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方法文章

利用酶级联反应由L-赖氨酸合成手性氨基醇

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DOI：

10.3791/56926

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2018年2月16日

 ,  , 
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

本文内容

摘要

手性氨基醇是有机合成中可用作骨架的多功能分子。以L-赖氨酸为起始原料，我们通过酶级联反应合成氨基醇：该反应首先由双加氧酶催化实现非对映选择性的C-H氧化，随后由脱羧酶裂解相应羟基氨基酸的羧酸部分。

摘要

氨基醇是一类用途广泛的化合物，具有多种应用。例如，它们已被用作有机合成中的手性骨架。通过传统有机化学方法合成氨基醇通常需要繁琐的多步反应过程，且难以控制其立体化学结果。本文介绍一种利用易得的L-赖氨酸为起始原料，通过酶促方法在48小时内合成氨基醇的实验方案。该方案结合了两个传统有机合成中极难实现的化学反应。第一步由双加氧酶催化赖氨酸侧链上未活化C-H键的区域和非对映选择性氧化；第二步由具有区域选择性差异的双加氧酶进一步催化，生成1,2-二醇。最后一步通过磷酸吡哆醛（PLP）依赖的脱羧酶（DC）切除α-氨基酸的羧基。该脱羧反应仅作用于氨基酸的α-碳，从而保留了位于β/γ位的羟基取代手性中心，因此所得氨基醇具有较高的光学纯度。该方法已成功应用于四种氨基醇的半制备规模合成。反应进程通过高效液相色谱法（HPLC）进行监测，样品经1-氟-2,4-二硝基苯衍生产生信号。通过固相萃取（SPE）进行简单纯化后，氨基醇的收率优异（93%至>95%）。

引言

尽管生物催化具有诸多优势，但将生物催化步骤整合到合成路线或完全生物催化路线中，目前仍主要局限于酶促动力学拆分。这类方法在不对称化学-酶法合成中常被用作初始步骤，但生物催化在官能团转化方面还具有更多潜力，可实现高立体选择性的转化1,2,3。此外，由于生物催化反应通常在相似条件下进行，因此有可能在同一个反应容器中实现级联反应4,5。

手性氨基醇是有机合成中常用的助剂或骨架分子6。氨基醇结构单元常见于次级代谢产物和活性药物成分（API）中。通过传统的化学合成方法，可由相应的α-氨基酸 readily 获得伯β-氨基醇，但获取手性γ-氨基醇或仲氨基醇通常需要繁琐的合成路线，并且对立体化学的控制要求较高7,8,9,10。由于生物催化具有高度的立体选择性，因此可能为这些手性构建单元的合成提供更优的途径11,12,13,14。

我们此前报道了通过亚铁/α-酮酸依赖性加氧酶家族（αKAO）的双加氧酶催化的非对映选择性酶促羟基化反应，合成单羟基和二羟基-L-赖氨酸的方法（图1）15。具体而言，以L-赖氨酸为起始底物时，KDO1双加氧酶催化生成(3S)-羟基衍生物（1），而(4R)-羟基衍生物（2）则由KDO2双加氧酶催化生成。KDO1与KDO2依次进行区域选择性不同的羟基化反应，可生成光学纯的(3R,4R)-二羟基-L-赖氨酸（3）。然而，这些酶的底物范围有限，限制了其在化学合成中的广泛应用，尤其是在简单胺类化合物的羟基化反应中，由于酶活性依赖于氨基α位必须含有羧酸基团16。

含酶KDO1、KDO2的化学转化图；氨基酸反应产率显示为100%。
图1：L-赖氨酸的生物催化转化。 在KDO1双加氧酶催化下转化为(3S)-羟基-L-赖氨酸（1）；在KDO2双加氧酶催化下转化为(4R)-羟基-L-赖氨酸（2）；以及通过KDO1和KDO2双加氧酶依次催化的级联反应生成(3R,4R)-二羟基-L-赖氨酸（3）。请点击此处查看此图的放大版本。

