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全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

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DOI：

10.3791/56913

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2018年4月3日

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1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。

摘要

高通量全基因组RNAi（RNA干扰）筛选技术已被广泛用于发现影响宿主因子的基因 病毒复制。本文介绍了该技术在揭示特异性调控马腊巴病毒（Maraba virus）和痘苗病毒（vaccinia virus）复制的宿主靶点方面的应用，旨在增强溶瘤病毒治疗效果。尽管本方案已针对溶瘤型马腊巴病毒和溶瘤型痘苗病毒进行了测试，但该方法同样适用于其他溶瘤病毒，并可用于广泛识别调控哺乳动物细胞中病毒复制的宿主靶点。本方案详细描述了在哺乳动物细胞中建立和验证用于高通量RNA干扰（RNAi）筛选的检测方法，开展初次高通量RNAi筛选所需的关键考虑因素和准备步骤，以及进行初次高通量RNAi筛选的逐步操作指南；此外，还概述了二次筛选验证和三次验证研究的一般方法。高通量RNAi筛选的优势在于，只要能够建立相应的检测体系，便可以系统、无偏倚的方式全面鉴定出调控病毒复制任一环节的宿主因子。 体外 例如感染性、裂解量和细胞毒性等检测。该方法能够揭示基于现有知识尚未预见的生物治疗靶点。

引言

高通量全基因组RNAi筛选已被证明是揭示包括病毒生物学在内的多个研究领域生物学机制的宝贵工具。在过去十年左右的时间里，众多研究团队已开展基于细胞的大规模RNAi筛选，以系统性地鉴定调控病毒复制的宿主基因（详见综述1,2,3,4,5,6,7）。有趣的是，这些筛选中有大量是在癌细胞中进行的，且部分研究使用了当前正在开发为溶瘤病毒候选物的病毒，包括痘苗病毒8,9,10、粘液瘤病毒11、单纯疱疹病毒12、水疱性口炎病毒13,14和马拉巴病毒15。尽管这些研究的主要目标是鉴定影响病毒复制某一环节的宿主因子，而非专门寻找可用于增强溶瘤病毒治疗效果的生物治疗靶点，但这些数据集仍可被深入挖掘，用于此目的。显然，利用这些筛选手段发现可调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的潜力尚未被充分开发。

目前正在开展大量针对溶瘤病毒平台的临床前和临床研究，包括单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒和痘苗病毒，其中一些已在晚期临床试验中显示出显著疗效。对于大多数此类平台，研究重点集中在改造病毒基因组以增强治疗效果。例如，为提高对肿瘤的特异性，已对特定病毒基因进行删除或突变，从而显著限制病毒在正常细胞中的复制，而在肿瘤细胞中则不受影响。在某些情况下，还引入了外源基因，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）以增强免疫应答，或钠碘同向转运体（NIS）以实现 体内 用于治疗目的的成像和细胞摄取放射性碘。然而，目前针对调控宿主/肿瘤基因并探究宿主/肿瘤基因对溶瘤病毒复制影响的研究极为有限。随着高通量筛选技术的发展，现已能够在基因组水平上研究宿主与病毒之间的相互作用，并揭示通过调控宿主基因组以增强溶瘤病毒治疗效果的新机遇（综述见16,17,18).

我们报道了首个通过高通量遗传筛选验证概念的研究，旨在识别可用于增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点。为发现调控Maraba病毒溶瘤作用的宿主基因（Maraba病毒是一种正进行I期和II期临床试验的溶瘤弹状病毒），我们利用靶向18,120个基因的siRNA（小干扰RNA）文库，在三种不同的肿瘤细胞系中重复进行了全基因组RNA干扰筛选。15筛选结果的通路分析显示，内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激反应通路的成员显著富集。我们从这些通路中选取了10个候选基因，使用与初筛不同的靶向序列的siRNA进行二次验证。作为三级验证的一部分，我们开展了IRE1α（inositol-requiring enzyme 1 alpha）的挽救实验，以确认候选基因的作用为靶点特异性。 体外 和 体内 使用IRE1α小分子抑制剂进行测试，结果显著增强了溶瘤疗效。

