我们介绍了整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLVs）的制备策略，该载体可用于向细胞递送CRISPR/Cas9系统。IDLVs能够快速高效地介导细胞基因编辑，与具有整合酶活性的载体相比，其作为一种基因递送载体平台具有更高的安全性，且编辑效率相当。
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本文内容
摘要
摘要
慢病毒载体因其能够稳定转导多种细胞并介导高水平的基因表达，是递送基因编辑组分的理想选择。然而，其整合至宿主细胞基因组的能力增加了插入突变的风险，从而引发安全性问题，限制了其在临床环境中的应用。此外，由具有整合能力的慢病毒载体（ICLVs）递送的基因编辑组分会持续表达，从而提高了非特异性基因靶向的可能性。作为替代方案，新一代的整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLVs）已被开发，可有效缓解上述诸多问题。本文描述了一种新型且经过优化的IDLV平台用于CRISPR介导的基因编辑的制备流程，列出了该载体纯化与浓缩的关键步骤，并利用HEK-293T细胞验证了其转导效率与基因编辑效率。该方案易于放大，可用于制备高滴度的IDLV，具备有效转导细胞的能力 慢病毒载体，整合酶缺陷型慢病毒载体，CRISPR基因编辑，HEK-293T细胞，基因递送，转导效率，插入突变风险，非特异性靶向 体外 和 体内此外，该方案可轻松适用于ICLVs的制备。
引言
精确的基因编辑是推动生物医学重大进展的基石，涉及开发新型策略以应对遗传性疾病。在基因编辑技术的前沿，是以利用成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly-interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系统为核心的方法，该系统最初被发现是细菌抵御病毒遗传物质入侵的免疫机制的一部分（参见参考文献1,2）。相较于其他基因编辑工具，如锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）（参见参考文献3），CRISPR/Cas9系统的一大优势在于其质粒设计与CRISPR组分构建的相对简便性，这一特性推动了基因编辑技术从少数专业实验室迅速扩展至更广泛的科研群体。此外，CRISPR/Cas9编程的简便性及其多重靶标识别能力，进一步提升了该技术作为低成本、易操作工具的普及程度。在研究人员可用的多种将基因编辑组分递送至细胞的方法中，病毒载体至今仍是应用最广泛且最高效的系统。
慢病毒载体（LVs）已成为递送CRISPR/Cas9系统组分的首选载体 体内 用于多种应用4
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方案
1. 培养 HEK-293T 细胞及转染用细胞接种
注意：人胚胎肾 293T（HEK-293T）细胞在 DMEM 高糖培养基中培养，该培养基添加了 10% 含铁及生长促进剂的新生牛血清，以及 1× 抗生素-抗真菌素溶液（100× 溶液每毫升含 10,000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 µg 两性霉素 B）。培养基还补充了 1× 丙酮酸钠、1× 非必需氨基酸混合液和 2 mM L-谷氨酰胺（储存液为 0.85% NaCl 中含 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）。细胞培养于 100 mm 组织培养皿中（约生长表面积为 55 cm²）。传代时采用 1:10 的传代比例，每 2–3 天传代一次。细胞传代间使用 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 进行消化。为保持实验间的一致性，建议在更换不同批次的新生牛血清时进行测试，并监测细胞生长、转染效率及载体产量的任何变化。
- 使用低代次细胞（建议不要使用第15代以后的细胞，或在细胞生长减缓时停止使用）接种至10 cm组织培养皿中，启动新培养。使用含10%血清的DMEM培养基进行细胞培养。将细胞置于标准组织培养孵育箱中，于37 °C、5% CO2条件下培养。所有后续步骤均使用标准血细胞计数板进行细胞计数。
- 当细胞生长达到90–95%融合度时，将细胞重新接种至15 cm组织培养皿中（见下文步骤1.3–1.5）。
- 重新接种时，吸除融合培养皿中的培....
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结果
IDLV-CRISPR/Cas9载体敲除效率的验证
我们采用表达GFP的293T细胞作为模型，以验证CRISPR/Cas9介导的基因敲除效率。通过以0.5的感染复数（MOI）将pLenti-GFP（vBK201a）转导至HEK-293T细胞中，获得GFP阳性细胞。图3b，“无病毒”对照组）。将sgRNA与GFP/Cas9一体化载体表达盒包装至IDLV或ICLV颗粒中，并通过p评估其生产效率24 ELISA（见上文；以及 图3a）。含有 Sp1 结合位点的载体（经浓缩后）滴度被发现处于 10 的范围内10 TU/mL。随后我们通过荧光显微镜评估了GFP基因敲除的效率（图3b). 为此，采用 5 x 105 表达GFP的293T细胞接种于6孔板中，24小时后以MOI为1和5的IDLV或ICLV.......
