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方法文章

母乳促进肠类器官生长：一项研究 离体 细胞增殖模型

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DOI：

10.3791/56921

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2018年2月15日

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1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了如何从新生小鼠或早产儿肠道建立肠类器官培养系统，以及一种高效收集小鼠乳汁的方法。

摘要

人源小肠类器官源自隐窝，在干细胞微环境中培养时包含所有类型的上皮细胞。建立人源类器官的能力 离体 培养系统对于模拟肠道病理生理过程以及研究特定细胞反应具有重要意义。近年来，来自小鼠和人类的肠类器官已在全球多个实验室中被培养、传代并储存，以供未来使用。该肠类器官平台可用于检测各种治疗手段和药物对肠道不同细胞类型所产生的影响。本文提供了一种建立源自新生小鼠和早产儿小肠的原代干细胞来源的小肠肠类器官的实验方案。此外，该肠类器官培养系统被用于评估物种特异性母乳的作用效果。通过改良的人用吸乳器可高效获取小鼠乳汁，所采集的小鼠乳汁可进一步用于科研实验。本文现展示了表达获取的小鼠、人类及供体母乳对源自新生小鼠或早产儿小肠的肠类器官生长与增殖的影响。

引言

坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿因胃肠道疾病致死的首要原因，近10%在妊娠29周前出生的婴儿会受到影响1,2,3。约一半的NEC患儿会发展为最严重的形式，其存活率仅为10%至30%4,5。在美国，每年用于治疗NEC患儿的费用估计达20至30亿美元6,7，然而在过去30年中，其存活率和治疗方法均未发生显著改变。NEC的发病机制以肠道损伤和黏膜修复障碍为特征8,9,10,11，但导致炎症反应加剧的信号通路以及逆转炎症的机制仍尚未完全阐明。

对于早产儿，人乳喂养已被证实是预防坏死性小肠结肠炎（NEC）的唯一保护性策略。我们先前的研究表明，人乳通过表皮生长因子受体（EGFR）信号通路抑制肠道上皮中天然免疫受体Toll样受体4（TLR4）的活性，从而预防NEC的发生11。在实验性NEC配方奶中添加人乳成分可减轻NEC相关的炎症反应，表现为抑制肠上皮细胞凋亡并恢复其增殖能力，且该保护作用依赖于表皮生长因子（EGF）和EGFR11。另一项研究显示，人乳中的硝酸盐成分通过调节肠道灌注发挥保护作用，而婴儿配方奶缺乏硝酸盐，可能导致配方奶喂养婴儿NEC发生率升高12,13。人乳中其他已被证实参与NEC保护作用的成分包括人乳低聚糖、L-精氨酸、谷氨酰胺和乳铁蛋白14,15,16,17,18,19。这些有益成分不仅凸显了人乳在预防NEC中的必要性，也强调了深入研究人乳介导保护作用的相关机制、信号通路及细胞效应的重要性。

为了在坏死性小肠结肠炎（NEC）的小鼠模型中进一步研究母乳的保护作用，我们开发了一种新颖且易于使用的技术，可通过电动人体吸乳器从小鼠母鼠（麻醉状态下）提取乳汁11,12。这种获取小鼠乳汁的策略具有优势，不仅因为人体吸乳器易于获取且在乳汁采集方面效率高，还因为该方法可实现物种特异性的乳汁成分分析。因此，我们能够在物种特异性的模型中，比较小鼠乳汁、挤出的人乳以及来自乳库的巴氏消毒人供体乳的效果。该技术有助于研究乳汁中各种成分在预防NEC方面所起的作用。其他研究者也曾开发过乳汁提取方法，但这些技术多为手动操作，通常需要两名或以上实验人员参与20,21,22。本文介绍了一种简便的技术，通过改装人体电动吸乳器即可用于收集小鼠乳汁。该技术也可应用于其他物种。

