利用点击化学可视化植物中木质化动态：双重标记即为 BLISS！

摘要

BLISS 是一种用于研究木质素沉积动态的双标记方法。该方法利用合成的单体木质素报告分子，结合SPAAC和CuAAC生物正交点击反应的顺序联用，为深入分析调控木质素生物合成的因素提供了途径 在植株中.

摘要

木质素是地球上最丰富的生物聚合物之一，也是木质纤维素生物质的主要组分。这种酚类聚合物在高等植物的生长发育和生命活动中发挥着重要的结构支撑与保护作用。尽管调控木质化过程的复杂机制 体内 对许多植物源产品的工业价值具有重要影响，科学界在解析这些过程方面仍有很长的路要走。本文介绍的双重标记方案通过一个简单的三步工作流程，实现了对植物组织中活跃木质化区域的生物成像研究。第一步是将两种独立的化学探针作为天然单体木质醇的替代物，代谢整合到植物体内，这两种单体分别对应木质素中的H单元和G单元。在整合到生长中的木质素聚合物后，每种探针通过连续的生物正交SPAAC/CuAAC点击反应，分别与特异的荧光探针结合。结合木质素的自发荧光，该方法可通过共聚焦荧光显微镜生成植物细胞壁中木质素的三色定位图，从而在组织、细胞以及不同细胞壁层次上，精确提供活性木质化机制存在与否的空间信息。

引言

在过去的二十年中，化学报告分子策略已发展成为一种强大的两步法，用于研究非遗传编码生物分子的动态变化及其功能。^1,2,3 在该策略中，首先由活体生物代谢一种带有微小修饰的、目标生物分子的合成类似物——即化学报告分子；随后，通过生物正交“点击化学”反应，将一个化学探针（例如，用于荧光共聚焦显微成像的荧光团）共价连接到已整合的报告分子上。该探针必须能够快速且特异性地与引入的化学修饰发生反应，同时对生物体内存在的各类生物分子保持惰性。在许多方面，该方法通过采用高度特异性的点击化学连接反应，克服了传统生物偶联技术的局限性，从而为在活体系统中追踪此前难以观测的代谢物或生物大分子提供了可能。^4,5,6

尽管这种强大方法在细菌和动物细胞中的应用日益广泛，但在植物生物学中描述其应用的报道却出人意料地稀少^{7,8,9,10,11,12}。我们特别感兴趣的是将这一策略应用于植物，以研究木质素的形成过程。木质素是地球上最丰富的生物聚合物之一，也是木质纤维素生物质的主要组分^13,14。木质素是一种酚类聚合物，在高等植物的发育和生命过程中发挥着重要的结构支撑和保护作用。

木质素通常由三种4-羟基苯基丙烷基单元组成：H单元（p-羟苯基）、G单元（愈创木基）和S单元（紫丁香基），它们分别来源于三种“单木质醇”——p-香豆醇、松柏醇和芥子醇，这些单木质醇通过细胞质中的苯丙烷代谢途径合成（图1）。单木质醇被转运至细胞壁后，在过氧化物酶或漆酶的作用下被氧化为自由基，随后通过纯粹的化学自由基偶联反应聚合形成木质素聚合物，该过程称为木质化。^15,16 尽管木质素对多种植物源性产品的工业利用具有重要影响，但科学界在解析调控木质化过程的复杂机制方面仍任重道远。

图1：植物细胞中的木质化过程。 单木质醇在细胞质中由苯丙氨酸生物合成。单木质醇被转运至细胞壁后，由过氧化物酶或漆酶氧化为自由基，随后通过纯粹的化学自由基偶联反应聚合形成木质素聚合物，该过程称为木质化。 请点击此处查看该图的放大版本。

尽管关于利用生物正交反应进行聚糖分析的报道很多，^2,3,17 它们在其他类型生物分子中的应用实例较少。利用生物正交化学进行木质素生物成像的研究直至最近才由 Tobimatsu 首次开创 等⁸ 在 拟南芥 以提供有关松柏醇替代物在木质素聚合物中形成G单元的整合信息，^8,9 从而证明了化学报告策略在此背景下具有可行性。几个月后，Bukowski 使用另一种松柏醇衍生物，进一步展示了 CuAAC 的应用。 等.⁹ 然而，木质素还含有H单元和S单元，要更深入地理解木质化过程，还需进一步了解所有单体木脂醇如何被整合到聚合物中，以及可能控制其组成的各种因素。目前，该领域的最新进展依赖于开发出能够在活体系统中同时追踪多种化学示踪剂的有效方法。尽管近年来已有少数关于多糖的研究奠定了基础^{18,19,20,21,22}，双标记方法在生物正交化学中仍然是一个主要挑战。如果一种可重复的单标记点击化学方案都难以开发，那么需要同时优化两种相互兼容的生物正交反应、并作用于两个独立化学报告分子的双标记方法则更加困难。在此方面为数不多的先行研究中，采用的是环张力促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）与烯烃-四嗪逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（DA）相结合的策略。_{侵袭相关蛋白（inv）}）反应用于动物细胞中糖类的研究。然而，我们认为，由于木质素的结构特征（由富电子取代的肉桂醇类单体组成，可与缺电子二烯烃发生反应，例如DAinv反应中使用的四嗪探针），DAinv反应在此应用中的生物正交性可能无法得到保证，可能导致非特异性标记。此外，DA_{侵袭相关蛋白（inv）} 反应需要化学修饰基团，而这些基团在合成上难以获得，且具有体积大和亲脂性强的特点，因此可能影响化学报告分子的掺入速率、转运和/或定位 体内 可能会受到影响。鉴于我们认为后一方面在使用点击化学方法研究木质化时尤为关键，我们选择了另一条技术路径，并开发了一种生物正交连接成像顺序策略（Bioorthogonal Ligation Imaging Sequential Strategy,BLISS) 使用应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）与铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）相结合的方法 在体内²³

