BLISS 是一种用于研究木质素沉积动态的双标记方法。该方法利用合成的单体木质素报告分子，结合SPAAC和CuAAC生物正交点击反应的顺序组合，为深入分析调控木质素生物合成的因素提供了途径 在植株中.
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摘要
摘要
木质素是地球上最丰富的生物聚合物之一，也是木质纤维素生物质的主要组分。这种酚类聚合物在高等植物的生长发育及生命过程中发挥着重要的结构和保护作用。尽管调控木质素化过程的复杂机制 体内 对许多植物源产品的工业价值具有重要影响，科学界在解析这些过程方面仍有很长的路要走。本文介绍的双重标记方案通过一个简单的三步工作流程，实现了对植物组织中活跃木质化区域的生物成像研究。第一步是将两种独立的化学报告分子——分别作为天然单体木质醇（可形成木质素H单元和G单元）的替代物——通过代谢方式引入植物体内。当这些报告分子被整合到生长中的木质素聚合物后，第二步和第三步则通过连续的生物正交SPAAC/CuAAC点击反应，各自特异性地与相应的荧光探针结合。结合木质素的自发荧光，该方法可通过共聚焦荧光显微镜生成植物细胞壁内木质素的三色定位图谱，从而在组织、细胞以及不同细胞壁层次上，精确提供活性木质化机制存在与否的空间信息。
引言
在过去的二十年中，化学报告分子策略已发展成为一种强大的两步法，用于研究非遗传编码生物分子的动态变化和功能。1,2,3 在该策略中，首先将目标生物分子的合成类似物（带有微小修饰——即化学报告分子）被活体生物代谢；随后，通过生物正交点击化学反应，将一个化学探针（例如，用于共聚焦荧光显微成像的荧光团）共价连接到已整合的报告分子上。该探针必须能够快速且特异性地与引入的化学修饰发生反应，同时对生物体内存在的任何生物分子保持惰性。在许多方面，该方法通过采用高度特异性的点击化学连接反应，克服了传统生物偶联技术的局限性，从而提供了在活体系统中追踪以往难以检测的代谢物或生物大分子的机会。4,5,6
尽管这种强大方法在细菌和动物细胞中的应用日益广泛，但在植物生物学中描述其应用的报道却出人意料地稀少7,8,9,10,11,12。我们特别感兴趣的是将这一策略应用于植物，以研究木质素的形成。木质素是地球上最丰富的生物聚合物之一，也是木质纤维素生物质的主要组分13,14。木质素是一种酚类聚合物，在高等植物的发育和生命过程中发挥着重要的结构和保护作用。
木质素通常由三种4-羟基苯基丙烷结构单元组成：H单元（p-羟苯基）、G单元（愈创木基）和S单元（紫丁香基），它们分别来源于三种“单木质醇”（p-香豆醇、松柏醇和芥子醇），这些单木质醇通过细胞质中的苯丙烷代谢途径合成（图1）。单木质醇被转运至细胞壁后，在过氧化物酶或漆酶的作用下被氧化为自由基，随后通过纯粹的化学自由基偶联反应聚合形成木质素聚合物，该过程称为木质化。15,16 尽管木质素对许多植物源性产品的工业利用具有重要影响，但科学界在解析调控木质化过程的复杂机制方面仍任重道远。
图1：植物细胞中的木质化过程。 单体木质醇在细胞质中由苯丙氨酸生物合成。单体木质醇被转运至细胞壁后，由过氧化物酶或漆酶氧化为自由基，随后通过纯粹的化学自由基偶联反应聚合形成木质素聚合物，该过程称为木质化。请点击此处查看该图的放大版本。
尽管关于利用生物正交反应进行聚糖分析的报道很多，2,3,17 它们在其他类型生物分子中的应用实例较少。利用生物正交化学进行木质素生物成像的研究直至最近才由 Tobimatsu 首次开创 等8 在 拟南芥 以提供关于松柏醇替代物掺入形成G单元的木质素聚合物中的信息，8,9 从而证明了化学报告策略在此背景下应用的概念验证。几个月后，Bukowski 使用另一种松柏醇衍生物，也展示了铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）的应用。 等.9 然而，木质素还含有H单元和S单元，要更深入地理解木质化过程，还需进一步了解所有单体木质醇如何被整合到聚合物中，以及哪些因素可能调控其组成。目前该领域的最新进展依赖于开发出能够在活体系统中同时追踪多种化学示踪剂的有效方法。尽管近年来已有少数关于多糖的研究奠定了基础18,19,20,21,22，双标记方法在生物正交化学中仍然是一个主要挑战。