脱羧是代谢中常见的反应17特别是，氨基酸脱羧酶（EC 4.1.1）是一类无辅因子（丙酮酰依赖性）或依赖磷酸吡哆醛（PLP）的酶，可在细菌和高等生物中催化氨基酸脱羧生成相应的多胺18,19,20,21,22单羟基和二羟基化合物（图3) 4-7, 10-11 对应于腐胺的羟基化产物，腐胺是由L-赖氨酸脱羧生成的二胺。腐胺是化学工业中的重要构建单元，特别是聚酰胺和聚氨酯聚合物的组分。因此，利用可再生资源通过生物法生产该二胺，作为石油基路线的替代方案已受到广泛关注，多种微生物已被用于该目的的改造。在这些代谢途径中，赖氨酸脱羧酶（LDC）是关键酶。LDC是一种依赖磷酸吡哆醛（PLP）的酶，属于丙氨酸消旋酶（AR）结构家族。23已知依赖磷酸吡哆醛（PLP）的脱羧酶（PLP-DCs）具有高度底物特异性。然而，少数酶具备一定程度的底物宽泛性，可同时对L-鸟氨酸和L-赖氨酸两种氨基酸表现出活性，例如来自 Selenomonas rumirantium （LDCSrum），对赖氨酸和鸟氨酸脱羧具有相似的动力学常数24,25这种扩展的底物特异性使该酶成为单羟基和二羟基-L-赖氨酸脱羧反应的良好候选酶。此外，为了寻找对赖氨酸羟基衍生物具有活性的脱羧酶（DCs），我们分析了编码αKAO酶基因的基因组上下文。事实上，在原核生物基因组中，参与同一生物合成途径的酶编码基因通常共定位于基因簇中。KDO2（来自 Chitinophaga pinensis) 基因被发现与编码假定的PLP-DC的基因共定位图2）。相比之下，在分析KDO1双加氧酶的基因组背景时，未发现编码DC的基因。来自PLP-DC蛋白的 C. pinensis （直流Cpin因此被选为催化级联反应脱羧步骤的有前景候选物。

Chitinophaga pinensis 基因图谱、蛋白质功能注释、代谢通路分析。
图 2：C. pinensis 中 KDO2 基因的基因组上下文。 请点击此处查看该图的放大版本。

因此，我们设计了涉及双加氧酶和脱羧酶（DCs）的酶级联反应，以实现从氨基酸合成脂肪族手性β-和γ-氨基醇（图3）。如先前报道，αKAO催化的C-H氧化反应以完全非对映选择性引入羟基取代的手性中心；而Cβ/γ手性将在脱羧步骤中得以保留，该步骤仅影响氨基酸部分的Cα碳16。

化学反应途径，脱羧反应，羟基化，L-赖氨酸合成，分子结构图。
图3：逆合成分析。（A）由(5R)-羟基-L-赖氨酸逆合成(β-和γ-氨基醇类化合物：(R)-1,5-二氨基戊-2-醇（4）；以及由L-赖氨酸逆合成(S)-1,5-二氨基戊-2-醇（5）和1,5-二氨基戊-3-醇（6）。（B）从(5R)-羟基-L-赖氨酸出发逆合成β,γ-和β,δ-氨基二醇类化合物：(2S,3S)-1,5-二氨基戊烷-2,3-二醇（10）和(2R,4S)-1,5-二氨基戊烷-2,4-二醇（11）；以及从L-赖氨酸出发逆合成(2R,3R)-1,5-二氨基戊烷-2,3-二醇（7）。请点击此处查看该图的放大版本。

从L-赖氨酸及其(5R)-羟基衍生物，本文报道了一种两步/三步一锅法的酶促反应流程，结合双加氧酶和PLP依赖型脱羧酶，以获得目标氨基醇。在进行实验室规模的目标分子合成之前，该方法首先在分析级规模上进行开发，以优化反应条件。 例如，酶的浓度需足以实现起始原料的完全转化；我们也展示了该操作步骤。

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方案

1. 酶的制备

  1. 如前所述表达并纯化蛋白质26。
    注意：重组蛋白的最终浓度如下：来自Catenulispora acidiphila的αKAO，UniProtKB编号：C7QJ42（KDO1），1.35 mg/mL；来自C. pinensis的αKAO，UniProtKB编号：C7PLM6（KDO2），2.29 mg/mL；来自S. rumirantium的PLP-DCs，UniProtKB编号：O50657（LDCSrum），无细胞提取物中总酶浓度为12.44 mg/mL；来自C. pinensis的PLP-DC，UniProtKB编号：C7PLM7（DCCpin），2.62 mg/mL。