Workenhe 等12 还利用一个靶向 16,056 个基因的混合型慢病毒 shRNA（短发夹 RNA）文库，开展了全基因组范围的 RNA 干扰筛选，以鉴定限制人单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）突变株 KM100 介导的乳腺癌细胞溶瘤作用的宿主因子。在初筛中，他们鉴定出 343 个基因，其表达下调可导致 KM100 感染细胞的细胞毒性较对照感染细胞增强；他们从中选取了 24 个基因进行二次验证。在 24 个基因中，有 8 个基因在二次筛选中得到确认，其中之一为 SRSF2（丝氨酸/精氨酸富集剪接因子 2），该结果在后续的三轮验证中通过基因拯救实验进一步证实。研究团队进一步鉴定出一种 DNA 拓扑异构酶抑制剂类化疗药物，该药物可降低 SRSF2 的磷酸化水平，并发现将 HSV-1 KM100 与该抑制剂联合治疗可延长携带 TUBO 肿瘤的小鼠的生存期。

在上述研究中，均遵循了相似的工作流程。每项研究均首先进行全基因组范围的RNAi初筛，随后对初筛中鉴定出的部分阳性结果进行二次筛选。接下来开展三次验证实验，包括通过遗传拯救实验确认阳性结果的作用靶点特异性。 体外 通过操控目标基因产物进行最终验证 体内本文首先提供了一种高通量siRNA筛选实验的建立与验证通用方案，包括确定最佳转染条件、病毒用量及感染时间。此外，我们还提供了进行初筛高通量siRNA筛选的详细步骤，以及对二次筛选验证和三次验证方法的整体描述。