这两种反应确实是迄今为止所使用的两种主要生物正交点击反应，尤其在最近发表的少数木质素成像研究实例中得到了应用。^8,9 我们的双重标记策略可在一种单木质醇探针上引入叠氮基团，在另一种探针上引入端炔基团。这两种化学标记基团具有以下特点：i）对生物体系中的相关结构不发生反应；ii）体积非常小（图2）。因此，这些合成修饰对所研究生物分子理化性质的影响被降至最低，从而在代谢掺入过程中，减少了非天然单木质醇底物与天然底物在转运和代谢速率方面可能出现的差异。尽管SPAAC与CuAAC的联用策略初看之下非常直观，但据我们所知，这仅是该策略的第二个双重标记应用实例，也是首次应用于聚糖以外的结构。^12,23

图2：BLISS双标记策略。 化学探针H_AZ和G_ALK是天然H型和G型单木质醇的标记类似物。它们首先通过外源添加的方式被整合到细胞壁中正在合成的木质素聚合物中（步骤1）。随后，环辛炔和叠氮功能化的荧光探针通过生物正交点击化学反应依次与已整合的探针连接：SPAAC反应（步骤2）对H_AZ单元具有高度特异性，随后进行CuAAC反应（步骤3），该反应特异性识别G_ALK单元（步骤3），从而实现在同一样本中对两种探针的独立特异性定位。请点击此处查看该图的放大版本。

我们首先设计并验证了叠氮标记的单体木脂素探针 H_AZ （替代物） p松柏醇（松柏醇是木质素H单元的前体），随后设计了BLISS双标记策略，该策略将其与先前报道的炔基标记物联用 G_ALK,⁹ （松柏醇的替代物及木质素G单元的前体）。在亚麻这一具有重要经济价值的植物物种中开发并验证的这一可重复实验方案，实现了双重代谢整合 H_AZ 和 G_ALK 进入木质素的标记首先在连续的SPAAC/CuAAC标记之前完成。此处，已标记的 H_AZ 单位首先被特异性标记 通过 通过SPAAC反应连接环辛炔功能化的荧光染料，随后通过CuAAC介导的连接反应将第二种荧光探针连接至标记位点 G_ALK 单位。该方法可用于研究植物细胞壁中木质化过程的动力学，且可被应用于 体内 茎的横切面、活体茎以及不同植物物种的幼苗。

方案

注意：液体和固体½ MS培养基必须按照补充表1中所述预先配制。

1. 植物培养

1. 培养两个月大的亚麻植株
   1. 将亚麻（Linum usitatissimum L.）种子播种于塑料盆中，使用盆栽培养土。
   2. 在生长培养箱中于22 °C条件下培养亚麻，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。
   3. 植株生长一个月后提供垂直支撑，继续培养至两个月大。
2. 培养两周大的亚麻幼苗
   1. 将12粒亚麻种子用一块纱布包裹，并用橡皮筋固定成一个种子包。
      注意：后续步骤需在超净工作台的无菌条件下进行。
   2. 将种子包放入已预先高压灭菌的250 mL玻璃瓶中。
   3. 向瓶中加入70 mL 70%乙醇，轻轻搅拌1分钟。
   4. 小心倾倒去除乙醇，保留种子包在瓶内。
   5. 加入100 mL 2%次氯酸钠溶液，轻轻搅拌10分钟。
   6. 倾倒去除次氯酸钠溶液，保留种子包在瓶内。
   7. 重复步骤1.2.5–1.2.6。
   8. 加入100 mL无菌超纯水，搅拌1分钟。
   9. 重复步骤1.2.8共3次，每次冲洗时间逐渐增加（分别为5、10和15分钟）。
   10. 加热融化固体½ MS培养基，倒入无菌植物培养盒中，高度约为2 cm，静置冷却至凝固。
   11. 用无菌镊子小心将每粒种子放置于凝固的培养基表面。
   12. 盖好无菌培养盒。
   13. 将培养盒转移至22 °C、光照周期为16小时光照/8小时黑暗的生长培养箱中，培养亚麻幼苗2周。