如果一种可重复的单标记点击化学方案都难以开发，那么需要同时优化两种分别作用于不同化学报告分子且相互兼容的生物正交反应的双标记方法则更加困难。在此方面仅有少数先驱性实例，采用了环张力促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）与烯烃-四嗪逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（DA）相结合的策略侵袭相关蛋白（inv））反应用于动物细胞中糖类的研究。然而，我们认为，由于木质素的结构特征（由富电子取代的肉桂醇类单体组成，可与缺电子二烯烃发生反应，例如DAinv反应中使用的四嗪探针），DAinv反应在此应用中的生物正交性可能无法得到保证，可能导致非特异性标记。此外，DA侵袭 反应需要化学手性基团，而这些基团在合成上难以获得，且具有体积大和亲脂性强的特点，因而可能影响化学报告分子的掺入速率、转运和/或定位 体内 可能会受到影响。鉴于我们认为后一方面在利用点击化学方法研究木质化时尤为关键，我们选择了另一条技术路径，并开发了一种生物正交连接成像顺序策略（Bioorthogonal Ligation Imaging Sequential Strategy,BLISS) 使用应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）与铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）相结合的方法 体内23
这两种反应确实是迄今为止所使用的两种主要生物正交点击反应，尤其在最近发表的少数木质素成像实例中得到了应用。8,9 我们的双重标记策略可在一种单木质醇报告分子上引入叠氮基团，而在另一种上引入端炔基团。这两种化学标记基团具有以下特点：i）对生物体系中的相关结构不发生反应；ii）体积非常小（图2）。因此，这些合成修饰对所研究生物分子理化性质的影响被降至最低，从而在代谢整合过程中，减少了非天然与天然单木质醇底物在转运和代谢速率方面可能出现的差异。尽管SPAAC与CuAAC的联用策略初看之下非常直观，但据我们所知，这仅是该策略的第二个双重标记应用实例，也是首次将其应用于聚糖以外的结构。12,23
图2：BLISS双标记策略。 化学探针HAZ和GALK是天然H型和G型单木质醇的标记类似物。首先通过外源添加的方式将其掺入细胞壁中正在合成的木质素聚合物中（步骤1）。随后，环辛炔和叠氮功能化的荧光探针通过生物正交点击化学反应依次连接到已掺入的探针上：SPAAC反应（步骤2）对HAZ单元具有高度特异性，随后进行CuAAC反应（步骤3），该反应特异性识别GALK单元（步骤3），从而实现在同一样本中对两种探针的独立特异性定位。请点击此处查看该图的放大版本。
我们首先设计并验证了叠氮标记的单体木脂素报告分子 HAZ （替代物） p-香豆醇（木质素H单元的前体），随后设计了BLISS双标记策略，将其与先前报道的炔基标记物联用 GALK,9 （松柏醇的替代物及木质素G单元的前体）。在亚麻这一具有重要经济价值的植物中开发并验证的这一可重复实验方案，实现了双代谢整合 HAZ 和 GALK 进入木质素的标记首先在顺序进行SPAAC/CuAAC标记之前完成。此处，已标记的 HAZ 单位首先被特异性标记 通过 通过SPAAC反应连接环辛炔功能化的荧光染料，随后通过CuAAC介导的连接反应将第二种荧光探针连接至标记位点 GALK 单位。该方法可用于研究植物细胞壁中木质化过程的动态变化，并可被应用于 体内 茎的横切面、活体茎以及不同植物物种的幼苗。
方案
注意：液体和固体½ MS培养基必须按照补充表1中的描述预先配制。
1. 植物培养
- 培养两个月大的亚麻植株
- 将亚麻（Linum usitatissimum L.）种子播种于塑料盆中，使用盆栽培养土。
- 在22 °C条件下，于人工气候室中培养亚麻，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。
- 植株生长1个月后提供垂直支撑，继续培养至2个月大。
- 培养两周大的亚麻幼苗
- 将12粒亚麻种子用一块纱布包裹，并用橡皮筋扎紧形成一个种子包。
注意：后续操作需在超净工作台的无菌条件下进行。 - 将种子包放入已预先高压灭菌的250 mL玻璃瓶中。
