制激活Taotie-Gal4神经元时，Taotie>TrpA1果蝇的食物摄入量高于对照组（图2，图3）。

通过视觉评估食物消耗量。

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讨论

本报告重点介绍在利用热遗传学和光遗传学激活手段操控摄食相关神经元的背景下，对食物摄入进行染料标记摄食实验的技术流程。这一简单且可靠的实验方案将有助于阐明候选神经元在摄食调控中的功能，测量果蝇的食物偏好，并通过基于摄食行为的遗传筛选鉴定摄食调控回路中的新参与者24。

染料标记策略可用于研究短期摄食行为。将染料——二钠盐酸性蓝（erioglaucine disodium）溶解于食物中并随食物摄入，是检测食物摄取的关键指标。Deshpande 等人证明，通过 CAFE 法和放射性同位素标记食物摄入法测定，蓝色染料本身对摄食行为无显著影响17。同样，我们的 PER 实验结果（使用染料标记或无染料的 100 mM 蔗糖溶液刺激果蝇腿部）表明，果蝇对染料标记食物与无染料食物的反应无显著差异。然而，目前仍缺乏明确数据说明该染料在Drosophila中是否无味。

除了方案中指出的关键步骤外，还需特别注意待测果蝇的整体状态。果蝇应饲...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作部分得到了中国国家重点基础研究发展计划（2012CB825504）、国家自然科学基金（91232720 和 9163210042）、中国科学院（CAS）（GJHZ201302 和 QYZDY-SSW-SMC015）、比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1119434）以及中国科学院百人计划（Y. Zhu）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
UAS-CsChrimsonBloomintoon55135
UAS-dTrpA1Bloomintoon26263
TDC1-GAL4 Bloomintoon9312
TDC2-GAL4Bloomintoon9313
sNPF-GAL4由 Z. Zhao 提供
NPF-GAL4由 Y. Rao 提供
TH-GAL4由 Y. Rao 提供
5-HT-GAL4由 Y. Rao 提供
AKH-GAL4由 Y. Rao 提供
dip2-GAL4由 Y. Rao 提供
Taotie-GAL4由 J. Carlson 提供
琼脂糖BiowestG-10
蔗糖SigmaS7903
二钠盐亮蓝Sigma861146
全反式视黄醛 Sigma R2500避光保存
吐温 X-100Amresco9002-93-01
果蝇培养基1 L 培养基包含：77.7 g 玉米粉，32.19 g 酵母粉，5 g 琼脂，0.726 g CaCl2，31.62 g 蔗糖，63.2 g 葡萄糖，2 g 山梨酸钾，pH   
 1× PBS 缓冲液 1 L 1× PBS 包含：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH 7.4
PBST 缓冲液含 1% Triton X-100 的 1× PBS
 研磨仪上海精新Tissuelyser-24
培养箱宁波江南HWS-80
带加热板的磁力搅拌器常州博源CJJ 78-1
光谱仪ThorlabsCCS200/M
微孔板分光光度计Thermo Scientific Multiskan GO 型号：1510，货号 51119200
荧光体视显微镜 Leica M205FA
体视显微镜Leica S6E
外容器江苏海门内径为 31.8 mm、高 80 mm 的玻璃小瓶（内尺寸）
内容器 北京怡然机械厂内径为 13.6 mm、高 7.5 mm 的塑料培养皿（内尺寸）
1.5 mL 离心管海门宁蒙
 96 孔板Corning Incorporated Costar 3599
LED 灯新兴源光电607 nm，3 W https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058

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