2. 化学报告分子的代谢整合

注意：以下展示了三种实验模型：i）茎横切面的代谢标记，ii）完整茎段，以及 iii）植物幼苗。每种方案均以一个生物学重复为例进行描述，所需生物学重复的数量可根据实际情况调整试剂用量。单木质醇溶液由实验前按照表2所述方法配制的储备液制备。储备液可在 -20 °C 下保存数月。H_AZ:G_ALK 或 H:G 的比例可根据自定义实验设计进行调整。

1. 化学探针在两个月大亚麻茎横切片中的掺入
   1. 在300 µL液体无菌½ MS培养基中配制含10 µM G_ALK 和10 µM H_AZ 的化学探针溶液。
   2. 涡旋混匀 H_AZ/G_ALK 溶液，并用微量移液器将其转移至48孔板的一个孔中。
   3. 在300 µL液体无菌½ MS培养基中配制含10 µM G 和10 µM H 的阴性对照溶液。
   4. 涡旋混匀 H/G 溶液，并用微量移液器将其转移至同一48孔板的另一个孔中。
   5. 使用新的剃须刀片，在距土壤表面10 cm处切断两个月大的亚麻植株茎部。
   6. 用剃须刀片小心地手工制备约50片茎部自由手切横切片（厚度约150–250 µm）。
   7. 立即将切片放入盛有液体无菌½ MS培养基的培养皿中。
   8. 肉眼检查并挑选完整且无损伤的整片横切片，随机选取10片放入含 H_AZ/G_ALK 溶液的孔中。
   9. 对含 H/G 溶液的孔（作为阴性对照）重复步骤2.1.8。
   10. 对第三个含300 µL ½ MS培养基的孔（作为背景对照，用于后续共聚焦显微镜图像数据处理时调整荧光基线）重复步骤2.1.8。
   11. 将48孔板置于20 °C生长箱中，在持续光照条件下孵育20小时。
   12. 用微量移液器吸除各孔中的单木质醇溶液。
   13. 向每个孔中加入500 µL ½ MS培养基，轻轻搅拌10分钟，然后用微量移液器吸除洗涤液。重复此洗涤步骤4次，并立即进行BLISS标记（第3节）。
2. 化学探针在两个月大亚麻完整茎中的掺入
   1. 在5 mL液体无菌½ MS培养基中配制含10 µM G_ALK 和10 µM H_AZ 的化学探针溶液。
   2. 涡旋混匀 H_AZ/G_ALK 溶液，并用移液器将其转移至一个20 cm高的玻璃试管中。
   3. 在5 mL液体无菌½ MS培养基中配制含10 µM G 和10 µM H 的阴性对照溶液。
   4. 涡旋混匀 H/G 溶液，并用移液器将其转移至另一个20 cm高的玻璃试管中。
   5. 准备第三个玻璃试管，其中含有5 mL ½ MS培养基（作为背景对照，用于后续共聚焦显微镜图像数据处理时调整荧光基线）。
   6. 使用新的剃须刀片，在距土壤表面10 cm处切断两个月大的亚麻植株茎部。弃去根系和茎的下部，使用植株茎的上部进行下一步操作。
   7. 将整段切下的茎基部浸入含有 H_AZ/G_ALK 溶液的试管中。在去除根系后应立即将其放入孵育溶液中，以防止茎部干燥。
      注：若该方法应用于更年轻或更年老的植株和/或其他物种，单木质醇溶液的体积需根据植株大小/年龄及其茎直径进行相应调整。
   8. 将茎固定在垂直支撑物上，使其保持直立。
   9. 用Parafilm封口膜密封玻璃试管，防止溶液蒸发。
   10. 对含 H/G 溶液的阴性对照样品重复步骤2.2.6–2.2.9。
   11. 对含½ MS培养基的荧光背景对照样品重复步骤2.2.6–2.2.9。
   12. 将每根茎在氖灯持续光照下孵育20小时。
   13. 在20小时代谢掺入后，取出在 H_AZ/G_ALK 溶液中孵育的茎，并用½ MS培养基冲洗。
   14. 用剃须刀片切去并弃去茎底部1 cm，然后从剩余茎的基部制备一个高1 cm的圆柱体。
   15. 从该圆柱体小心地手工制备20片横切片（厚度约150–250 µm），并立即放入盛有½ MS培养基的培养皿中。
   16. 在48孔板的一个孔中加入500 µL ½ MS培养基。
   17. 肉眼检查并挑选完整且无损伤的整片横切片，随机选取10片放入含½ MS溶液的孔中。
   18. 对在 H/G 溶液中孵育的阴性对照茎重复步骤2.2.13–2.2.17。
   19. 对在½ MS培养基中孵育的荧光背景对照茎重复步骤2.2.13–2.2.17。
   20. 用微量移液器小心吸除各孔中的溶液。
   21. 向每个孔中加入500 µL ½ MS培养基，轻轻搅拌10分钟，然后用微量移液器吸除洗涤液。重复此洗涤步骤4次，并立即进行BLISS标记（第3节）。
3. 化学探针在两周大亚麻幼苗中的掺入
   注：以下所有步骤均需在无菌条件下进行。
   1. 在2 mL液体无菌½ MS培养基中配制含10 µM G_ALK 和10 µM H_AZ 的化学探针溶液。
   2. 涡旋混匀 H_AZ/G_ALK 溶液，并用移液器将其转移至一个20 cm高的玻璃试管中。
   3. 在2 mL液体无菌½ MS培养基中配制含10 µM G 和10 µM H 的阴性对照溶液。
   4. 涡旋混匀 H/G 溶液，并用移液器将其转移至另一个20 cm高的玻璃试管中。
   5. 准备第三个20 cm高的玻璃试管，其中含有2 mL ½ MS培养基（作为背景对照，用于后续共聚焦显微镜图像数据处理时调整荧光基线）。
   6. 使用长镊子小心地从固体½ MS培养基中取出一株两周大的亚麻幼苗（见上文第1.2节）。
   7. 轻柔地将幼苗转移至含有 H_AZ/G_ALK 溶液的试管中，确保其根部浸没在溶液中。
   8. 用塑料盖封闭玻璃试管，防止溶液蒸发。
   9. 对含H/G溶液的阴性对照试管重复步骤2.3.6–2.3.8。
   10. 对含½ MS培养基的荧光背景对照试管重复步骤2.3.6–2.3.8。
   11. 将每株幼苗置于20 °C生长箱中，在持续光照条件下孵育20小时。
   12. 小心取出在 H_AZ/G_ALK 溶液中孵育的幼苗，并用½ MS培养基冲洗。
   13. 小心地手工制备下胚轴的20片自由手切横切片（厚度约150–250 µm）。
   14. 在48孔板的一个孔中加入500 µL ½ MS培养基。
   15. 肉眼检查并挑选完整且无损伤的整片横切片，随机选取10片放入含½ MS溶液的孔中。
   16. 对在 H/G 溶液中孵育的阴性对照幼苗重复步骤2.3.12–2.3.15。
   17. 对在½ MS培养基中孵育的荧光背景对照幼苗重复步骤2.3.12–2.3.15。
   18. 用微量移液器小心吸除各孔中的溶液。
   19. 向每个孔中加入500 µL ½ MS培养基，轻轻搅拌10分钟，然后用微量移液器吸除洗涤液。重复此洗涤步骤4次，并立即进行BLISS标记（第3节）。