2. 溶液的配制

注意：以下所有溶液均使用去离子水配制。

  1. 配制1 M HEPES缓冲液，pH 7.5；用5 M NaOH调节pH。
    注意：在调节pH的过程中，需佩戴防护手套、防护服、眼部保护装置和面部保护装置（P280）。若接触眼睛（P305、P351、P338），应小心用水冲洗数分钟。如可能，摘除隐形眼镜，并持续冲洗，立即联系中毒控制中心或医生（P310）。P代码指预防措施说明（危险类别和分类；参见，例如，pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/）。
  2. 配制100 mM L-赖氨酸、100 mM (5S)-羟基-L-赖氨酸、150 mM α-酮戊二酸、100 mM 抗坏血酸钠、10 mM 硫酸亚铁铵六水合物（莫尔盐）、100 mM 5'-磷酸吡哆醛（PLP）和100 mM 二硫苏糖醇（DTT）。
  3. 用37% HCl溶液（约12 M）配制1 M、2 M和6 M盐酸（HCl）溶液，操作时遵循与2.1中所述相同的安全规程。
    注意：α-酮戊二酸、抗坏血酸钠和硫酸亚铁铵六水合物溶液必须在使用当天新鲜配制。赖氨酸溶液可在室温下保存数月。PLP溶液可在4 °C保存一个月。DTT溶液可在-20 °C保存一个月。

3. 分析规模反应

  1. (5R)-羟基-L-赖氨酸脱羧反应的方法开发
    1. 向一个2 mL微量离心管中加入11 µL pH 7.5的1 M HEPES缓冲液（终浓度50 mM）。然后加入22 µL 100 mM的(5S)-羟基-L-赖氨酸（终浓度10 mM）、2.2 µL 100 mM的PLP（终浓度1 mM）和2.2 µL 100 mM的DTT（终浓度1 mM）。
      注意：若反应使用LDCSrum，则无需添加DTT。
    2. 加入纯化的PLP-DC（终浓度0.1 mg/mL），并用H2O补足至终体积220 µL。
    3. 将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应3小时，管盖打开并暴露于空气中。
      注意：在开放空气中敞口振荡可确保反应体系充分氧合，因此无需向反应体系中通入氧气。
    4. 取10 µL反应混合物，按照第6步所述的反应监测程序进行分析。建议在取样后立即进行衍生化处理并直接分析。
  2. 结合αKAO催化的羟基化步骤与PLP-DC催化的脱羧步骤的酶级联反应方法开发
    1. 向一个2 mL微量离心管中加入11 µL 1 M HEPES缓冲液（pH 7.5，终浓度50 mM）。然后加入22 µL 150 mM的α-酮戊二酸（终浓度15 mM）、5.5 µL 100 mM的抗坏血酸钠（终浓度2.5 mM）、22 µL 10 mM的莫尔盐（终浓度1 mM）以及22 µL 100 mM的L-赖氨酸（终浓度10 mM）。
    2. 根据第3.2.3步中待加入的酶溶液体积，用H2O补足至终体积220 µL。
    3. 根据目标区域选择性加入所需的纯化αKAO酶：KDO1用于L-赖氨酸C-3位的羟基化，KDO2用于C-4位的羟基化。纯化酶的终浓度（0.05–0.5 mg/mL）经确定可在约3小时内实现完全转化。
    4. 将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应3小时，管盖打开并暴露于空气中。
    5. 加入2.2 µL 100 mM的PLP（终浓度约1 mM）和2.2 µL 100 mM的DTT（终浓度约1 mM）。
      注意：若反应使用LDCSrum，则无需添加DTT。
    6. 加入纯化的PLP-DC，其浓度应确保在18小时内完成完全转化：在与KDO1联用的级联反应中，LDCSrum的终浓度约为0.1 mg/mL；在与KDO2联用的级联反应中，DCCpin的终浓度约为0.5 mg/mL。
    7. 将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应18小时，管盖打开并暴露于空气中。
    8. 按照第3.1.4步的方法进行反应监测。
  3. 结合两种αKAO催化的连续羟基化步骤与PLP-DC催化的脱羧步骤的酶级联反应方法开发
    1. 执行第3.2.1–3.2.2步。
    2. 加入KDO1，使其终浓度为0.05 mg/mL。将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应3小时，管盖打开并暴露于空气中。
    3. 加入KDO2，其终浓度约为0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应18小时，管盖打开并暴露于空气中。
    4. 执行第3.2.5步。
    5. 加入纯化的PLP-DC（DCCpin），其终浓度约为0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。将反应混合物在室温下以300 rpm振荡反应18小时，管盖打开并暴露于空气中。
    6. 按照第3.1.4步的方法进行反应监测。