- 向瓶中加入70 mL 70%乙醇，轻轻搅拌1分钟。
- 小心倾去乙醇溶液，保留种子包在瓶内。
- 加入100 mL 2%次氯酸钠溶液，轻轻搅拌10分钟。
- 倾去次氯酸钠溶液，保留种子包在瓶内。
- 重复步骤1.2.5–1.2.6。
- 加入100 mL无菌超纯水，搅拌1分钟。
- 重复步骤1.2.8共3次，每次冲洗时间逐渐延长（5、10和15分钟）。
- 加热融化½ MS固体培养基，倒入无菌植物培养盒中，厚度约为2 cm，静置冷却至凝固。
- 用无菌镊子小心将每粒种子放置于固体培养基表面。
- 盖上培养盒盖子。
- 将培养盒转移至22 °C的人工气候室中，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，培养亚麻幼苗2周。
- 将12粒亚麻种子用一块纱布包裹，并用橡皮筋扎紧形成一个种子包。
2. 化学报告分子的代谢整合
注意：以下展示了三种实验模型：i）茎横切面的代谢标记，ii）整段茎，以及 iii）植物幼苗。每种实验方案均以一个生物学重复为例进行描述，所需试剂用量可根据实际所需的生物学重复数量进行调整。单木质醇溶液由实验前按照表2所述方法配制的储备液稀释而成。储备液可在-20 °C下保存数月。可根据自定义实验设计调整HAZ:GALK 或 H:G 的比例。
- 化学探针在两个月大亚麻茎横切片中的掺入
- 在300 µL液体无菌½ MS培养基中配制含有10 µM GALK 和10 µM HAZ 的化学探针溶液。
- 涡旋混匀 HAZ/GALK 溶液，并用微量移液器将其转移至48孔板中的一个孔中。
- 在300 µL液体无菌½ MS培养基中配制含有10 µM G 和10 µM H 的阴性对照溶液。
- 涡旋混匀 H/G 溶液，并用微量移液器将其转移至同一48孔板的第二个孔中。
- 使用新的剃须刀片在距土壤表面10 cm处切断两个月大的亚麻植株的茎。
- 使用剃须刀片小心地手工制备约50个茎的横切面（厚度约为150–250 µm）。
- 立即将切片放入盛有液体无菌½ MS培养基的培养皿中。
- 肉眼检查并选择完整无损的横切面，随机将其中10个放入含有 HAZ/GALK 溶液的孔中。
- 对装有 H/G 溶液的孔重复步骤2.1.8（作为阴性对照）。
- 对第三个装有300 µL ½ MS培养基的孔重复步骤2.1.8（作为背景对照，用于后续共聚焦显微镜图像数据处理时调整荧光基线）。
- 将培养板置于20 °C的生长室中，在持续光照条件下孵育20小时。
- 用微量移液器吸除各孔中的单木质醇溶液。
- 向每个孔中加入500 µL ½ MS培养基，轻轻搅拌10分钟，然后用微量移液器吸除清洗液。重复此清洗步骤4次，并立即进行BLISS标记（第3节）。
- 化学探针在两个月大亚麻完整茎中的掺入
- 在5 mL液体无菌½ MS培养基中配制含有10 µM GALK 和10 µM HAZ 的化学探针溶液。
- 涡旋混匀 HAZ/GALK 溶液，并用移液器将其转移至一个20 cm高的玻璃试管中。
- 在5 mL液体无菌½ MS培养基中配制含有10 µM G 和10 µM H 的阴性对照溶液。
- 涡旋混匀 H/G 溶液，并将其转移至另一个20 cm高的玻璃试管中。
- 准备第三个玻璃试管，其中装有5 mL ½ MS培养基（作为背景对照，用于后续共聚焦显微镜图像数据处理时调整荧光基线）。
- 使用新的剃须刀片在距土壤表面10 cm处切断两个月大的亚麻植株的茎。弃去根系和茎的下部，使用植株茎的上部进行下一步操作。
- 将完整切下的茎基部浸入含有 HAZ/GALK 溶液的试管中。在去除根系后应立即将茎放入孵育溶液中，以防止其干燥。
注：若该方法应用于更年轻或更年长的植株和/或其他物种，单木质醇溶液的体积需根据植株大小/年龄及其茎直径进行调整。 - 将茎固定在垂直支撑物上以保持其直立。
- 用Parafilm封口膜密封玻璃试管，防止溶液蒸发。
- 对使用 H/G 溶液的阴性对照样品重复步骤2.2.6–2.2.9。
- 对含有½ MS培养基的荧光背景对照样品重复步骤2.2.6–2.2.9。
- 将每根茎在持续光照的氖灯下孵育20小时。
- 经过20小时的代谢掺入后，取出在 HAZ/GALK 溶液中孵育的茎，并用½ MS培养基冲洗。