3. 通过 SPAAC 和 CuAAC 对植物横截面样本进行双重荧光标记

注意：BLISS 标记方案在所有 3 种实验模型中均相同（第 2 节）。

1. 应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）标记
   1. 准备1 mL SPAAC溶液，其中含有5 µM DBCO-PEG₄-5/6-羧基罗丹明110，溶于液体无菌½ MS培养基中。涡旋混合溶液，并避光保存。
   2. 在代谢标记实验的最终洗涤步骤后（根据所选实验设计，参见步骤2.1.13、2.2.21或2.3.19），吸除½ MS培养基，用移液器向每孔加入300 µL SPAAC溶液。
   3. 用铝箔覆盖48孔板或将其放入盒中，以避光保护。
   4. 将培养板置于室温下，在避光条件下于机械摇床上轻柔振荡反应1小时。
2. 铜催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）标记
   1. 按照步骤2.1.13所述方法，在避光条件下对每孔进行4次洗涤。
   2. 准备1 mL CuAAC溶液，其中含有2.5 mM抗坏血酸钠、0.5 mM CuSO₄和5 µM 5-TAMRA-PEG₃-叠氮化物，溶于液体无菌½ MS培养基中。涡旋混合溶液，并避光保存。
      注意：该CuAAC溶液必须在使用前新鲜配制，在4 °C下保存不得超过数天。
   3. 吸除每孔中的½ MS培养基，直接用移液器向每孔加入300 µL CuAAC溶液。
   4. 将培养板置于室温下，在避光条件下于机械摇床上轻柔振荡反应1小时。
   5. 用移液器吸除CuAAC溶液。
   6. 用移液器向每孔加入500 µL ½ MS培养基，避光振荡洗涤10分钟，然后吸除洗涤液。重复此步骤两次。
   7. 向每孔加入500 µL 7:3的甲醇/水溶液，避光振荡1小时，然后吸除溶液
      注意：甲醇可通过皮肤接触或吸入引起中毒，被列为人类致癌物。使用时必须在通风橱中操作，并佩戴手套。
   8. 向每孔加入500 µL ½ MS培养基，避光振荡10分钟，然后吸除溶液。重复此步骤4次。