4. 半制备型一锅法生物催化反应

注意：酶促反应在250 mL敞口玻璃锥形瓶中进行，反应体系总体积为10 mL，底物为0.1 mmol的L-赖氨酸。

  1. 单羟基化衍生物的合成
    1. 向烧瓶中加入 0.5 mL 1 M HEPES 缓冲液（pH 7.5，终浓度 50 mM）。然后加入 1 mL 100 mM L-赖氨酸（终浓度 10 mM）、1 mL 150 mM α-酮戊二酸（终浓度 15 mM）、0.25 mL 100 mM 抗坏血酸钠（终浓度 2.5 mM）以及 1 mL 10 mM 摩尔盐（终浓度 1 mM）。
    2. 用 H2O 定容至终体积 10 mL，需考虑步骤 4.1.3 中将要加入的酶溶液的体积。
    3. 根据目标区域选择性加入所需纯化的 αKAO 酶：若需在 L-赖氨酸的 C-3 位发生羟基化，则加入终浓度为 0.075 mg/mL 的 KDO1；若需在 C-4 位发生羟基化，则加入终浓度为 0.5 mg/mL 的 KDO2。纯化酶的终浓度已确定为可在约 3 小时内实现完全转化。
    4. 将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡适当时间。当反应监测表明羟基化反应已完成（执行步骤 6 中详述的所有步骤以进行反应监测），则进入步骤 4.1.5。典型反应时间为 3 小时。
    5. 向 αKAO 反应混合物中加入 100 µL 100 mM PLP（终浓度约 1 mM）。然后加入 100 µL 100 mM DTT（终浓度约 1 mM），但使用 LDCSrum 时除外。
    6. 加入纯化的 PLP-DC 酶：若与 KDO1 进行级联反应，则加入终浓度约为 0.05 mg/mL 的 LDCSrum；若与 KDO2 进行级联反应，则加入终浓度约为 0.5 mg/mL 的 DCCpin。
    7. 将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡 18 小时，随后直接进入步骤 4.3 中详述的操作。
  2. 二羟基化衍生物的合成
    1. 加入 0.5 mL 1 M HEPES 缓冲液（pH 7.5，终浓度 50 mM）、1 mL 100 mM L-赖氨酸（终浓度 10 mM）、1 mL 150 mM α-酮戊二酸（终浓度 15 mM）、0.25 mL 100 mM 抗坏血酸钠（终浓度 2.5 mM）以及 1 mL 10 mM 摩尔盐（终浓度 1 mM）。用 H2O 定容至终体积 10 mL，需考虑步骤 4.2.2 中将要加入的酶溶液的体积。
    2. 加入 KDO1 至终浓度 0.075 mg/mL。将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡适当时间。
    3. 当反应监测表明羟基化反应已完成（参见步骤 6 中的反应监测方案），则进入步骤 4.2.5。典型反应时间为 3 小时。
    4. 加入 1 mL 150 mM α-酮戊二酸（终浓度 15 mM）、0.25 mL 100 mM 抗坏血酸钠（终浓度 2.5 mM）以及 1 mL 10 mM 摩尔盐（终浓度 1 mM）。
    5. 加入 KDO2 至终浓度约 0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡 18 小时。
    6. 当反应监测表明二羟基化反应已完成（参见步骤 6 中的反应监测方案），则进入步骤 4.2.7。典型反应时间为 18 小时。
    7. 加入 100 µL 100 mM DTT（终浓度约 1 mM），但使用 LDCSrum 时除外。
    8. 加入纯化的 DCCpin 至终浓度约 0.5 mg/mL（按初始反应体积计算）。
    9. 将反应混合物在室温下以 300 rpm 振荡 18 小时。
  3. 反应终止
    1. 将 250 mL 玻璃锥形烧瓶置于冰浴中，使反应混合物冷却。
    2. 在约 1 分钟内小心地滴加 0.25 mL 6 M HCl，同时手动轻轻摇动冷却的反应混合物。遵循与步骤 2.1 中所述相同的安全操作规程。
    3. 使用带有橡胶头的玻璃巴斯德吸管将酸性混合物转移至 50 mL 圆锥底离心管中，随后在 1,680 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。
    4. 吸出上清液，并暂存于 250 mL 圆底烧瓶中。
    5. 向含有沉淀的圆锥底离心管中加入 10 mL 去离子水，涡旋振荡以重新悬浮沉淀。
    6. 在 1,680 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟。
    7. 吸出上清液，并将其加入至含有第一次上清液（步骤 4.3.4）的 250 mL 圆底烧瓶中。
    8. 通过将烧瓶浸入液氮中并持续手动旋转使其快速冷冻，随后立即将烧瓶转移至台式多歧管冷冻干燥仪中，防止样品解冻。
    9. 冷冻干燥过程完成后（过夜），从冷冻干燥仪中取出烧瓶。