- 用剃须刀片切去茎底部1 cm并弃去，然后从剩余茎的基部制备一个高1 cm的圆柱体。
- 从此圆柱体小心地手工制备20个横切面（厚度约为150–250 µm），并立即放入盛有½ MS培养基的培养皿中。
- 在48孔板的一个孔中加入500 µL ½ MS培养基。
- 肉眼检查并选择完整无损的横切面，随机将其中10个放入装有½ MS溶液的孔中。
- 对在 H/G 溶液中孵育的阴性对照茎重复步骤2.2.13–2.2.17。
- 对在½ MS培养基中孵育的荧光背景对照茎重复步骤2.2.13–2.2.17。
- 小心地用微量移液器吸除各孔中的溶液。
- 向每个孔中加入500 µL ½ MS培养基，轻轻搅拌10分钟，然后用微量移液器吸除清洗液。重复此清洗步骤4次，并立即进行BLISS标记（第3节）。
- 化学探针在两周大亚麻幼苗中的掺入
注：以下所有步骤均在无菌条件下进行。- 在2 mL液体无菌½ MS培养基中配制含有10 µM GALK 和10 µM HAZ 的化学探针溶液。
- 涡旋混匀 HAZ/GALK 溶液，并用移液器将其转移至一个20 cm高的玻璃试管中。
- 在2 mL液体无菌½ MS培养基中配制含有10 µM G 和10 µM H 的阴性对照溶液。
- 涡旋混匀 H/G 溶液，并将其转移至另一个20 cm高的玻璃试管中。
- 准备第三个20 cm高的玻璃试管，其中装有2 mL ½ MS培养基（作为背景对照，用于后续共聚焦显微镜图像数据处理时调整荧光基线）。
- 使用长镊子小心地从固体½ MS培养基中取出一株两周大的亚麻幼苗（见上文第1.2节）。
- 轻柔地将幼苗转移至含有 HAZ/GALK 溶液的试管中，确保其根部浸没在溶液中。
- 用塑料盖封闭玻璃试管，防止溶液蒸发。
- 对装有H/G溶液的阴性对照试管重复步骤2.3.6–2.3.8。
- 对装有½ MS培养基的荧光背景对照试管重复步骤2.3.6–2.3.8。
- 将每株幼苗置于20 °C的生长室中，在持续光照条件下孵育20小时。
- 小心取出在 HAZ/GALK 溶液中孵育的幼苗，并用½ MS培养基冲洗。
- 小心地手工制备下胚轴的20个横切面（厚度约为150–250 µm）。
- 在48孔板的一个孔中加入500 µL ½ MS培养基。
- 肉眼检查并选择完整无损的横切面，随机将其中10个放入装有½ MS溶液的孔中。
- 对在 H/G 溶液中孵育的阴性对照幼苗重复步骤2.3.12–2.3.15。
- 对在½ MS培养基中孵育的荧光背景对照幼苗重复步骤2.3.12–2.3.15。
- 小心地用微量移液器吸除各孔中的溶液。
- 向每个孔中加入500 µL ½ MS培养基，轻轻搅拌10分钟，然后用微量移液器吸除清洗液。重复此清洗步骤4次，并立即进行BLISS标记（第3节）。
3. 通过SPAAC和CuAAC对植物横截面样本进行双重荧光标记
注意：BLISS标记方案在所有3种实验模型中均相同（第2节）。
- 应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）标记
- 制备1 mL SPAAC溶液，其中含有5 µM DBCO-PEG4-5/6-羧基罗丹明110，溶于液体无菌½ MS培养基中。涡旋混匀后避光保存。
- 在代谢标记实验的最终洗涤步骤完成后（根据所选实验设计，参见步骤2.1.13、2.2.21或2.3.19），吸除½ MS培养基，使用移液器向每孔加入300 µL SPAAC溶液。
- 用铝箔包裹48孔板或将其置于盒中，以避光。
- 将孔板置于机械摇床上，在室温下避光轻柔振荡反应1小时。
- 铜催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）标记
- 按照步骤2.1.13所述方法，在避光条件下对每孔进行4次洗涤。
- 制备1 mL CuAAC溶液，其中含有2.5 mM抗坏血酸钠、0.5 mM CuSO4和5 µM 5-TAMRA-PEG3-叠氮，溶于液体无菌½ MS培养基中。涡旋混匀后避光保存。
注意：该CuAAC溶液必须在使用前新鲜配制，于4 °C保存不得超过数天。 - 吸除每孔中的½ MS培养基，使用移液器直接向每孔加入300 µL CuAAC溶液。
- 将孔板置于机械摇床上，在室温下避光轻柔振荡反应1小时。
- 使用移液器吸除CuAAC溶液。
