全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

摘要

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。

摘要

高通量全基因组RNAi（RNA干扰）筛选技术已被广泛用于发现影响宿主因子的基因 病毒复制。本文介绍了该技术在揭示特异性调控马腊巴病毒（Maraba virus）和痘苗病毒（vaccinia virus）复制的宿主靶点方面的应用，旨在增强溶瘤病毒治疗效果。尽管本方案已针对溶瘤型马腊巴病毒和溶瘤型痘苗病毒进行了测试，但该方法同样适用于其他溶瘤病毒，并可用于广泛识别调控哺乳动物细胞中病毒复制的宿主靶点。本方案详细描述了在哺乳动物细胞中建立和验证用于高通量RNA干扰（RNAi）筛选的检测方法，开展初次高通量RNAi筛选所需的关键考虑因素和准备步骤，以及进行初次高通量RNAi筛选的逐步操作指南；此外，还概述了二次筛选验证和三次验证研究的一般方法。高通量RNAi筛选的优势在于，只要能够建立相应的检测体系，便可以系统、无偏倚的方式全面鉴定出调控病毒复制任一环节的宿主因子。 体外 例如感染性、裂解量和细胞毒性等检测。该方法能够揭示基于现有知识尚未预见的生物治疗靶点。

引言

高通量全基因组RNAi筛选已被证明是揭示包括病毒生物学在内的多个研究领域生物学机制的宝贵工具。在过去十年左右的时间里，众多研究团队已开展基于细胞的大规模RNAi筛选，以系统性地鉴定调控病毒复制的宿主基因（详见综述^{1,2,3,4,5,6,7}）。有趣的是，这些筛选中有大量是在癌细胞中进行的，且部分研究使用了当前正在开发为溶瘤病毒候选物的病毒，包括痘苗病毒^8,9,10、粘液瘤病毒¹¹、单纯疱疹病毒¹²、水疱性口炎病毒^13,14和马拉巴病毒¹⁵

方案

1. 高通量siRNA筛选实验的开发与验证

注意：所有实验均应使用适用于各细胞系的 Hepes 缓冲培养基。有关从检测优化到三级验证的工作流程概述，请参见图 1。

1. 确定最佳转染条件
   1. 选择一种肿瘤细胞系，或理想情况下选择多种肿瘤细胞系，用于优化转染条件（例如 786-O、NCI-H226、SF268、U373、OVCAR-8、U20S；有关细胞系选择的更多说明，请参见讨论部分。
   2. 选择一种或多种转染试剂进行测试。可能需要测试多种转染试剂，因为不同试剂在特定细胞系中的毒性或转染效率可能存在差异。此外，需注意某些试剂可能影响病毒感染，或在成像时产生较高的背景信号。
   3. 确定阳性 [e例如。 靶向PLK-1（Polo样激酶1）mRNA的siRNA（可诱导细胞死亡）及阴性转染对照例如 非靶向siRNA
   4. 按照特定转染试剂的逆转录转染方案操作，但调整转染试剂的用量（例如 0.05、0.1、0.15 和 0.2 μL/孔）以及细胞接种密度（例如 625、1250、2500 个细胞/孔）。需设置以下条件的重复：未处理细胞、模拟转染细胞（即 细胞加转染试剂），以及使用阳性和阴性转染对照siR....

结果

用于确定宿主靶点以增强溶瘤病毒治疗的实验流程概览见图1。

如图1所示，进行高通量RNAi筛选的关键第一步是建立检测方法。图2A展示了一个用于转染优化检测的示例板布局。图2B包含预期结果的代表性图像，而图2C为预期结果的代表性图表。在对PLK-1基因进行siRNA敲低后（该基因可诱导细胞死亡，常作为阳性对照用于监测siRNA敲低效率），除非细胞系的倍增时间较长（此时观察细胞死亡表型所需时间更长），否则细胞存活率预期应在0–30%之间。非靶向siRNA应对细胞基本无毒性，其相对存活率应与未处理细胞相近。

讨论

本文介绍了一种利用高通量RNAi筛选来鉴定可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案。该方法已成功应用于溶瘤型马腊巴病毒（Maraba virus）和溶瘤型痘苗病毒（vaccinia virus），但如文中所述，也可根据需要调整用于其他溶瘤病毒或一般病毒，以鉴定调控病毒复制的宿主基因。该筛选方案的设计也可用于鉴定促进或抑制病毒扩散的基因，但可根据需要轻松修改以适应其他检测指标。例如，我们针对马腊巴病毒的筛选旨在利用基于刃天青（resazurin）的简单活细胞染料检测法评估细胞活力，从而鉴定调控溶瘤作用的基因（见图4）¹⁵。在此类筛选中，病毒感染孵育后，不再使用甲醛固定细胞并用Hoechst染色，而是向每孔加入刃天青染料（终浓度为20 μg/mL），经6小时孵育后，使用酶标仪测定吸光度（573 nm）。我们也可选择基于Hoechst染色的细胞数量作为检测指标。尽管在此筛选中无需使用替代性报告分子来监测病毒复制，但携带报告蛋白（尤其是荧光蛋白）的病毒有助于优化筛选流程，例如可实现对病毒复制的实时监测；此外，使用带有报告蛋白的病.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>耗材
siRNA文库	GE Dharmacon	G-005005-02
Corning 384孔板	康宁	3985
Falcon 384 孔板	Becton Dickinson	353962
水	Sigma	W4502
siGenome SMARTpool PLK1	GE Dharmacon	M-003290-01
AllStars 阴性对照 siRNA	Qiagen	SI03650318
siGenome 非靶向 siRNA 混合物 #2	GE Dharmacon	D-001206-14-20
DMEM/高糖	GE Healthcare Life Sciences	SH30022.01
胎牛血清	Sigma	F15051-500ML
HEPES溶液（1 M）	Sigma	H3535-100ML
青霉素-链霉素 100 倍溶液	GE Healthcare Life Sciences	SV30010
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	赛默飞世尔科技	2500056
DPBS/改良版	GE Healthcare Life Sciences	SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX	赛默飞世尔科技	13778100
Oligofectamine	赛默飞世尔科技	1225011
Opti-MEM	赛默飞世尔科技	22600-050
刃天青钠盐	Sigma	R7017-5G
Hoechst 33342	赛默飞世尔科技	H21492
甲醛（37% 质量分数）	Fisher Scientific	F79-4
500 ml 瓶	康宁	430282
微孔板用粘性密封膜	Excel Scientific	361006007
可剥离热封箔	赛默飞世尔科技	AB-3720
BioTek MicroFlo Select 分液器卡带	Fisher Scientific	11-120-625
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>仪器设备
MicroFlo Select（液体分配器）	Fisher Scientific	11120621
BioTek Synergy HT 酶标仪	Biotek	N/A
Opera 成像与分析仪器	PerkinElmer	HH10000115
KiNEDx 机械臂	峰形分析与自动化（原名为 Peak Robotics）	KX-300-660
Cytomat 24C系列自动培养箱	赛默飞世尔科技	50080227
JANUS 自动化工作站	PerkinElmer	AJI4M01
板架转盘	峰形分析与自动化（原名为 Peak Robotics）	N/A
Alps 3000 微孔板封膜机	赛默飞世尔科技	AB-3000