4. 将样品装载到显微镜载玻片上

1. 在玻璃载玻片上滴加5滴封片剂。
2. 小心地将每张标记有H_AZ/G_ALK的横切面置于载玻片上。
3. 在载玻片相对的两侧涂上指甲油。
4. 盖上盖玻片，注意避免产生气泡。
5. 用纸巾吸除多余的封片剂。
6. 在载玻片四周均用指甲油密封，室温下静置使指甲油完全干燥（约30分钟）。
7. 对阴性对照H/G横切面重复步骤4.1–4.6。
8. 对荧光背景对照横切面重复步骤4.1–4.6。
9. 将载玻片置于4 °C避光保存，直至进行共聚焦显微镜观察。
   注意：制备好的载玻片可保存数周至数月，具体保存时间取决于制备质量。若在保存后需重新观察，请确保样品未干涸。

5. 荧光共聚焦显微镜图像采集

1. 根据制造商的说明，按正确顺序开启共聚焦显微镜系统的所有必要组件。
2. 选择具有最大数值孔径且适用于所需激发和发射波长的物镜（例如，60倍物镜，数值孔径1.2；自发荧光通道：λ_ex 405 nm，λ_em 450 nm /25；SPAAC H_AZ 通道：λ_ex 488 nm，λ_em 525 nm /25；CuAAC G_ALK 通道：λ_ex 561 nm，λ_em 595 nm /25；采用顺序扫描模式）。
3. 在软件中设置所需的成像参数（需使用12位或16位图像，像素大小应符合奈奎斯特准则）。
4. 将 H_AZ/G_ALK 样本载玻片放置于显微镜载物台上，并将样品置于物镜下方。
5. 观察并找到植物组织中感兴趣的区域。
6. 采集双标记 H_AZ/G_ALK 样品的高质量共聚焦图像。
   1. 在Z轴方向选择荧光信号最强的焦平面。
   2. 调节增益、偏移和激光功率，使每个通道（自发荧光、H_AZ 和 G_ALK）的信号在整个灰度范围内分布最佳。后续所有图像采集必须使用相同的参数设置。
   3. 开始采集选定图像并保存文件。对样品中每个相关区域重复此步骤。
      注意：如有需要，也可采集三维Z层叠重建图像。
7. 使用相同的成像参数，采集仅在½ MS培养基中孵育的未标记样品图像，以确定自发荧光水平（作为第2节所述的荧光背景对照）。
8. 使用相同的成像参数，采集经天然单木质醇 H/G 孵育的阴性对照样品图像，以评估荧光探针在样品上的非特异性吸附情况。
9. 对所采集的图像进行数据处理，从 H/G 阴性对照图像和 H_AZ/G_ALK 图像中扣除背景自发荧光信号。

结果

通过使用本研究所提出的BLISS方案，结合合成的单木质醇类似物与生物正交点击化学反应，可在活体植物中可视化木质化过程的动态变化。与现有的木质素可视化技术（如组织化学染色、免疫定位或自发荧光）不同，该“双点击”方案仅特异性标记新合成的木质素 从头合成 在代谢标记步骤中，通过共聚焦荧光显微镜的三通道细胞成像，将其与样品中预先存在的木质素区分开来（图3). H_AZ- 使用 DBCO-PEG 的激发和发射波长检测信号单位₄-5/6-羧基罗丹明110，特异性点击连接至掺入的叠氮基团 H_AZ SPAAC 步骤中的分子（λex 501 nm /λ_em 526 nm，绿色通道），而 G_ALK-单位在叠氮荧光探针 azidefluor 545 的特征波长处被类似地检测到，该探针特异性地与整合到末端炔烃标签上的基团发生点击反应 G_ALK 在CuAAC步骤期间（λex 546 nm /λ_em 565 nm，红色通道）；第三通道对应于预先存在的木质素，通过其在405 nm处的固有自发荧光（蓝色通道）进行检测。该方法可生成植物细胞壁中木质素的三色定位图谱，提供器官不同组织间活性木质化机制存在与否的精确空间信息图3A），同一组织内不同细胞类型之间的差异（图3B- C）以及同一细胞不同壁层之间（图3D换句话说，该方法能够突出并特异性定位“活跃的”木质化位点（H_AZ 和 G_ALK 通道），从而将其与植物发育早期阶段形成木质素的区域（自发荧光通道）区分开来。此外，与自发荧光相比，该技术的灵敏度显著提高，能够检测到更微量的新合成木质素（图3B).