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方案

1. 高通量siRNA筛选实验的开发与验证

注意：所有实验均应使用适用于各细胞系的 Hepes 缓冲培养基。有关从检测优化到三级验证的工作流程概述，请参见图 1。

  1. 确定最佳转染条件
    1. 选择一种肿瘤细胞系，或理想情况下选择多种肿瘤细胞系，用于优化转染条件（例如 786-O、NCI-H226、SF268、U373、OVCAR-8、U20S；有关细胞系选择的更多说明，请参见讨论部分。
    2. 选择一种或多种转染试剂进行测试。可能需要测试多种转染试剂，因为不同试剂在特定细胞系中的毒性或转染效率可能存在差异。此外，需注意某些试剂可能影响病毒感染，或在成像时产生较高的背景信号。
    3. 确定阳性 [e例如。 靶向PLK-1（Polo样激酶1）mRNA的siRNA（可诱导细胞死亡）及阴性转染对照例如 非靶向siRNA
    4. 按照特定转染试剂的逆转录转染方案操作，但调整转染试剂的用量（例如 0.05、0.1、0.15 和 0.2 μL/孔）以及细胞接种密度（例如 625、1250、2500 个细胞/孔）。需设置以下条件的重复：未处理细胞、模拟转染细胞（即 细胞加转染试剂），以及使用阳性和阴性转染对照siRNA转染的细胞（参见 图2A 样品板布局示意图）。
      1. 通常，为每种siRNA配制80 nM的稀释液，以达到孔中10 nM的终浓度（根据文库不同，可能需要更高的siRNA浓度）。除非另有说明，使用转染试剂稀释液稀释siRNA。同时配制转染试剂的稀释液。
      2. 每孔加入5 μL siRNA，随后加入5 μL稀释的转染试剂。为便于操作，将siRNA混合物和单独的siRNA稀释液（用于未处理组和模拟转染细胞）沿U型底96孔板的一列分布；将稀释的转染试剂和单独的转染试剂稀释液（用于未处理组细胞）沿第二列分布。
        1. 使用电子移液器，将第一列含有siRNA或siRNA稀释液的溶液5 μL/孔移入384孔板中对应的孔内，随后从第二列中加入5 μL/孔的稀释转染试剂或转染试剂稀释液至相应孔中。
      3. 将培养板在室温下以1026 × g离心1分钟，并按照转染试剂说明书规定的时间进行孵育（例如 5-20 分钟
      4. 在培养板孵育的同时，制备不同密度的细胞悬液。每孔加入30 μL细胞悬液。在将培养板放入孵育箱之前，于室温静置45–60分钟，以使细胞均匀沉降19.
        注意：如果转染试剂与siRNA的孵育时间较短，应在孵育前准备好细胞悬液。
      5. 孵育48至72小时，具体时间取决于筛选实验所选的基因敲低持续时间。
    5. 配制固定和染色溶液，包含甲醛、Hoechst 33342 和 PBS（磷酸盐缓冲液），使每孔终浓度为 4% 甲醛和 5 ug/mL Hoechst 33342。根据需要，可尝试更高浓度（例如 7.5 微克/毫升）或更低浓度（例如 2 µg/mL）的Hoechst，以分别调整信号过弱或过强的情况。
    6. 向所有孔中直接加入30 μL固定和染色溶液。将培养板在37 °C孵育30分钟。孵育后将培养板置于4 °C保存。若使用非共聚焦显微镜，需用板式洗板机以PBS洗涤培养板；大多数情况下，使用共聚焦显微镜时无需洗涤步骤。
    7. 开发一个用于量化每孔细胞数量的脚本。
      注意：目前有多种软件套件可用于此目的，尽管每种软件生成脚本的方式可能不同，但通常都具备识别细胞核、细胞和感兴趣区域的功能，并可计算荧光强度和形态学参数。在开发筛选脚本时，需考虑每块孔板运行脚本所需的时间，建议仅包含必要的测量指标，以尽量减少处理时间。例如，为定量细胞数量，可计算每孔中高于特定强度的Hoechst染色面积；为定量病毒扩散，可计算每孔中高于特定强度的GFP（绿色荧光蛋白）面积。 "精简" 脚本需要与更详尽的脚本进行比较，以确保没有遗漏重要信息。
    8. 分析结果以确定最佳转染条件，即转染试剂用量和细胞接种密度，使细胞死亡显著（细胞存活率0-30%），同时对细胞的毒性最小例如 90-100% 细胞存活率）。注意：在倍增时间较长的细胞系中，观察细胞死亡表型可能需要更长时间。参见 图2B 和 2C 以获得代表性结果。同时，确保转染非靶向siRNA的细胞在固定时融合度约为90–100%，因为后续实验需要感染处于此融合度的细胞。
  2. 确定病毒感染的最佳剂量与感染时长
    1. 按照上述相同的反向转染步骤操作（参见1.1.4.1至1.1.4.4）；但仅使用最佳转染条件（参见1.1.8）例如 对于786-O细胞：每孔1500个细胞，每孔0.05 μL RNAiMAX；此外，还需额外设置用于病毒感染的孔例如 未处理细胞孔、模拟转染细胞孔、转染非靶向siRNA的细胞孔，以及已知情况下的转染阳性病毒对照的细胞孔即 靶向宿主基因的siRNA（可抑制或增强复制）
      1. 参见 图3A 样品板布局示例。孵育48–72小时。