5. 从粗酶反应混合物中纯化氨基醇

  1. 离子交换树脂
    1. 将冻干物溶于最小量的0.1 M盐酸水溶液（约4 mL）中，直至肉眼不可见固体颗粒。
    2. 在玻璃柱（20 × 250 mm）中装填磺酸基功能团阳离子交换树脂（200–400目），于常压下依次用1 M HCl（4个柱体积）和0.1 M HCl（4个柱体积；柱体积 = 10 mL）进行淋洗平衡。
    3. 使用1,000 µL移液器，将样品小心地加至玻璃柱内树脂上层的柱壁处。随后，用1 mL 0.1 M盐酸水溶液分三次冲洗盛有粗产物的锥底离心管，每次洗涤后将洗涤液以相同方式加载到柱上。
    4. 用非线性梯度洗脱：4 柱体积的 0.1 M HCl，4 柱体积的水，4 柱体积的 5% NH₄OH4OH，10% NH₄Cl 溶液，4 个柱体积4OH，15% NH₄，4个柱体积4OH，20% NH₄Cl 溶液，4 个柱体积4OH，4 个柱体积的 25% NH₄OH4OH，最后用4个柱体积的28% NH₄OH4OH
    5. 通过HPLC监测纯化过程（参见步骤6）。
    6. 合并含有该化合物的组分（NH4OH 20-28%）并按照步骤 4.3.8–4.3.9 所述进行冻干。
      注意：离子交换柱在用去离子水洗脱至洗脱液呈中性（约50 mL）后，可再用50 mL 1 M HCl洗脱重新平衡，从而重复使用。
  2. 固相萃取
    1. 将冻干化合物溶于约 2 mL 的 H3PO4/水（20 µL/mL）
    2. 将一个6 mL混合模式阳离子交换固相萃取柱置于连接真空泵的萃取装置上。通过装置提供的负压，用4 mL甲醇冲洗萃取柱进行活化。随后在负压条件下用4 mL H3PO4/水（20 µL/mL）。
    3. 使用1,000 µL移液器将样品加至玻璃柱壁上的树脂顶端，并用0.75 mL H₂O分三次冲洗盛有产物的小瓶3PO4每次洗涤加入20 µL/mL水。以相同方式将所得洗涤液体积上样至柱中。
    4. 用真空 manifold 提供的减压条件洗涤柱芯：先用 4 mL 含 2% HCOOH 的水溶液淋洗，再用 4 mL 水淋洗。随后用 NH 的梯度洗脱4水中的OH（每次洗脱4 mL，从4% NH开始）4OH：10%、15%、15%、20% 和 28%。
    5. 通过高效液相色谱（HPLC）监测纯化过程，按照步骤6中所述的反应监测方案分析每个组分。根据紫外（UV）色谱图保留含有纯目标衍生物的所有组分，并进行步骤5.2.6。
    6. 将含有目标化合物的组分收集至一个100 mL圆底烧瓶中，用水冲洗盛装组分的试管，并将冲洗液一并加入该100 mL圆底烧瓶中。
    7. 使用旋转蒸发仪在40 °C恒温水浴条件下减压除去溶剂，旋转蒸发仪连接真空泵，真空度设为10 mbar。
    8. 将固体溶于最小体积的水中，转移至已称重的25 mL圆底烧瓶中。用最小体积的水冲洗原容器，并将洗涤液并入25 mL圆底烧瓶中，然后进行步骤5.2.9。
    9. 称取纯化产物的质量并计算产率。
    10. 将纯化产物溶于最小体积的2M HCl中，直至肉眼不可见固体颗粒，然后按照步骤4.3.8-4.3.9所述进行冷冻干燥。
      注意：氨基醇类化合物性质敏感，通常以其盐酸盐形式保存。