图3：亚麻茎中掺入的单体木质素化学探针成像。（A）亚麻茎手工制作的横切面一半，重建图像。（B）分化中木质部最外层的放大图。左图：木质素自发荧光（蓝色，405 nm），中图：木质素自发荧光（蓝色）与H_AZ 荧光（绿色，526 nm）通道合并，右图：木质素自发荧光（蓝色）与G_ALK荧光（红色，565 nm）通道合并。箭头指示从形成层开始第一个被标记的细胞壁，说明BLISS技术相比自发荧光具有更高的灵敏度。（C）次生木质部不同细胞类型的标记情况，以及（D）次生木质部细胞的放大图，展示同一细胞壁不同层次中的标记差异。左图：木质素自发荧光（蓝色）与H_AZ荧光（绿色，526 nm）通道合并，中图：木质素自发荧光（蓝色）与G_ALK荧光（红色，565 nm）通道合并，右图：木质素自发荧光（蓝色）、H_AZ（绿色）和G_ALK（红色）荧光通道合并。H_AZ 与G_ALK共定位显示为黄色。请点击此处查看该图的放大版本。

因此，化学报告分子策略（例如本文介绍的BLISS方法，或Tobimatsu et al.⁸ 之前发表的单标记方法）相较于以往的免疫染色或组织化学染色等方法，能够在实验操作极为简便的前提下实现更为精细的研究。例如，图4 显示，在亚麻次生木质部的纤维管胞/导管（FT）中，H_AZ/G_ALK 的掺入信号强度在形成层附近的最初几层细胞壁中非常高，但在更老的细胞中则逐渐减弱。该分布模式与自发荧光的模式相反，表明在距形成层最近的两到三层FT细胞中，木质化程度能够极快地达到峰值。相比之下，射线（R）细胞似乎在其发育的较晚阶段仍持续进行木质化，因为从形成层到髓心的所有射线细胞壁中，H_AZ/G_ALK 的掺入信号更为恒定。FT和R两类细胞表现出不同的木质化动态并不令人意外，因为这两类细胞具有不同的生物学功能，其发育程序也相应存在差异。事实上，FT是细长的管状结构，成熟后迅速死亡，留下具有厚木质化细胞壁的死细胞，在机械支撑以及水分和矿物质的纵向运输中发挥关键作用；而构成木质部射线的狭行长排R细胞在其成熟且具有功能的状态下仍保持存活，且不具有厚的木质化细胞壁。

图 4：亚麻木质部中细胞特异性单木质素单元报告分子的掺入。 亚麻茎手工横切片部分的明场共聚焦显微图像（A）。粉红色（射线薄壁细胞，R）和黄色（纤维管胞细胞，FT）箭头指示从形成层区域指向髓心的矢量方向，并用于在 405 nm 处扫描木质素自发荧光（B），在 526 nm 处扫描 H_AZ 荧光（C），以及在 565 nm 处扫描 G_ALK 荧光（D）。(E) 次生木质部视图。左侧面板：木质素自发荧光（蓝色）、H_AZ（绿色）和 G_ALK（红色）荧光通道的合并图像。H_AZ 与 G_ALK 的共定位显示为黄色。右侧面板：亚麻茎中次生木质部结构的示意图。V，导管；FT，纤维管胞；R，射线薄壁细胞。本图经 Lion et al.²³ 修改而来 请点击此处查看此图的放大版本。

此外，在 BLISS 方案中使用分别对应 H 单元和 G 单元的两种不同化学探针，并结合两种生物正交反应，能够获得更定量的结果。诸如 BLISS 的多重标记策略，可为进一步理解不同条件下对单木质醇单元掺入比例的调控机制提供新的视角，并有助于解析尚不明确的木质化过程。尽管木质素中 H、G 和 S 单木质醇的相对百分比确实会因植物的物种、组织、发育时期或环境条件而发生显著变化，但调控这种组分变化的复杂机制仍未被完全阐明。双标记技术为研究调控木质素组分的若干参数提供了一种强有力的手段。例如，通过 BLISS 技术调节 H_AZ:G_ALK 比例，我们得以证明次生木质部组织中木质素的组分直接取决于细胞壁内单木质醇的可利用性，而非依赖于过氧化物酶/漆酶的特异性（图 5）。

图 5：不同 H_AZ:G_ALK 百分比比例处理亚麻茎切片的影响。 各图列上方标示了 H_AZ:G_ALK% 的比例。顶部：H_AZ 与 G_ALK 通道的合并图像。底部：不同百分比比例下 H_AZ 和 G_ALK 平均荧光强度的直方图。数值以灰度级表示，为平均荧光强度的均值 ± 标准差（SD）。比例尺 = 100 µm。 本图改编自 Lion et al.²³ 请点击此处查看此图的放大版本。