    2. 用表达荧光报告蛋白的溶瘤病毒转染额外的病毒孔例如 GFP）与一系列感染复数（MOIs）（例如 0.001 到 10；所选范围将取决于细胞系的耐药性或敏感性水平。同时设置未感染的对照孔。每孔加入 40 μL 各病毒稀释液，终体积为 80 μL。将每块板在室温下以 400 × g 离心 30 分钟。
    3. 感染后，使用高内涵自动化显微镜定期对活细胞进行成像例如 每4-8小时一次）。参见 图3B 和 3C.
    4. 开发一种脚本以量化病毒传播（例如 每孔GFP面积）（参见1.1.7）。分析图像，选择一个时间点和感染复数（MOI），以便能够检测到扩散程度的增加和减少。确保所选时间点和MOI处于线性范围内，以利于检测微小的扩散变化。估算该时间点和MOI下的Z因子（或Z'）。
      注意：估计的Z因子 = 1 - 3(σp + σn)/|μp-μn|，其中 σp 阳性病毒对照的样本标准差，σn 为阴性病毒对照的样本标准差；以及 μp 阳性病毒对照的样本均值和μn 阴性对照的样本均值。估计的Z因子在0.5至1.0之间时，被认为是一项优秀的检测方法，适用于筛选实验。20,21.
    5. 通过比较阴性病毒对照siRNA与模拟转染及未处理孔，确认该阴性病毒对照siRNA对病毒复制无影响。通常需要测试多个阴性对照，因为某些阴性siRNA对照可能会影响病毒复制。
  3. 高通量筛选实验的最终验证
    1. 重复上述步骤1.2.1和1.2.2，但此次使用最佳MOI感染细胞。在最佳时间点（见1.2.4）固定并染色培养板（如1.1.5和1.1.6所述），而非进行活细胞成像。
    2. 成像培养板。使用将用于筛选的相同脚本分析结果（参见1.1.7和1.2.4）。确认转染条件即 在转染阳性转染对照的孔中表现出良好的基因敲低效果，且在转染阴性转染对照的孔中表现出最低的细胞毒性。估算Z因子以评估该检测方法的稳健性（参见1.2.4）。
  4. 高通量筛选的进一步测试与注意事项
    1. 测试微量滴定板的耐用性，因为某些板在离心过程中可能会破裂，尤其是在盖上盖子且多个板同时离心时。为减少破裂，可在去除盖子的情况下离心（前提是板已加密封膜），或减少每个离心桶中离心的板数。
    2. 检测转染试剂混合物随时间的稳定性。一旦将转染试剂加入孔板，在添加细胞前可能会有显著延迟；因此，明确转染试剂混合物保持有效作用的时间范围至关重要。在进行筛选时，可能需要在向孔板中加入转染试剂混合物之前预先准备细胞。
    3. 准备使用液体分配器。确定转染试剂、细胞、病毒和固定液的分配体积，同时考虑管路所持留的体积、预分配损失的体积（若设备具备此功能）以及分配瓶中所需保留的残余体积。
      1. 设置并测试用于分配转染试剂、细胞和病毒的程序。为尽量减少转染试剂的损耗，应尽可能减少预分配次数。建立液体分配仪的校准规程，并验证其准确性和精密度。
    4. 准备大量分装转染试剂、细胞和病毒
      1. 首先，根据可同时进行胰蛋白酶消化的细胞培养板数量、可同时离心的微量培养板数量、使用液体分配器处理一批培养板所需的时间以及成像所需时间，确定每批处理的培养板数量。注意：通常每次处理约30块培养板是可行的，一天内处理三批在操作上是可管理的。
      2. 通过实验验证处理一批培养板所需的转染试剂体积。通过在一块培养板上多次分配5 μL蒸馏水，重复次数等同于处理一批培养板所需的次数，以检验该体积是否充足。
      3. 为确保细胞分布均匀，先估算将细胞分配到一批培养板所需的时间。准备一个容器，装入一批培养板所需的细胞体积，并在与分配整批培养板相同的时间范围内，定期将细胞逐列加入培养板的多个列中。测试为维持细胞均匀分布所需混匀细胞的频率。
      4. 为确保病毒均匀分布，重复上述相同步骤（参见1.4.4.3），但此次将病毒液加入汇合度达到100%的孔中。若病毒分布不均，可考虑将病毒液置于锥形管中，并在加样前对每根管进行涡旋振荡。
    5. 追踪细胞生长情况，以确定获得足够数量细胞用于筛选所需的时间。同时，确定处于对数生长期的每块培养板平均可收获的细胞数量，以便估算筛选所需的细胞数量。
  5. 高通量筛选的最终制备步骤
    1. 在开始筛选前最多一个月，确定筛选所需的所有材料。订购所需的试剂（见材料部分）。确保手头有足够的病毒量（建议使用优化阶段所用的同一批次病毒储备液）。
    2. 在开始筛选前最多两周，解冻并培养筛选所需的细胞。确保离心机及方形离心桶可用。
    3. 在开始筛选前的一周内，准备好用于反向转染和感染的培养基瓶、70%乙醇储备液以及2X转染试剂稀释液（例如 2X Opti-MEM），如有必要（例如 如果siRNA文库溶解于无RNase的水中，则转染细胞时需使用2X浓度），并准备病毒分装液（每批培养板使用一份）。检查细胞的生长状态。
      1. 配制Hoechst 33342染色剂的储备液（例如 5 mg/mL）。如果离心需要，准备一个平衡板。
      2. 确保将要使用的洗板机处于良好的工作状态。确保液体分配器已正确校准，并能准确、精确地分配液体。同时，确保液体分配器的程序已正确设置。