为了充分研究与坏死性小肠结肠炎（NEC）相关的信号通路，需要建立模型系统，以评估在疾病过程中已知受到影响的所有不同类型细胞。本文讨论其中一种模型系统——肠类器官（enteroids），以及从小鼠和人小肠建立此类模型的方法。特别是人肠道肠类器官（HIEs）具有重要意义，因其提供了一种创新的、遗传多样性丰富的离体（ex vivo）人类模型，有助于研究胃肠道内发生的病理生理过程23。研究发现，肠类器官可实现长期培养，并能冷冻保存以供后续使用23；与由诱导性多能干细胞发育而来的人肠道类器官（HIOs）不同，肠类器官来源于分离出的肠隐窝中的干细胞24。肠类器官所需维护较少，可快速进行感染实验25，且易于建立，因为肠隐窝的分化程度高于HIOs23。因此，HIEs相较于现有技术具有诸多优势，可被培育出具有人类胃肠道上皮区域特异性的组成和功能特性23。当需要一种符合区域特异性限制且操作简便的人类肠道模型时，使用肠类器官是一种极为有效的选择。本文展示了从小鼠和早产人类婴儿中分离并维持来源于原代干细胞的小肠肠类器官的技术方法。

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方案

本研究中的所有动物实验均经圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（方案编号 20160187）或匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（方案编号 14103918）批准。在获得匹兹堡大学机构审查委员会批准（方案编号 PRO14100537）后，根据匹兹堡大学解剖组织获取指南，通过诚信中介系统从匹兹堡大学健康科学组织库获取妊娠不足 24 周的人类胎儿小肠组织。去标识化的人类母乳或巴氏消毒的捐赠母乳经匹兹堡大学机构审查委员会免除知情同意后获取。

