手性氨基醇是有机合成中可用作骨架的多功能分子。以L-赖氨酸为起始原料，我们通过酶级联反应合成氨基醇：该反应首先由双加氧酶催化实现非对映选择性的C-H氧化，随后由脱羧酶裂解相应羟基氨基酸的羧酸部分。
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摘要
摘要
氨基醇是一类用途广泛的化合物，具有多种应用。例如，它们已被用作有机合成中的手性骨架。通过传统有机化学方法合成氨基醇通常需要繁琐的多步反应过程，且难以控制其立体化学结果。本文介绍一种利用易得的L-赖氨酸为起始原料，通过酶促方法在48小时内合成氨基醇的实验方案。该方案结合了两个传统有机合成中极难实现的化学反应。第一步由双加氧酶催化赖氨酸侧链上未活化C-H键的区域和非对映选择性氧化；第二步由具有区域选择性差异的双加氧酶进一步催化，生成1,2-二醇。最后一步通过磷酸吡哆醛（PLP）依赖的脱羧酶（DC）切除α-氨基酸的羧基。该脱羧反应仅作用于氨基酸的α-碳，从而保留了位于β/γ位的羟基取代手性中心，因此所得氨基醇具有较高的光学纯度。该方法已成功应用于四种氨基醇的半制备规模合成。反应进程通过高效液相色谱法（HPLC）进行监测，样品经1-氟-2,4-二硝基苯衍生产生信号。通过固相萃取（SPE）进行简单纯化后，氨基醇的收率优异（93%至>95%）。
引言
尽管生物催化具有诸多优势，但将生物催化步骤整合到合成路线或完全生物催化路线中，目前仍主要局限于酶促动力学拆分。这类方法在不对称化学-酶法合成中常被用作初始步骤，但生物催化在官能团转化方面还具有更多潜力，可实现高立体选择性的转化1,2,3。此外，由于生物催化反应通常在相似条件下进行，因此有可能在同一个反应容器中实现级联反应4,5。
手性氨基醇是有机合成中常用的助剂或骨架分子6。氨基醇结构单元常见于次级代谢产物和活性药物成分（API）中。通过传统的化学合成方法，可由相应的α-氨基酸 readily 获得伯β-氨基醇，但获取手性γ-氨基醇或仲氨基醇通常需要繁琐的合成路线，并且对立体化学的控制要求较高7,8,9,10。由于生物催化具有高度的立体选择性，因此可能为这些手性构建单元的合成....
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方案
1. 酶的制备
- 如前所述表达并纯化蛋白质26。
注意：重组蛋白的最终浓度如下：来自Catenulispora acidiphila的αKAO，UniProtKB编号：C7QJ42（KDO1），1.35 mg/mL；来自C. pinensis的αKAO，UniProtKB编号：C7PLM6（KDO2），2.29 mg/mL；来自S. rumirantium的PLP-DCs，UniProtKB编号：O50657（LDCSrum），无细胞提取物中总酶浓度为12.44 mg/mL；来自C. pinensis的PLP-DC，UniProtKB编号：C7PLM7（DCCpin），2.62 mg/mL。
2. 溶液的配制
注意：以下所有溶液均使用去离子水配制。
- 配制1 M HEPES缓冲液，pH 7.5；用5 M NaOH调节pH。
注意：在调节pH的过程中，需佩戴防护手套、防护服、眼部保护装置和面部保护装置（P280）。若接触眼睛（P305、P351、P338），应小心用水冲洗数分钟。如可能，摘除隐形眼镜，并持续冲洗，立即联系中毒控制中心或医生（P310）。P代码指预防措施说明（危险....