2. 进行主要的高通量筛选

注意：在开始RNAi筛选之前，需准备微孔板（例如 384孔板）需要用siRNA文库和筛选对照进行点阵排列。以下步骤最好由两人协作完成，其中一人（即 人员A）主要负责将转染试剂和细胞分配到各孔板中，第二位人员（即 人员B负责在转染前立即对培养板进行离心，并负责细胞的制备。括号内包含处理一批33块培养板的一些具体细节（即 文库的一半）与786-O细胞系

  1. 反向转染的准备工作
    1. 人员A：将处理一批培养板所需的足够培养基、胰蛋白酶和PBS置于37 °C水浴中。可选步骤：对一板细胞进行胰蛋白酶消化，并计数每板细胞数量，以实时估算每批次所需的培养板数量。
    2. 获取一批培养板（例如 从冷冻箱中取出33块培养板，静置20–30分钟，使其解冻。在培养板解冻的同时，继续进行以下步骤。
      1. 人物A：将转染试剂稀释液吸取至50 mL锥形管中，用量为处理一批培养板所需量（例如 2 × 37.125 mL）置于37 °C水浴中。用70%乙醇填充两个瓶子（例如 250–500 mL 瓶）。取两支 50 mL 离心管加入 PBS，一支加入蒸馏水。
      2. 人员A：将液体分配器的管路浸入盛有70%乙醇的瓶子中。如果并非所有吸头都将用于分配转染试剂（例如 如果未使用培养板外周的孔，则先拆下不需要的管路。用美纹纸胶带在管路上标记出该位置以下可视为无菌的界限。用约25 mL液体预冲洗管路。向瓶中补充额外的乙醇以替换已消耗的体积。让管路在乙醇中浸泡至少5分钟。
      3. 人员B：准备进行细胞消化。用70%乙醇喷洒组织培养（TC）超净台。将细胞制备所需的移液器、枪头、瓶子和微量离心管喷洒乙醇后放入超净台内（参见2.2.1.1和2.2.1.2）。将密封的培养板分批在室温下以1026 × g离心2分钟。若先前已确定在离心过程中保留盖子可能导致培养板破裂，则在组织培养（TC）超净台内打开培养板盖子（参见1.4.1）。
    3. 人员A：从孔板上移除密封膜。在移除密封膜之前、期间或之后（根据所需的孵育时间而定），用移液器加入所需量的转染试剂（例如 每管375 μL，终浓度为每孔0.05 μL RNAiMAX，加入含有预热转染试剂稀释液的锥形管中例如 37.125 mL/管
    4. 用移液器上下吹打混合10次。在室温下孵育，孵育时间根据所使用的转染试剂说明书规定的时间而定（例如 0-10 分钟
  2. 反向转染
    1. 让人员B完成以下任务。
      1. 开始用胰蛋白酶处理细胞（例如 3 个 786-O 细胞培养皿。吸去每块培养皿中的培养基，用 9 mL PBS 清洗。每块培养皿中加入 3 mL 胰蛋白酶，37 °C 孵育约 5 分钟。用 22 mL 培养基重悬细胞，吹打 10 次。
      2. 将每块组织培养板中的细胞悬液合并至一个无菌瓶中。通过倒置混匀细胞悬液。用移液器将1 mL细胞悬液分装至两个独立的微量离心管中。从每根微量离心管中取样并进行细胞计数。根据所需细胞密度计算所需细胞悬液的体积（例如 1500 个细胞/孔），并准备足量的稀释细胞悬液（例如 500 mL）用于分配至一批培养皿中。
    2. 让人员A与人员B并行完成以下任务。
      1. 排空液体分配器管路中的乙醇。用约25 mL的PBS预冲洗管路，然后排空管路。操作管路时需小心，确保将浸入转染试剂以及后续细胞悬液中的、位于遮蔽胶带下方的管路部分保持无菌。将可共用一个锥形管转染试剂溶液的培养板分组放置。
      2. 用移液器将转染试剂溶液上下吹打10次。用转染试剂溶液预润洗管路。为尽量减少转染试剂的损耗，仅使用足以润洗管尖的溶液量进行预润洗。在液体分配仪上选择正确的程序，每孔分配5 μl转染试剂。
        警告：密切监测转染试剂的液面水平，确保在用尽前及时补充。预留的培养板完成时可作为提示，需添加更多转染试剂溶液。
      3. 将板在室温下以1026 × g离心1分钟。此次离心时板盖已盖上，因此可能需要减少每次离心的板数，以防止破裂（例如 每桶2个培养板）。将培养板在室温下孵育，孵育时间根据所用转染试剂的说明书要求而定（例如 10-20 分钟