1. 从新生小鼠或早产儿小肠中分离隐窝并建立类肠器官

  1. 培养基制备
    注意：培养基应在隐孢子虫分离前一日于超净工作台内配制。
    1. 配制 1.11 L 培养基。取 1 L 含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），加入 110 mL 胎牛血清（FBS）（终浓度 10%）、11 mL 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin）（终浓度 1%）和 1.1 mL 无菌胰岛素（终浓度 0.1%）。
    2. 配制 500 mL PBS-抗生素混合液。取 500 mL 1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）并添加 10% FBS，然后加入 5 mL 庆大霉素（终浓度 1%）、1 mL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）和 5 mL 青霉素-链霉素溶液（终浓度 1%）。
    3. 配制30 mL细胞裂解培养基#1。首先配制30 mL培养基，加入600 µL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度10 mM）、300 µL庆大霉素（终浓度1%）和60 µL两性霉素B（终浓度0.2%）。
    4. 配制30 mL细胞裂解培养基#2。首先配制30 mL培养基，加入300 µL 0.5 M EDTA（终浓度5 mM）、300 µL庆大霉素（终浓度1%）和60 µL两性霉素B（终浓度0.2%）。
    5. 配制50 mL无生长因子的隐孢子虫培养基。量取33.4 mL 1x高级DMEM/F-12培养基，加入10 mL FBS（终浓度20%）。
      1. 加入500 µL 青霉素-链霉素溶液（终浓度1%）、500 µL L-谷氨酰胺（终浓度1%）、500 µL 庆大霉素（终浓度1%）、100 µL 两性霉素B（终浓度0.2%）、2.5 µL 1 M N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）（终浓度0.05 mM）、500 µL 100 mM N-乙酰半胱氨酸（终浓度1 mM）、500 µL 100倍N-2添加剂、1 mL 50倍无血清添加剂（例如，B-27（不含维生素A）以及500 µL 1 mM 100倍Y-27632。
    6. 配制含生长因子的1 mL隐窝培养基。首先配制1 mL不含生长因子的隐窝培养基，然后加入2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a（终浓度100 ng/mL）、1 µL 100 µg/mL Noggin（终浓度100 ng/mL）、2 µL 250 µg/mL R-Spondin（终浓度500 ng/mL）和0.5 µL 100 µg/mL EGF（终浓度50 ng/mL）。
  2. 隐窝分离
    1. 放置溶解的基底膜提取物（参见 材料表在开始前，将样品置于冰上解冻。
      注意：基底膜需保持在冰上，否则会发生聚合。
    2. 根据机构动物护理和使用委员会关于14日龄以上小鼠的实验规程，采用两种安乐死方法处死小鼠，其中第二种方法须为物理性操作，以确保动物死亡。
      注意：对于14日龄以下的小鼠，标准操作是使用剪刀进行断头处死。
    3. 使用剪刀和镊子，沿腹部正中线从皮肤和腹膜纵向切开，贯穿整个腹部长度。用剪刀将小肠从胃部至盲肠处切除，并用镊子去除肠系膜。
      注意：使用两周大的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠幼崽进行隐窝分离，每只体重为 5.5 - 7 g。任何年龄或体型的小鼠均可用于隐窝分离。
    4. 为准备用于隐窝分离的新鲜收获小肠，将小肠平直放置，并用剪刀沿其全长纵向剪开。
      注意：小鼠和人类肠道的制备方法类似。
    5. 用镊子轻轻来回晃动装有PBS-抗生素混合液的培养皿中的肠道，以清除肠内的粪便。
    6. 向50 mL锥形管中加入30 mL细胞裂解缓冲液#1。将肠道直接切成0.5 cm长的小段放入管中。将管子置于冰桶中，在摇床上以最低速度轻轻振荡15分钟。
    7. 当组织在摇床上处理时，若类肠体将用于RNA、DNA或蛋白质提取，则准备24孔或48孔板用于培养隐窝；若类肠体将用于整体封片共聚焦成像，则使用8孔腔室载玻片培养隐窝。
    8. 在通风橱中，向24孔或48孔板的每个孔底部加入15 µL基底膜；若使用腔室载玻片，则向每个腔室底部加入9 µL基底膜。
      注意：可根据培养板的大小调整基底膜的体积。
    9. 用移液枪头迅速将基底膜铺开，使其在孔底部形成一层薄层。将培养板置于37 °C培养箱中孵育30分钟，使基底膜聚合。
      注意：如果基底膜不是一层薄层，或基底膜中含有气泡，则隐窝将无法附着。
    10. 在摇床上振荡15分钟后，通过100 µm滤网过滤组织，弃去滤过液。
    11. 向一个新的50 mL离心管中加入30 mL细胞裂解缓冲液#2。从滤网中取出组织并加入该离心管中。
    12. 将试管置于装有冰的容器中，在摇床最低转速下轻轻振荡15分钟。
    13. 振荡15分钟后，用100 µm滤网过滤组织。此步骤保留滤过液，以防后续步骤中得率较低。
      注意：所有流穿管必须保持在冰上。
    14. 加入15 mL含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的DMEM至新的50 mL锥形管中。取出滤网中的组织并加入该管。用手剧烈振荡10秒。经100 µm滤网过滤，收集滤过液。重复此步骤直至滤过液中无可见颗粒。
    15. 在通风橱中，使用70 µm滤网（小鼠组织）或100 µm滤网（人类组织）将上一步的流穿液过滤至新的50 mL锥形管中。
      注意：备用额外的滤网，并缓慢倾倒，因为滤网会被碎屑堵塞。
    16. 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 8 分钟，然后立即将离心管放入生物安全柜中的冰桶内。用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。用所需总量的不含生长因子的 Crypt 培养基重悬沉淀。
      注意：富集的隐窝为沉淀物中的“沙状”层。每孔需要 250 µL 无生长因子的隐窝培养基。
  3. 类器官的建立
    1. 将隐窝培养基混合物直接接种于基底膜上。
    2. 在显微镜下检查隐窝以确认分离过程成功。
      注意：需要获得细胞及细胞球。每孔接种约100个单个隐窝。
    3. 在37 °C孵育平板3小时，使隐窝贴附于基底膜。
      注意：此孵育步骤使用不含生长因子的 Crypt 培养基。
    4. 使用 P-200 移液器缓慢吸除培养基以及未成功贴壁的过量隐窝。
      注意：不要扰动基底膜，以免附着的隐窝脱落。
    5. 向每个孔中缓慢加入 250 µL 含生长因子的隐孢子虫培养基。
      注意：对于24孔板、48孔板或腔室载玻片，加入250 µL含生长因子的隐孢子培养基即可。
    6. 每2天更换一次新鲜的含生长因子的Crypt Culture培养基，在处理前持续培养5天，以促进细胞的最佳贴壁与生长。