- 使用移液器向每孔加入500 µL ½ MS培养基，避光振荡10分钟，然后吸除洗涤液。重复该步骤两次。
- 加入500 µL 7:3甲醇/水溶液，避光振荡1小时后吸除溶液。
警告：甲醇可通过皮肤接触或吸入产生毒性，被列为人类致癌物。使用时必须在通风橱中操作并佩戴手套。 - 加入500 µL ½ MS培养基，避光振荡10分钟，然后吸除溶液。重复该步骤4次。
4. 将样品装载到显微镜载玻片上
- 在玻璃显微镜载玻片上滴加 5 滴封片介质。
- 小心地将每个 HAZ/GALK 标记的横切面放置在载玻片上。
- 在载玻片相对的两侧涂上指甲油。
- 用盖玻片覆盖载玻片，注意避免产生气泡。
- 用纸巾吸除多余的封片介质。
- 在载玻片四周均用指甲油密封，并在室温下静置晾干（约 30 分钟）。
- 对阴性对照 H/G 横切面重复步骤 4.1–4.6。
- 对荧光背景对照横切面重复步骤 4.1–4.6。
- 将载玻片置于 4 °C 避光保存，直至进行共聚焦显微镜观察。
注意：制备好的载玻片可根据制备质量保存数周至数月。若在保存后需重新观察，请确保样品未干燥。
5. 荧光共聚焦显微镜图像采集
- 根据制造商的说明，按正确顺序开启共聚焦显微镜系统的所有必要组件。
- 选择具有最大数值孔径且适用于所需激发和发射波长的物镜（例如，60倍物镜，数值孔径1.2；自发荧光通道：λex 405 nm，λem 450 nm /25；SPAAC HAZ 通道：λex 488 nm，λem 525 nm /25；CuAAC GALK 通道：λex 561 nm，λem 595 nm /25；采用顺序扫描模式）。
- 在软件中设置所需的成像参数（需使用12位或16位图像，像素大小应符合奈奎斯特准则）。
- 将 HAZ/GALK 样本载玻片放置于显微镜载物台上，并将样本定位至物镜下方。
- 观察并找到植物组织中感兴趣的区域。
- 采集双标记 HAZ/GALK 样本的高质量共聚焦图像。
- 在Z轴方向选择荧光信号最强的焦平面。
- 调节增益、偏移和激光功率，使每个通道（自发荧光、HAZ 和 GALK）的信号在整个灰度范围内达到最佳分布。后续所有图像采集必须使用相同的参数设置。
- 开始采集选定图像并保存文件。对样本中每个相关区域重复此步骤。
注意：如有需要，也可采集三维Z层叠重建图像。
- 使用相同的成像参数，采集仅在½ MS培养基中孵育的未标记样本图像，以确定自发荧光水平（即第2节所述的荧光背景对照）。
- 使用相同的成像参数，采集经天然单体木质素前体 H/G 孵育的阴性对照样本图像，以评估荧光探针在样本上的非特异性吸附情况。
- 对所采集的图像进行数据处理，从 H/G 阴性对照图像和 HAZ/GALK 图像中扣除背景自发荧光信号。
结果
通过使用本研究所提出的BLISS方案，结合合成的单木质素醇类似物与生物正交点击化学反应，可在活体植物中可视化木质化过程的动态变化。与现有的木质素可视化技术（如组织化学染色、免疫定位或自发荧光）不同，该“双点击”方案仅特异性标记新合成的木质素 从头合成 在代谢标记步骤中，通过共聚焦荧光显微镜的三通道细胞成像，将其与样品中预先存在的木质素区分开来（图3). HAZ- 使用 DBCO-PEG 的激发和发射波长检测信号单位4-5/6-羧基罗丹明110，特异性点击连接至掺入的叠氮基团 HAZ SPAAC 步骤中的分子（λex 501 nm /λem 526 nm，绿色通道），而 GALK-单位在叠氮荧光探针 azidefluor 545 的特征波长处被类似地检测到，该探针特异性地点击连接至整合的末端炔烃标签 GALK 在CuAAC步骤期间（λex 546 nm /λem 565 nm，红色通道）；第三通道对应于预先存在的木质素，通过其在405 nm处的固有自发荧光（蓝色通道）进行检测。该方法可生成植物细胞壁中木质素的三色定位图谱，提供器官不同组织间活性木质化机制存在与否的精确空间信息图3A），同一组织内不同细胞类型之间的差异（图3B- C）以及同一细胞不同壁层之间（图 3D）。换句话说，该方法可使我们突出并特异性定位“活性”木质化位点（HAZ 和 GALK 通道），将其与植物发育早期阶段形成木质素的区域（自发荧光通道）区分开来。此外，与自发荧光相比，该技术的灵敏度显著提高，能够检测到更微量的新合成木质素（图3B).