      4. 孵育期间，将转染试剂溶液的管路排空，并放入盛有 PBS 的 50 mL 锥形管中。通过引液和排液，用约 25 mL PBS 冲洗管路。
        1. 如果用于分配细胞的枪头数量多于用于分配转染试剂的枪头数量，则重新连接未使用的管路，并用70%乙醇对所有管路进行重新灭菌，然后用PBS冲洗管路（参见2.1.2.2）。
      5. 制备好细胞悬液后，轻轻混匀装有细胞悬液的瓶子。将管路插入细胞悬液中，并充分预冲，确保每个加样头均能正常排液。向所有培养板的每孔中加入30 μL细胞悬液。必要时，需定期混匀细胞悬液，以防止细胞沉降。
        注意：有时含有培养基的悬液液滴可能会附着在移液枪头的侧壁上。一旦发现此情况，应立即吸取残留液滴，或用浸有70%乙醇的无绒纸巾擦拭。
      6. 排空细胞悬液管路。用约25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗管路，随后用约50 mL蒸馏水冲洗。
    3. 将培养板在室温下静置45–60分钟（从细胞接种时开始计时），然后放回培养箱。将培养板置于稳定的培养箱中，进行所需时长的基因沉默孵育。例如 48 小时）（参见 1.1.4.5）。
  3. 感染
    1. 为节省时间，在感染细胞的前一天，将每批培养板感染所需的准确培养基体积（包括未感染孔的培养基）移液至无菌瓶中例如 2 × 350 mL 和 2 × 50 mL，适用于 33 块板）。此外，检测液体分配器的精密度和准确度，必要时重新校准。
    2. 将培养基置于37 °C预热。准备两个装有70%乙醇的瓶子，两个50 mL锥形管装入PBS，一个装入蒸馏水。确认离心机处于室温。
    3. 用70%乙醇对管路进行灭菌，并如前所述用PBS冲洗（参见2.1.2.2和2.2.2.1）。在管路浸泡于乙醇期间，用移液器将感染所需精确体积的病毒加入此前已准备好的培养基瓶中（参见2.3.1）。通过先用25 mL PBS预充并排空的方式，对管路进行PBS冲洗。
    4. 从培养箱中取出培养板，放入超净台内。用培养基预润洗管路。向未感染的对照孔中加入40 μL培养基。排空管路中的培养基，并用25 mL PBS冲洗。（注意事项参见2.2.2.5）
    5. 混合病毒后，将管路放入含有病毒的瓶子中。每孔加入40 μl病毒液。在室温下以400 × g离心板30分钟。将板放回培养箱中。按照先前确定的时间孵育板例如 24 h）（参见1.2.4）。
  4. 固定与染色细胞
    1. 为节省时间，可在固定前一日预先配制一瓶含甲醛和PBS的固定与染色溶液（例如 每批培养板使用179 mL 37%甲醛和270 mL PBS，配制成终浓度为4%的甲醛溶液，但省略Hoechst染色步骤。避光保存于易燃品柜中。
    2. 用70%乙醇和PBS冲洗管路，操作步骤如前所述（见2.1.2.2和2.2.2.1）。加入所需体积的Hoechst（例如将2.5 mL浓度为5 mg/mL的Hoechst加入固定和染色液中，使孔中终浓度为7.5 μg/mL，并混匀。
    3. 在所有孔板中加入30 μL固定和染色溶液。将孔板放入培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，为孔板加盖密封膜，并在4°C避光保存。如需洗涤，请参照步骤1.1.6。
  5. 成像与图像分析
    1. 使用自动化的高内涵显微镜对培养板进行成像。采用先前已确定的设置，但需先测试这些设置，以确保无需进行任何调整。
    2. 使用先前开发的脚本（参见1.3.2）量化每个孔中的GFP（或其他荧光报告基因）面积和Hoechst面积。首先用少量培养板测试该脚本，以确定在批量分析所有培养板之前是否需要进行轻微调整。
    3. 确定阳性结果。注：稳健Z分数/绝对中位差（MAD）方法常用于此目的。通常，得分 >2 或 <-2 被设定为截断值。当 siRNA 样本在孔板中随机分布时，此方法最为适用；而当样本按功能分组排列时则不适用，因为该方法需将样本作为 事实上的 阴性对照。筛选出具有细胞毒性的siRNA，因为这些siRNA会非特异性地减少病毒扩散（有关筛选细胞毒性阳性结果的更多细节，请参见讨论部分）。