6. 反应监测与产物分析

  1. 在高效液相色谱分析前对底物和产物进行衍生化
    注意：底物和产物需要衍生化为芳香族衍生物，以提高其在紫外色谱检测中的灵敏度。我们使用了1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）进行衍生化。每个样品在衍生化完成后立即进样至高效液相色谱（HPLC）中。
    1. 取10 µL酶促反应液转移至1.5 mL离心管中，加入10 µL 0.25 M NaHCO₃。3 水溶液，100 µL 乙醇，以及 30 µL 浓度为 2.5 mg/mL 的 DNFB 乙醇溶液。
    2. 盖上离心管，将所得溶液在65 °C、1,000 rpm条件下振荡反应1小时。加入10 µL 1 M HCl终止反应。
    3. 使用1 mL鲁尔注射器，通过直径4 mm、孔径0.22 µm的亲水性聚偏二氟乙烯（PVDF）膜非无菌注射器滤器过滤。
  2. 使用任何能够分离衍生化氨基酸的系统对双加氧酶反应进行监测。本方案涉及通过二硝基苯（DNB）发色团对氨基酸进行衍生化，并采用紫外检测27.
    1. 使用C18反相色谱柱（5 µm，3 x 150 mm），末端封端为三甲基硅烷，安装至高效液相色谱仪。
    2. 用（30:70）流动相B（MeCN + 0.1% TFA）与流动相A（H₂O + 0.1% TFA）平衡C18色谱柱2O + 0.1% TFA），流速为1 mL/min，温度35 °C，持续15分钟（相当于约20个柱体积）。
    3. 将10 µL衍生化反应混合物（见步骤6.1）注入HPLC C18色谱柱。流动相采用乙腈与0.1%三氟乙酸水溶液的混合物2以O和0.1% TFA为流动相，采用线性梯度洗脱（比例由30:70在9分钟内升至70:30，温度35 °C，流速1 mL/min）。
    4. 使用400 nm紫外检测分析色谱柱洗脱产物。DNB-赖氨酸通常在约6.5 min洗脱，羟基化DNB-赖氨酸约在5.5 min，二羟基化DNB-赖氨酸约在4.2 min，DNB-氨基二醇约在5.3 min。

7. 纯化氨基醇的核磁共振分析

  1. 将纯化的氨基醇溶解于 D2O（700 µL）中，并将溶液转移至核磁共振（NMR）样品管。
  2. 根据相应的核磁共振设施操作规程采集 1H 和 13C NMR 谱图28。

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结果

我们此前已报道过通过铁(II)/αKAO家族双加氧酶催化的非对映选择性酶促羟基化反应合成单羟基-L-赖氨酸和二羟基-L-赖氨酸的方法（图1）16。为了优化本文所展示的整个级联反应方案（该方案包含由αKAO催化的一步或两步羟基化反应，随后是由PLP-DC催化的脱羧反应），我们调整了反应条件，以同时满足两种酶促反应的需求。我们首先研究了两种脱羧酶LDCSrum和DCCpin对市售的(5R)-羟基-L-赖氨酸的催化活性。随后，我们将这两种脱羧酶与相应的αKAO催化的氧化步骤组成级联反应，检测其对单羟基衍生物3-羟基-L-赖氨酸（1）和4-羟基-L-赖氨酸（2）的脱羧活性。表1列出了单羟基-L-赖氨酸生物催化脱羧反应的结果。通过DNFB对反应混合物进行衍生化，生成相应的DNB标记底物和产物，再经HPLC测定转化率...