图3：亚麻茎中掺入的单体木质素化学探针成像。（A）亚麻茎手工制备的横切面一半，重建图像。（B）分化中木质部最外层的放大图。左图：木质素自发荧光（蓝色，405 nm）；中图：木质素自发荧光（蓝色）与HAZ 荧光（绿色，526 nm）通道叠加；右图：木质素自发荧光（蓝色）与GALK荧光（红色，565 nm）通道叠加。箭头指示从形成层开始第一个被标记的细胞壁，显示BLISS技术相比自发荧光具有更高的灵敏度。（C）次生木质部不同细胞类型的标记情况，以及（D）次生木质部细胞的放大图，展示同一细胞壁不同层次中的标记差异。左图：木质素自发荧光（蓝色）与HAZ荧光（绿色，526 nm）通道叠加；中图：木质素自发荧光（蓝色）与GALK荧光（红色，565 nm）通道叠加；右图：木质素自发荧光（蓝色）、HAZ（绿色）和GALK（红色）荧光通道叠加。HAZ 与GALK共定位显示为黄色。请点击此处查看该图的放大版本。
因此，化学报告分子策略（例如本文介绍的BLISS方法或Tobimatsu et al.8 之前发表的单标记方法）相较于以往的免疫组织化学或组织化学染色方法，能够在实验操作极为简便的前提下实现更为精细的研究。例如，图4 显示，在亚麻次生木质部的纤维管胞/导管（FT）中，HAZ/GALK 的掺入信号强度在形成层附近的最初几层细胞壁中非常高，但在更老的细胞中则逐渐减弱。该分布模式与自发荧光的模式相反，表明在距形成层最近的两到三层FT细胞中，木质素化程度能够极快地达到峰值。相比之下，射线（R）细胞似乎在其发育的较晚阶段仍持续进行木质素化，因为从形成层到髓部的所有射线细胞壁中，HAZ/GALK 的掺入水平更为恒定。FT和R两类细胞表现出截然不同的木质素化动态并不令人意外，因为这两类细胞具有不同的生物学功能，其发育程序也相应存在差异。事实上，FT是细长的管状结构，成熟后迅速死亡，留下具有厚木质化细胞壁的死细胞，在机械支撑以及水分和矿物质的纵向运输中发挥关键作用；而构成木质射线的狭行长排R细胞在其成熟且具有功能的状态下仍保持存活，且不具有厚的木质化细胞壁。
图 4：亚麻木质部中单体木质素报告分子的细胞特异性掺入。 亚麻茎手工横切面部分的明场共聚焦显微镜图像（A）。粉红色（射线薄壁细胞，R）和黄色（纤维管胞细胞，FT）箭头表示从形成层区域指向髓部的扫描方向，用于检测405 nm处的木质素自发荧光（B）、526 nm处HAZ的荧光（C）以及565 nm处GALK的荧光（D）。（E）次生木质部视图。左侧面板：木质素自发荧光（蓝色）、HAZ（绿色）和GALK（红色）荧光通道的合并图像。HAZ与GALK的共定位显示为黄色。右侧面板：亚麻茎中次生木质部结构的示意图。V，导管；FT，纤维管胞；R，射线薄壁细胞。该图改编自 Lion et al.23 请点击此处查看此图的放大版本。
此外，在BLISS方案中使用两种分别对应H单元和G单元的特异性化学探针以及两种生物正交反应，可以获得更定量的结果。诸如BLISS之类的多重标记策略，可为进一步理解不同条件下单木质醇掺入比例的调控机制提供新见解，并有助于解析尚不明确的木质化过程。尽管木质素中H、G和S三种单木质醇的相对百分比确实会因植物种类、组织类型、发育阶段或环境条件的不同而表现出高度变异，但调控这种组成变化的复杂机制仍未被完全阐明。双标记技术为研究调控木质素组成的一些关键参数提供了有力手段。例如，通过BLISS技术调节HAZ:GALK比例，我们证实了次生木质部组织中的木质素组成直接取决于细胞壁内单木质醇的可利用性，而非依赖于过氧化物酶/漆酶的底物特异性（图5）。
图 5：不同 HAZ 与 GALK 百分比比例处理亚麻茎切片的效果。 各图列上方标示了 HAZ:GALK% 的比例。顶部：HAZ 与 GALK 通道的合并图像。底部：不同百分比比例下 HAZ 与 GALK 平均荧光强度的直方图。数值以灰度级平均荧光强度的均值 ± 标准差表示。比例尺 = 100 µm。 本图改编自 Lion et al.23 请点击此处查看此图的放大版本。
亚麻因其韧皮纤维（BF）而被种植，这些纤维可用于制造纺织品、高档纸张或环境友好型复合材料。其工业价值的一个重要方面在于，其细胞壁中木质素含量极低，且具有异常增厚的S2/G次生层19,24。BLISS技术能够揭示同一细胞壁不同层次之间木质化动态的差异。图6A显示，HAZ 和 GALK 报告分子的掺入仅限于部分而非全部韧皮纤维的细胞角隅以及中胶层/初生细胞壁。即使外源提供单体木质素化学报告分子，厚韧皮纤维次生细胞壁层中仍完全缺乏木质化，这表明其低木质化状态源于缺乏适合单体木质素通过酶促氧化并掺入生长中聚合物链的分子环境，而不仅仅是如先前报道所述由单体木质素生物合成基因的转录调控所致25。该观察结果也与以下事实高度一致：在木质化韧皮纤维的亚麻化学突变体 lbf1 中，亚麻过氧化物酶基因在外层茎组织中呈上调表达26。
图6：BLISS技术揭示细胞壁亚结构或特定层之间的差异。（A）左图：亚麻茎切片的明场图像。圆圈指示一个纤维束。右图：韧皮纤维的放大图。合并的HAZ与GALK通道图像（含或不含明场）显示，木质化仅限于细胞角（