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讨论
IDLVs 已开始成为首选的载体 体内 基因编辑，尤其是在遗传病研究中的应用，主要得益于这些载体相较于整合型递送平台具有较低的诱变风险22,28在本论文中，我们旨在详细阐述本实验室近期开发的改进型一体化IDLV-CRISPR/Cas9系统的构建方案28.
对现有平台的改进
通过该方法，我们能够生成滴度在 1 x 1010 TU/mL 范围内的 IDLV-CRISPR/Cas9 和 ICLV-CRISPR/Cas9 载体（图 3a）。生产效率的提升可归因于在一体化 CRISPR/Cas9 载体盒中加入了 Sp1 结合位点。事实上，我们近期报道过，引入 Sp1 可使 IDLV 和 ICLV-CRISPR/Cas9 载体的包装效率提高约 2.5 倍，整体功能性滴度提高约 7 倍。这些结果与多个研究团队先前的.......
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披露
南卡罗来纳大学就本论文所述工作提交了专利USC-499-P（1175）。
致谢
我们感谢杜克大学医学院神经生物学系以及杜克大学基础科学院长办公室的支持。同时感谢杜克病毒载体核心实验室成员对本文手稿提出的宝贵意见。质粒pLenti CRISPRv2由张锋（Broad Institute）惠赠。慢病毒包装系统，包括质粒psPAX2、VSV-G、pMD2.G和pRSV-Rev，由Didier Trono（瑞士洛桑联邦理工学院，EPFL）慷慨提供。本研究的经费由南卡罗来纳大学医学院提供，资助编号RDF18080-E202（B.K）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器设备 | |||
| Optima XPN-80 超速离心机 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Allegra 25R 台式离心机 | Beckman Coulter | 369434 | |
| xMark 微孔板吸光度读板仪 | Bio-Rad | 1681150 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| 倒置荧光显微镜 | Leica | DM IRB2 | |
| 0.45-μm 滤器单元，500 mL | Corning | 430773 | |
| 锥底超速离心管 | Seton Scientific | 5067 | |
| 锥形管适配器 | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti 摆桶转子 | Beckman Coulter | 369650 | |
| 15 mL 锥形离心管 | Corning | 430791 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Corning | 430291 | |
| 高结合力 96 孔板 | Corning | 3366 | |
| 带 20 mm 网格的 150 mm 组织培养皿（TC 处理） | Corning | 353025 | |
| 100 mm 组织培养皿（TC 处理） | Corning | 430167 | |
| 0.22 μm 滤器单元，1 L | Corning | 430513 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（50） | Qiagen | 27104 | |
| 组织培养移液管，5 mL | Corning | 4487 | |
| 组织培养移液管，10 mL | Corning | 4488 | |
| 组织培养移液管，25 mL | Corning | 4489 | |
| 血细胞计数板及盖玻片 | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 细胞培养试剂 | |||
| 人胚胎肾 293T（HEK 293T）细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| 293FT 细胞 | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| DMEM 高糖培养基 | Gibco | 11965 | |
| 胎牛血清（Cosmic Calf Serum） | Hyclone | SH30087.04 | |
| 抗生素-抗真菌溶液，100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Hyclone | SH30087.04 | |
| RPMI 1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| BES（N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸） | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| 明胶 | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| p24 ELISA 试剂 | |||
| 单克隆抗-p24 抗体 | NIH AIDS 研究与参考试剂计划 | 3537 | |
| HIV-1 标准品 | NIH AIDS 研究与参考试剂计划 | SP968F | |
| 多克隆兔抗-p24 抗体 | NIH AIDS 研究与参考试剂计划 | SP451T | |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | 工作浓度 1:1500 |
| 正常小鼠血清，无菌，500 mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| 山羊血清，无菌，10 mL | Sigma | G9023 | 工作浓度 1:1000 |
| TMB 过氧化物酶底物 | KPL | 5120-0076 | 工作浓度 1:10,000 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 质粒 | |||
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 限制性内切酶 | |||
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
参考文献
- Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 1....
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重印与许可