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讨论

手性氨基醇及其衍生物具有广泛的应用，从有机合成中的手性助剂到药物治疗均有涉及。传统有机合成中制备氨基醇的多步合成方法众多，但由于繁琐的保护/脱保护步骤以及对立体化学控制的敏感性，这些方法并不总是高效16。而生物催化方法无需保护/脱保护步骤，且通常具有高度的立体选择性，因此是一种理想的替代途径。

先前的研究报道了通过动态动力学不对称转化（DYKAT）方法合成多种具有2-苯乙胺骨架的β-氨基醇。在此路线中，由苏氨酸醛缩酶催化苯甲醛及其衍生物的羟醛缩合反应，引入羟基取代的手性中心。该第一步反应的非对映选择性较低且收率中等，但随后通过L-酪氨酸脱羧酶（L-tyrosine DC）催化的立体专一性脱羧反应得以克服，从而得到对映体富集的芳香族β-氨基醇11,12。

本文报道了一种以易得的L-赖氨酸为起始原料，直接合成多种氨基醇的简便方法。尽管该方法效率较高，但由于αKAO和P...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Véronique de Berardinis 的有益讨论，以及 Alain Perret、Christine Pellé 和 Peggy Sirvain 提供的技术支持。

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材料

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HEPESSigma AldrichH3375
L-赖氨酸盐酸盐Sigma AldrichL5626
(5S)-羟基-L-赖氨酸Sigma AldrichGPS NONH外包
α-酮戊二酸Sigma Aldrich75892
抗坏血酸钠Sigma AldrichA7631
硫酸亚铁铵六水合物Acros201370250
磷酸吡哆醛（PLP）Sigma Aldrich82870
3,4-二巯基丁烷-1,2-二醇（DTT）Sigma AldrichD0632
1-氟-2,4-二硝基苯（DNFB）Sigma AldrichD1529
乙醇VWR20825.290
碳酸氢钠Sigma Aldrich71631
HCl 37%Sigma Aldrich435570
HCl 0.1MFluka35335
乙腈 HiPerSolv CHROMANORM 用于 LC-MSVWR83640.320
2,2,2-三氟乙酸VWR153112E
氨水 28%VWR21182.294
甲醇 HiPerSolv CHROMANORM 用于 LC-MSVWR83638.32
甲酸Acros270480010
磷酸 85%Acros201145000
重水Acros320,710,075
NaOHSigma AldrichS5881
C18 HPLC 色谱柱Phenomenex00F-4601-Y0
Accela UHPLC 系统ThermoFisher Scientific
Accela PDA 检测器ThermoFisher Scientific
一次性 4 mm 注射器滤器 - 0.22µm - PVDFMerckSLGVR04NL
带毫升刻度、鲁尔接头的一次性结核菌素注射器VWRHSWA5010.200V0
阳离子交换树脂 100-200 目Sigma Aldrich217506
混合模式阳离子交换固相萃取小柱 6 mLWaters186000776
固相萃取装置WatersWAT200609
旋转蒸发仪Büchi531-0103
冷冻干燥机 alpha 1-2 LDplusChristL083302
微量移液器 20 µLEppendorf3121000031
微量移液器 100 µLEppendorf3121000074
微量移液器 500 µLEppendorf3121000112
微量移液器 1000 µLEppendorf3121000120
300 MHz 核磁共振波谱仪Bruker
2 mL 微量离心管CLEARLineCL20.002.0500
50 mL 圆锥底离心管Fischer Scientific05-539-8
25 mL 圆底烧瓶 14/23Fischer Scientific10353331
100 mL 圆底烧瓶 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL 圆底烧瓶 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL 锥形瓶Fischerbrand15496143

参考文献

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