2. 小鼠乳汁采集

  1. 在产后7至12天，将C57BL/6J哺乳期母鼠与其仔鼠分离，分离6小时后再进行挤奶。
  2. 通过鼻罩使用异氟烷对哺乳期母鼠进行麻醉，并皮下注射0.15 IU/kg体重剂量的催产素。等待3分钟后，再开始挤奶操作。
  3. 挤奶前用70%乙醇清洁乳头，并使其自然干燥。
  4. 使用电动人用吸乳器，配合适合小鼠乳头尺寸的硅胶管，逐个乳头采集乳汁，收集至5 mL离心管中。
    注意：理想的吸乳器应具备两个独立调节功能，分别控制吸力速度和负压强度。建议初始时将两项参数均设为最低档，随后缓慢逐步增加，直至开始获取乳汁。理想情况下，每只哺乳期母鼠可获得约500 µL至1 mL的小鼠乳汁。
  5. 立即对乳汁进行分装，并于-80 °C保存。
    注意：避免反复冻融。
  6. 在第5天，向每毫升含生长因子的隐窝培养基中加入50 µL/mL小鼠乳汁，处理类肠器官，于37 °C孵育24小时。

3. 类肠道器官的全 mount 染色

  1. 试剂准备
    1. 每 8 个孔准备 16 mL 1× PBS。
    2. 每 8 个孔准备 2 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS。
    3. 每 8 个孔准备 2 mL 含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS。
    4. 每 8 个孔准备 24 mL PBST（PBST 为含 0.1% Tween 20 的 1× PBS）。
    5. 每 8 个孔准备 2 mL 含 10% 正常驴血清（NDS）的 0.1% PBST（即 10% NDS/PBST）。
    6. 每 8 个孔准备 4 mL 含 1% NDS 的 0.1% PBST（即 1% NDS/PBST）。
  2. 染色第 1 天
    1. 吸除处理液，用 PBS 清洗类肠器官。每孔加入 250 µL 4% PFA，于 4 °C 在旋转仪上孵育 1–2 小时。用移液器吸除 4% PFA。
    2. 每孔加入 250 µL 1× PBS，洗涤 4 次，每次在室温（RT）下于旋转仪上放置 10 分钟。
      注意：如有需要，可将培养板在 4 °C 保存 1–2 天。
    3. 每孔加入 250 µL 0.1% Triton X-100，于室温孵育 1 小时。用移液器吸除 0.1% Triton X-100。
    4. 每孔加入 250 µL 1× PBS，洗涤 4 次，每次在室温下于旋转仪上放置 15 分钟。
    5. 每孔加入 250 µL 10% NDS/PBST，于室温孵育 45 分钟。用移液器吸除 10% NDS/PBST。
    6. 每孔加入 250 µL 一抗溶液（用 1% NDS/PBST 按 1/250 比例稀释），于 4 °C 孵育过夜。
      注意：最佳抗体稀释比例因生产商而异。
  3. 染色第 2 天
    1. 每孔加入 250 µL PBST，于 4 °C 在旋转仪上每次孵育 10 分钟，共洗涤至少 5 次，总时长 4–5 小时。
    2. 每孔加入 250 µL 二抗溶液（用 1% NDS/PBST 按 1/1,000 比例稀释），用铝箔包裹培养板，于 4 °C 孵育过夜。
  4. 染色第 3 天
    1. 每孔加入 250 µL 核染料 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），避光孵育 15 分钟。
      注意：实验过程中需始终将培养板避光保存。
    2. 每孔加入 250 µL PBST，洗涤 6 次，每次在 4 °C 于旋转仪上放置 10 分钟。
    3. 使用封片剂将盖玻片封固于腔室载玻片上。
    4. 使用 40X 物镜的共聚焦显微镜采集图像，并在光栅图形编辑软件中进行统一处理（参见材料表）。

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结果

我们首先试图探究表达的人类母乳或巴氏消毒的捐赠母乳是否对小肠类器官产生影响。事实上，人类母乳和捐赠母乳均促进了新生小鼠（图1A）和早产儿来源类器官的生长（图1B）。

由于人乳可促进小肠类器官的生长，我们进一步探究了人乳是否对早产人源类器官的增殖具有影响。结果表明，与对照组相比，人乳能够促进早产人源类器官的增殖（图2A-B，Ki67，红色染色）。重要的是，与对照组相比，人源供体乳也能促进类器官的增殖，但其促进作用略低于未经巴氏消毒的人乳（图2B-C）。随后，我们检测了早产人源类器官中K...