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结果
我们此前已报道过通过铁(II)/αKAO家族双加氧酶催化的非对映选择性酶促羟基化反应合成单羟基-L-赖氨酸和二羟基-L-赖氨酸的方法（图1）16。为了优化本文所展示的整个级联反应方案（该方案包含由αKAO催化的一步或两步羟基化反应，随后是由PLP-DC催化的脱羧反应），我们调整了反应条件，以同时满足两种酶促反应的需求。我们首先研究了两种脱羧酶LDCSrum和DCCpin对市售的(5R)-羟基-L-赖氨酸的催化活性。随后，我们将这两种脱羧酶与相应的αKAO催化的氧化步骤组成级联反应，检测其对单羟基衍生物3-羟基-L-赖氨酸（1）和4-羟基-L-赖氨酸（2）的脱羧活性。表1列出了单羟基-L-赖氨酸生物催化脱羧反应的结果。通过DNFB对反应混合物进行衍生化，生成相应的DNB标记底物和产物，再经HPLC测定转化率.......
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讨论
手性氨基醇及其衍生物具有广泛的应用，从有机合成中的手性助剂到药物治疗均有涉及。传统有机合成中制备氨基醇的多步合成方法众多，但由于繁琐的保护/脱保护步骤以及对立体化学控制的敏感性，这些方法并不总是高效16。而生物催化方法无需保护/脱保护步骤，且通常具有高度的立体选择性，因此是一种理想的替代途径。
先前的研究报道了通过动态动力学不对称转化（DYKAT）方法合成多种具有2-苯乙胺骨架的β-氨基醇。在此路线中，由苏氨酸醛缩酶催化苯甲醛及其衍生物的羟醛缩合反应，引入羟基取代的手性中心。该第一步反应的非对映选择性较低且收率中等，但随后通过L-酪氨酸脱羧酶（L-tyrosine DC）催化的立体专一性脱羧反应得以克服，从而得到对映体富集的芳香族β-氨基醇11,12。
本文报道了一种以易得的L-赖氨酸为起始原料，直接合成多种氨基醇的简便方法。尽管该方法效率较高，但由于αKAO和P.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Véronique de Berardinis 的有益讨论，以及 Alain Perret、Christine Pellé 和 Peggy Sirvain 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-赖氨酸盐酸盐 | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-羟基-L-赖氨酸 | Sigma Aldrich | GPS NONH | 外包 |
| α-酮戊二酸 | Sigma Aldrich | 75892 | |
| 抗坏血酸钠 | Sigma Aldrich | A7631 | |
| 硫酸亚铁铵六水合物 | Acros | 201370250 | |
| 磷酸吡哆醛（PLP） | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-二巯基丁烷-1,2-二醇（DTT） | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB） | Sigma Aldrich | D1529 | |
| 乙醇 | VWR | 20825.290 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| 乙腈 HiPerSolv CHROMANORM 用于 LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-三氟乙酸 | VWR | 153112E | |
| 氨水 28% | VWR | 21182.294 | |
| 甲醇 HiPerSolv CHROMANORM 用于 LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| 甲酸 | Acros | 270480010 | |
| 磷酸 85% | Acros | 201145000 | |
| 重水 | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC 色谱柱 | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC 系统 | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA 检测器 | ThermoFisher Scientific | ||
| 一次性 4 mm 注射器滤器 - 0.22µm - PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| 带毫升刻度、鲁尔接头的一次性结核菌素注射器 | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| 阳离子交换树脂 100-200 目 | Sigma Aldrich | 217506 | |
| 混合模式阳离子交换固相萃取小柱 6 mL | Waters | 186000776 | |
| 固相萃取装置 | Waters | WAT200609 | |
| 旋转蒸发仪 | Büchi | 531-0103 | |
| 冷冻干燥机 alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| 微量移液器 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| 微量移液器 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| 微量移液器 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| 微量移液器 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz 核磁共振波谱仪 | Bruker | ||
| 2 mL 微量离心管 | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL 圆锥底离心管 | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL 圆底烧瓶 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL 圆底烧瓶 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL 圆底烧瓶 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL 锥形瓶 | Fischerbrand | 15496143 |
参考文献
- Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc....
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重印与许可