）以及部分韧皮纤维的中层/初生细胞壁。BF，韧皮纤维；Par，薄壁细胞；M，中层；P，初生细胞壁；S1，次生细胞壁第一层；S2/G，次生细胞壁的次生层/胶质层。（B）亚麻根内皮层区域共聚焦z轴堆栈图像的二维切片与三维重建。凯氏带（）仅显示自发荧光，不掺入HAZ或GALK信号。相应的荧光图谱显示GALK/HAZ呈负相关：高绿色荧光对应低红色信号（皮层），反之亦然（内皮层）。Pericycle（P），内皮层（E），皮层（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
最后，这种双色标记方法还可为不同发育阶段及非茎部植物器官中细胞壁亚结构的“木质化状态”提供有价值的信息。例如，亚麻根的内皮层在发育早期，其径向和横向细胞壁中存在凯氏带。这种由木栓质和/或木质素构成的疏水性生物聚合物带可阻止根系吸收的水分和溶质通过质外体途径被动进入，迫使它们必须穿过质膜，经共质体途径运输，从而增强植物根系对物质的选择性吸收能力。当该方法应用于亚麻根时，我们的研究策略显示，HAZ 和 GALK 被整合至内皮层细胞的切向壁以及凯氏带不存在的径向壁部分（图6B）。然而，凯氏带本身完全未检测到单体木质素报告分子的掺入，表明在此发育阶段该结构已成熟，而其他细胞壁仍处于持续的生物聚合物沉积过程中。z轴层扫数据的三维重建视图清晰地揭示了凯氏带的结构。有趣的是，部分紧邻内皮层的皮层细胞壁也能够优先掺入 HAZ（表明亚麻根皮层中存在木质素/木栓质），但不能掺入 GALK。共定位分析显示 HAZ 与 GALK 之间存在负相关性，提示这两种相邻细胞类型可能具有细胞特异性的细胞壁结构或酶系统。
补充表1：固体½ MS培养基的制备 请点击此处下载该文件。
补充表 2：化学探针储备液的制备 请点击此处下载该文件。
讨论
如前所述，本文介绍的双重标记BLISS方案是首例将SPAAC与CuAAC相结合的方法之一 体内12,23每一步均经过充分优化和验证，必须严格遵守两种点击化学标记反应的依次操作顺序（即先进行SPAAC反应，再进行CuAAC反应）。所有交叉对照结果表明，在应用BLISS方案时，每个标记步骤均具有特异性。23 ：先进行SPAAC步骤可实现对目标分子的高度化学选择性标记 HAZ 叠氮基团通过与环辛炔功能化的荧光染料发生具有快速动力学的[3+2]环加成反应而发挥作用。一旦 HAZ 单位被标记后，需要通过铜(I)催化的活化进行CuAAC步骤 GALK 末端炔烃可通过与叠氮荧光染料 545 探针反应生成三唑键。相反，若采用相反顺序（即先进行 CuAAC 反应，再进行 SPAAC 反应）则不可取，因其会导致 GALK 和 HAZ 单元交叉偶联会与荧光团连接反应竞争，并导致信号显著降低。还需强调中间洗涤步骤的必要性，以避免非特异性染色。
我们已证明，该方法可应用于多种生物学实验设计。BLISS标记方案最初应用于亚麻茎的徒手切片（厚度约为150–250 µm），这些切片在切割后已预先与可点击的单体木素（monolignols）孵育。尽管该设计具有减少化学探针用量（因孵育体积较小）以及便于进行统计重复实验的优点，但严格来说，它并非一种in vivo体系，在某些情况下可能无法完全反映真实的时空木素化动态过程。因此，在第二种实验设计中，我们对BLISS方案进行了调整，采用了一种先前用于研究放射性标记单体木素在松树和银杏中掺入情况的方法27。在此方法中，将植物的根系与茎干进行物理分离，将整段茎的基部浸入单体木素溶液中，该方法可被称为“花瓶法”。在茎段完成所需（孵育）时间后，切取横截面并执行BLISS方案。该实验使我们得以证明：（i）修饰后的单体木素可通过活体茎干运输，并掺入细胞壁中正在生长的木素聚合物内；（ii）其定位模式与横截面方法基本一致。此类实验的优点在于可在真正的活体植物/活细胞体系中进行，适用于更长时间的实验和更深入的研究，但需要使用更多的化学探针。最后，BLISS方案还被应用于亚麻幼苗，这是一种真正的活体植物模型，其中化学探针需经根部吸收后向上运输至茎部。尽管该模型明显具有在活体植物中进行实验的优势，但在实际操作中，它仅适用于幼嫩的幼苗，且由于实际原因（孵育时间长、所需化学探针用量大），并不适合用于研究较老植株的木素化动态过程。尽管如此，这三种实验设计互为补充，各自在实际操作性和生物学意义方面均具有优缺点，具体选择应根据所要回答的生物学问题而定。