亚麻因其韧皮纤维（BF）而被种植，这些纤维可用于制造纺织品、高档纸张或环境友好型复合材料。其工业价值的一个重要方面在于，其细胞壁中木质素含量极低，并具有异常增厚的S2/G次生层^19,24。BLISS技术能够揭示同一细胞壁不同层次之间木质化动态的差异。图6A显示，H_AZ 和 G_ALK 报告分子仅掺入部分而非全部韧皮纤维的细胞角隅以及中胶层/初生细胞壁中。即使外源提供单木质醇化学报告分子，厚壁韧皮纤维的次生细胞壁层也完全不发生木质化，这表明其低木质化状态源于缺乏适合单木质醇通过酶促氧化并掺入生长中聚合物链的分子环境，而不仅仅如先前报道所述是由于单木质醇生物合成基因的转录调控所致²⁵。这一观察结果也与以下事实高度一致：在具有木质化韧皮纤维的亚麻化学突变体 lbf1 中，亚麻过氧化物酶基因在外层茎组织中呈上调表达²⁶。

图6：BLISS技术突出显示细胞壁亚结构或特定层之间的差异。（A）左图：亚麻茎切片的明场图像。圆圈指示一个纤维束。右图：韧皮纤维的放大图。合并的H_AZ与G_ALK通道图像（含或不含明场）显示，木质化仅限于细胞角（）以及部分韧皮纤维的中层/初生细胞壁。BF，韧皮纤维；Par，薄壁细胞；M，中层；P，初生细胞壁；S1，次生细胞壁第一层；S2/G，次生细胞壁的次生层/胶质层。（B）亚麻根内皮层区域共聚焦z轴扫描的二维切片与三维重建图。凯氏带（）仅显示自发荧光，不掺入H_AZ或G_ALK信号。相应的荧光图谱显示G_ALK/H_AZ呈负相关：高绿色荧光对应低红色信号（皮层），反之亦然（内皮层）。Pericycle（P），内皮层（E），皮层（C）。请点击此处查看该图的放大版本。

最后，这种双色标记方法还可为不同发育阶段及非茎部植物器官中细胞壁亚结构的“木质化状态”提供有价值的信息。例如，亚麻根的内皮层在发育早期，其径向和横向细胞壁中存在凯氏带。这种由木栓质和/或木质素构成的疏水性生物聚合物带可阻止根部吸收的水分和溶质通过质外体途径被动进入，迫使它们必须穿过质膜，经由共质体途径运输，从而增强植物根系对物质的选择性吸收能力。当该方法应用于亚麻根时，我们的研究策略显示，H_AZ 和 G_ALK 被整合至内皮层细胞的切向壁以及凯氏带不存在的径向壁部分（图6B）。然而，凯氏带本身完全缺乏单木质醇探针的掺入，表明在此发育阶段该结构已成熟，而其他细胞壁仍处于持续的生物聚合物沉积过程中。z轴堆叠图像的三维重建清晰地揭示了凯氏带的结构。有趣的是，一些紧邻内皮层的皮层细胞壁也被证实能够优先掺入 H_AZ（表明亚麻根皮层中存在木质素/木栓质），但不能掺入 G_ALK。共定位分析显示 H_AZ 与 G_ALK 之间存在负相关性，提示这两种相邻细胞类型可能具有细胞特异性的细胞壁结构或酶系统。

补充表 1：固体 ½ MS 培养基的制备 请点击此处下载该文件。

补充表 2：化学探针储备液的配制 请点击此处下载该文件。

讨论

如前所述，本文介绍的双重标记BLISS方案是SPAAC/CuAAC组合应用的首批实例之一 体内^12,23每一步均经过充分优化和验证，必须严格遵守两种点击化学标记反应的依次操作顺序（即先进行SPAAC反应，再进行CuAAC反应）。所有交叉对照结果表明，在应用BLISS方案时，每个标记步骤均具有特异性。²³ ：先进行SPAAC步骤可实现高度化学选择性的标记 H_AZ 叠氮基团通过与环辛炔功能化的荧光染料发生具有快速动力学的[3+2]环加成反应而发挥作用。一旦 H_AZ 单位被标记后，需要通过铜(I)催化的活化进行CuAAC步骤 G_ALK 末端炔烃可通过与叠氮-Fluor 545 探针反应生成三唑键。相比之下，不应采用相反的顺序（即先进行铜催化的叠氮-炔环加成反应，再进行应变促进的叠氮-炔环加成反应），因为这会导致 G_ALK 和 H_AZ 单元交叉偶联会与荧光团连接反应竞争，并导致信号显著降低。还需强调中间洗涤步骤的必要性，以避免非特异性染色。