3. 使用TRC（RNAi联盟）shRNA文库对筛选命中结果进行二次验证

注意：有关选择候选基因进行二次验证及可能的筛选技术的详细信息，请参见讨论部分。如果选择siRNA技术进行二次验证，则可采用与初筛相同的检测方法开发和验证方案（见步骤1）。

  1. 获取针对目标候选基因的定制TRC shRNA文库甘油菌株。
  2. 从甘油菌种中制备转染级质粒DNA。注意：详细方案（即 "shRNA/sgRNA/ORF 甘油菌及质粒DNA制备"）请访问此处获取：http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols。
  3. 使用DNA质粒制备表达靶向目的基因shRNA的慢病毒。注意：一种在96孔板中生产慢病毒的详细方案[即 "shRNA/sgRNA/ORF 高通量病毒生产（96孔）"] 可在此处找到：http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols。
  4. 用慢病毒感染细胞。注：96孔板中慢病毒感染的详细方案（即 "慢病毒转导") 可在以下网址在线获取：http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral%20infection%20200909.pdf
  5. 在成功转导的细胞中进行嘌呤霉素筛选后（筛选方案见3.4）或转导后立即（不进行嘌呤霉素筛选），用溶瘤病毒感染细胞。为确定病毒的最佳用量及与病毒共孵育的时间，采用与初筛实验相同的方法。

4. 三级验证

注意：三级验证的主要目的是确认命中化合物具有靶向性、肿瘤特异性，并能增强疗效 体内 还可以检测其是否在一系列肿瘤细胞系中调节扩散

  1. 确认候选基因的敲低为靶向性敲低
    1. 首先确认表型与基因沉默之间存在相关性。使用与筛选实验中相同的检测方法，或将其调整为6孔板格式，以在更大规模下评估病毒扩散的增强或抑制效应。对转染靶向目的基因的siRNA并接种病毒或不接种病毒的细胞进行时间进程分析。
    2. 对含有病毒感染细胞的孔进行成像，并定期从未感染的孔中收集细胞裂解液。确定基因沉默与病毒扩散增强或抑制之间是否存在相关性。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）和/或蛋白质印迹法（Western blotting）评估基因沉默效果。
    3. 进行遗传学拯救实验以确认筛选结果为靶向效应。注：在典型的拯救实验中，使用RNAi敲低候选基因的同时，通过瞬时转染将对该RNAi具有抗性的cDNA导入细胞例如 基因候选基因的直系同源物）以确定该基因的表型是否得到恢复或 "挽救。" 也可使用稳定表达对RNAi具有抗性的目的候选基因cDNA的细胞系。
    4. 或者，不进行基因挽救实验，而是使用多种正交检测方法来确认该靶点命中结果的特异性例如 通过多种siRNA敲低靶基因、在多个稳定表达靶基因特异性shRNA的细胞系中敲低靶基因，以及在多个细胞系中利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas9技术敲除靶基因，确定是否获得相同的表型。
  2. 确认该靶点具有肿瘤特异性，并能在多种肿瘤细胞系中调节肿瘤扩散
    1. 进行与4.1.1节类似的实验，但同时使用正常细胞及其他肿瘤细胞系。
  3. 确认对候选基因的操作可增强疗效 体内
    注意：以下是针对基因靶标的三种可能操作方法 体内.
    1. 找到一种药物来调控目标基因。如果存在靶向同一基因的药物（例如小分子抑制剂），则将其与溶瘤病毒联合使用。 体内确定给药的最佳时机至关重要。
    2. 根据研究目的，通过改造病毒来抑制或过表达目标基因，以实现对目标基因功能的抑制或增强。若需抑制目标基因，可对溶瘤病毒进行改造，使其表达该基因的显性负性突变体，或表达靶向该基因的短发夹RNA（shRNA）。若需增强目标基因的表达，则可将过表达该基因的转基因序列克隆至溶瘤病毒基因组中。
    3. 使用shRNA或CRISPR-Cas9技术分别构建基因敲低或基因敲除的细胞系。将经基因工程改造的细胞系与野生型细胞系进行移植 体内 随后用溶瘤病毒进行感染。注意：该方法可作为概念验证，有助于确定是否值得投入额外的时间和资源来开发调控该基因的药物 体内，例如，是值得的。