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讨论

肠上皮由多种细胞亚型组成，这些细胞亚型负责抵御病原体、维持肠道屏障完整性，并在多种疾病的发病机制中可能受到破坏。尽管动物模型能够模拟疾病的某些方面，但来源于小鼠和人类小肠的类肠体（enteroid）ex vivo 模型为测试不同干预措施的效果提供了一个有效平台。该类肠体模型的意义在于，研究人员能够将来自正常或患病动物及人类的肠道干细胞培养并分化为所有上皮细胞亚型，而这是现有方法所无法实现的。该模型系统可用于研究某些难以在小鼠中直接模拟的人类病原体感染，例如肠道病毒25 或诺如病毒26 等。类肠体模型具有多项优势和应用前景；然而，必须注意确保培养基制备过程中所用试剂以及维持类肠体存活所必需的特定外源性生长因子的一致性。

在类肠器官模型中，多个步骤对于成功生成类肠器官至关重要。为尽量缩短冷缺血时间，应尽快处理组织。若将组织置于4 °C的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）培养基中，可在组织取材后24小时内进行类肠器官的制备，这为必要时的运输或邮寄提供了便利。在建立类肠器官时，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

MG 获得美国国立卫生研究院资助项目 K08DK101608 和 R03DK111473、March of Dimes 基金会资助项目编号 5-FY17-79、华盛顿大学与圣路易斯儿童医院儿童发现研究所以及圣路易斯华盛顿大学医学院儿科系的支持。CJL 获得 R01DK104946（项目负责人：Silverman）、华盛顿大学与圣路易斯儿童医院儿童发现研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Lonza12-604F
胎牛血清（FBS）Gibco26140-079
青霉素-链霉素Gibco15140-122
Humulin N（胰岛素）Eli Lilly And Company0002-8315
1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）Sigma-AldrichD8537
庆大霉素Gibco15750-060
两性霉素BGibco15290-026
0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0Invitrogen15575-020
1×高级DMEM/F-12培养基Invitrogen12634-028
200 mM L-谷氨酰胺Gibco25030-081
1 M N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）Sigma-AldrichH3537
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165
100× N-2补充剂Gibco17502-048
50× B-27补充剂（不含维生素A）Gibco08-0085SA
100× ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐Sigma-AldrichY0503
重组小鼠Wnt3a蛋白R&D Systems1324-WN
小鼠Noggin蛋白PeproTech250-38
重组小鼠R-Spondin 1蛋白R&D Systems3474-RS
重组小鼠表皮生长因子（EGF）PeproTech315-09
生长因子减少型Matrigel基底膜基质Corning356231
35 × 10 mm细胞培养培养皿Eppendorf0030700112
24孔细胞培养板Eppendorf0030722116
48孔细胞培养板Eppendorf0030723112
8孔Nunc Lab-Tek II腔室载玻片系统Thermo Scientific154534
50 mL锥形管Corning352070
100 μM无菌细胞滤网Fisher Scientific22-363-549
70 μM无菌细胞滤网Fisher Scientific22-363-548
1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2Invitrogen20012-027
16%多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Sciences15710
吐温X-100Sigma-AldrichT8787
吐温20Sigma-AldrichP1379
正常驴血清（NDS）Sigma-AldrichD9663
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）InvitrogenD1306
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-544-D
Leica TCS SP8 X共聚焦显微镜Leica MicrosystemsN/A
Photoshop CS6Adobe SystemsN/A
18 G 1.5英寸针头Becton Dickinson305196
异氟烷Sigma-Aldrich792632
催产素Sigma-AldrichO3251
人用双侧电动吸奶器Lansinoh044677530163
5 mL圆底试管Corning352058
橡胶塞Frey Scientific560761
Ki67抗体AbcamAB15580
人Mki67引物 F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated DNA TechnologiesN/A

参考文献

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