本方案最初为研究亚麻的木质化动态而开发，具有高度的可适应性，不仅在生物学实验设计方面，而且在应用于其他植物物种及器官/组织方面均表现出良好的通用性。例如，BLISS 方法可轻松拓展至拟南芥（Arabidopsis）或杨属（Populus）等更适用于多种基因敲除或基因沉默突变体研究的物种。原则上，通过使用两种不同的植物细胞壁聚合物修饰前体，该方法还可进一步扩展至其他生物分子的双标记研究——包括全部三种主要的单木质醇及其代谢前体，以及构成多糖基质的各种单糖。自诞生以来，生物正交化学主要被用于通过代谢寡糖工程（MOE）研究聚糖/多糖4,5,17,28，但令人意外的是，其在植物生物学中的应用至今仍极为有限7,8,9,10,11,12。从反应兼容性的角度来看，木质素的研究确实是一个复杂的难题，因为两种化学探针均被整合到同一种网状聚合物中。未标记的HAZ-GALK交联形成的可能构成了主要的技术障碍，这是由于GALK和HAZ单元在木质素三维结构中空间位置极为接近所致23；而若两种化学探针未被整合至同一类型的生物聚合物或细胞内同一空间区域，则该限制可能不存在。
从更广泛的角度来看，BLISS方法原则上可应用于任何使用两种不同化学报告分子（分别带有叠氮和末端炔基标签）的细菌或动物模型双色荧光成像研究。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢研究联合会 FRABio 和 TisBio 成像平台（里尔大学，CNRS，FR 3688，FRABio，生物大分子组装的结构与功能生物化学）为完成本工作提供了有利的技术环境。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (E)-4-(3-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙-1-烯-1-基)苯酚<强>HAZ) | 如 Lion 中所述合成 等. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
| (E)-4-羟基-3-丙炔氧基肉桂醇 (<强>GALK) | 如 Lion 中所述合成 等。《细胞化学生物学》2017年，24卷，3期，326-338页 | ||
| 2% 次氯酸钠 | |||
| 20 cm高的玻璃管 | |||
| 250 mL 肖特玻璃瓶 | |||
| 48孔板 | |||
| 5/6-TAMRA-PEG3-叠氮化物 | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
| 铝箔 | |||
| 纱布 | |||
| 含黏土的堆肥 | |||
| 松柏醇（<强>G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
| 五水合硫酸铜（II） | |||
| DBCO-PEG4-5/6-羧基罗丹明110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
| Milli-Q超纯水 | |||
| Eppendorf 1.5 mL | |||
| EtOH | |||
| 亚麻籽（L. usitatissimum L.) | |||
| Fluoromount-G™ 封片剂 | 电子显微镜科学公司 | 17984-25 | |
| 玻璃盖玻片 | |||
| 载玻片 | |||
| 生长室 | CLF-植物气候学 | 对于2周龄植物的培养 | |
| 生长室 | 安杰朗塔尼生命科学 | 对于2个月大的植株培养 | |
| Magenta 植物培养盒 | 对于2周龄幼苗培养 | ||
| 甲醇 | 有毒（SGH02、SGH06、SGH08），需在通风橱内戴手套操作 | ||
| 微量移液器 | |||
| 指甲油 | |||
| 尼康A1R共聚焦显微镜 | 尼康 | ||
| 轨道摇床 | |||
| Parafilm | |||
| p-香豆醇（Coumaryl alcohol）<强>H) | Carbosynth | FC145653 | |
| 塑料盖 | |||
| 塑料移液管 | |||
| 塑料盆 | 对于2个月大的植株培养 | ||
| 剃刀刀片 | |||
| 橡皮筋 | |||
| 抗坏血酸钠 | |||
| 无菌钳 | |||
| 垂直支撑 | |||
| 涡旋 | |||
| <强>液体和固体试剂 ½ MS培养基 | |||
| KH2PO4 | |||
| KNO3 | |||
| NH4一氧化氮3 | |||
| MgSO₄4.7H2O | |||
| CaCl20.2H2O | |||
| MnSO₄4.2O | |||
| ZnSO₄4.7H2O | |||
| H3BO3 | |||
| KI | |||
| Na2MoO4.2H2O | |||
| CuSO₄40.5H2O | |||
| CoCl2.6H2O | |||
| Na2EDTA·2H₂O2O | |||
| FeSO4.7H2O | |||
| 硫胺素盐酸盐 | |||
| 盐酸吡哆醇 | |||
| 甘氨酸 | |||
| 烟酸 | |||
| 肌醇 | |||
| 蔗糖 | |||
| MES 水合物 | |||
| 琼脂 |
参考文献
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