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结果

用于确定宿主靶点以增强溶瘤病毒治疗的实验流程概览见图1。

如图1所示，进行高通量RNAi筛选的关键第一步是建立检测方法。图2A展示了一个用于转染优化检测的示例板布局。图2B包含预期结果的代表性图像，而图2C为预期结果的代表性图表。在对PLK-1基因进行siRNA敲低后（该基因可诱导细胞死亡，常作为阳性对照用于监测siRNA敲低效率），除非细胞系的倍增时间较长（此时观察细胞死亡表型所需时间更长），否则细胞存活率预期应在0–30%之间。非靶向siRNA应对细胞基本无毒性，其相对存活率应与未处理细胞相近。

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讨论

本文介绍了一种利用高通量RNAi筛选来鉴定可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案。该方法已成功应用于溶瘤型马腊巴病毒（Maraba virus）和溶瘤型痘苗病毒（vaccinia virus），但如文中所述，也可根据需要调整用于其他溶瘤病毒或一般病毒，以鉴定调控病毒复制的宿主基因。该筛选方案的设计也可用于鉴定促进或抑制病毒扩散的基因，但可根据需要轻松修改以适应其他检测指标。例如，我们针对马腊巴病毒的筛选旨在利用基于刃天青（resazurin）的简单活细胞染料检测法评估细胞活力，从而鉴定调控溶瘤作用的基因（见图4）15。在此类筛选中，病毒感染孵育后，不再使用甲醛固定细胞并用Hoechst染色，而是向每孔加入刃天青染料（终浓度为20 μg/mL），经6小时孵育后，使用酶标仪测定吸光度（573 nm）。我们也可选择基于Hoechst染色的细胞数量作为检测指标。尽管在此筛选中无需使用替代性报告分子来监测病毒复制，但携带报告蛋白（尤其是荧光蛋白）的病毒有助于优化筛选流程，例如可实现对病毒复制的实时监测；此外，使用带有报告蛋白的病...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了安大略癌症研究所、加拿大创新基金会、渥太华地区癌症基金会以及特里·福克斯研究所的资助。K.J.A. 获得了加拿大范尼尔研究生奖学金、加拿大卫生研究院硕士奖学金以及安大略研究生奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>耗材
siRNA文库GE DharmaconG-005005-02
Corning 384孔板康宁3985
Falcon 384 孔板Becton Dickinson353962
水SigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars 阴性对照 siRNAQiagenSI03650318
siGenome 非靶向 siRNA 混合物 #2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM/高糖GE Healthcare Life SciencesSH30022.01
胎牛血清SigmaF15051-500ML
HEPES溶液（1 M）SigmaH3535-100ML
青霉素-链霉素 100 倍溶液GE Healthcare Life SciencesSV30010
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）赛默飞世尔科技2500056
DPBS/改良版GE Healthcare Life SciencesSH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX赛默飞世尔科技13778100
Oligofectamine赛默飞世尔科技1225011
Opti-MEM赛默飞世尔科技22600-050
刃天青钠盐SigmaR7017-5G
Hoechst 33342赛默飞世尔科技H21492
甲醛（37% 质量分数）Fisher ScientificF79-4
500 ml 瓶康宁430282
微孔板用粘性密封膜Excel Scientific361006007
可剥离热封箔赛默飞世尔科技AB-3720
BioTek MicroFlo Select 分液器卡带Fisher Scientific11-120-625
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>仪器设备
MicroFlo Select（液体分配器）Fisher Scientific11120621
BioTek Synergy HT 酶标仪BiotekN/A
Opera 成像与分析仪器PerkinElmerHH10000115
KiNEDx 机械臂峰形分析与自动化（原名为 Peak Robotics）KX-300-660
Cytomat 24C系列自动培养箱赛默飞世尔科技50080227
JANUS 自动化工作站PerkinElmerAJI4M01
板架转盘峰形分析与自动化（原名为 Peak Robotics）N/A
Alps 3000 微孔板封膜机赛默飞世尔科技AB-3000

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