我们已证明，该方法可应用于多种生物学实验设计。BLISS标记方案最初应用于亚麻茎的徒手切片（厚度约为150–250 µm），这些切片在切割后已预先与可点击的单木质醇单体孵育。尽管这种设计具有减少化学探针用量（因孵育体积较小）并便于进行统计重复实验的优点，但严格来说，它并非一种体内系统，在某些情况下可能无法完全反映真实的时空木质化动态过程。在第二种实验设计中，我们因此将BLISS方案改进，采用了一种先前用于研究放射性标记单木质醇在松树和银杏中掺入情况的方法²⁷。该方法将植物的根系与茎干进行物理分离，将整段茎的基部浸入单木质醇溶液中，可称之为“花瓶法”。在茎段完成所需（孵育）时间后，切取横截面并执行BLISS方案。该实验使我们得以证明：（i）修饰后的单木质醇能够通过活体茎干运输，并掺入细胞壁中正在形成的木质素聚合物内；（ii）其定位模式与横截面方法基本一致。此类实验的优势在于可在真正的活体植物/活细胞体系中进行，支持更长时间的实验和更深入的研究，但需要消耗更多的化学探针。最后，BLISS方案还被应用于亚麻幼苗，这是一种真正的活体植物模型，其中化学探针需经由根部吸收后向上运输至茎部。尽管该模型明显具有在活体植物中进行实验的优势，但在实际操作中，它仅适用于幼嫩的幼苗，且由于实际原因（孵育时间长、所需化学探针用量大），并不适合研究较老植株的木质化动态过程。尽管如此，这三种实验设计互为补充，各自在实际操作性和生物学意义方面均具有优缺点，具体选择应根据所要回答的生物学问题而定。

本方案最初为研究亚麻的木质化动态而开发，具有高度的可适应性，不仅在生物学实验设计方面，而且在应用于其他植物物种及器官/组织方面均表现出良好的通用性。例如，BLISS 方法可轻松拓展至更适合利用基因敲除或基因沉默突变体进行研究的拟南芥（Arabidopsis）或杨属（Populus）植物。原则上，通过使用两种不同的植物细胞壁聚合物修饰前体，该方法还可进一步扩展至其他生物分子的双标记研究——包括全部三种主要的单木质醇及其代谢前体，以及构成多糖基质的各种单糖。自诞生以来，生物正交化学主要被用于通过代谢寡糖工程（MOE）来研究聚糖/多糖^4,5,17,28，但令人意外的是，迄今为止其在植物生物学中的应用仍极为有限^{7,8,9,10,11,12}。从反应兼容性的角度来看，木质素的研究确实是一个较为复杂的问题，因为两种化学探针均被整合进同一种交联聚合物中。未标记的H_AZ-G_ALK交联结构的形成是需要克服的主要难题，这是由于在木质素的三维结构中，G_ALK和H_AZ单元在空间上彼此靠近²³；而如果两种化学探针未被整合到同一类型的生物聚合物中，或未位于细胞特定区域的相同空间位置，则该限制可能不存在。

从更广泛的角度来看，BLISS方法原则上可应用于任何基于细菌或动物模型的双色荧光成像研究，只要该研究使用两种不同的化学报告分子，分别带有叠氮和末端炔基标记。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
（E）-4-（3-（2-（2-（2--叠氮基乙氧基）乙氧基）乙氧基）丙-1-烯-1-基）苯酚（<强>H<亚>AZ）			合成为Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017， 24， 3， 326-338
（E）-4-羟基-3-炔丙氧基肉桂醇（<强>G<亚>亚<亚>）			细胞化学生物学 2017， 24， 3， 3<326-338/em
>2% 次氯酸
20 cm 高玻璃管
250 mL Schott 玻璃瓶
48 孔板
5/6-TAMRA-PEG3-叠氮化	Jena Bioscience	CLK-AZ109-1
铝箔
干酪布
含粘土
针叶醇 （<强>G）	Sigma Aldrich	MFCD00002922
硫酸铜 （II） 五水合
DBCO-PEG4-5/6-羧基罗丹明 110	耶拿生物科学	CLK-A127-1
Milli-Q 超纯水
Eppendorf 1,5 mL
乙醇
籽 （L. usitatissimum L.）
Fluoromount-G™载玻片安装 介质	电子显微镜科学	17984-25
玻璃盖玻片
玻璃显微镜载玻片
生长室	CLF-植物气候		用于 2 周龄的植物培养
生长室	Angelantoni 生命科学		用于 2 个月龄的植物培养
品红色植物培养箱			用于 2 周龄的幼苗培养
甲醇			有毒（SGH02、SGH06、SGH08），在引擎盖下戴手套工作
微量移液器
指甲油
尼康 A1R 共聚焦显微镜	尼康
轨道摇床
Parafilm
p-香豆醇 （H）	碳合成器	FC145653
塑料帽
塑料吸管
			用于 2 个月大的植物培养
剃须刀片
橡皮筋
抗坏血酸
无菌夹具
垂直支撑
Vortex
液体和固体试剂 ½MS
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
MnSO4。H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
盐酸硫胺素.L
吡哆醇.HCl
甘氨酸
烟酸
肌醇 肌醇
蔗糖
MES 水合
物 琼脂