可视化血管紧张素II输注小鼠中白细胞滚动与黏附：技术与注意事项

摘要

本论文描述了在血管紧张素II诱导的高血压模型中，利用转基因报告小鼠和不同途径给予荧光染料，通过活体视频显微镜观察血管，评估免疫细胞的活化状态及其在血管内皮上滚动与黏附的能力。

摘要

利用落射荧光活体视频显微镜（IVM）观察血管是评估免疫细胞活化状态及其在内皮层上滚动和黏附能力的成熟方法。通常通过注射荧光染料或荧光素偶联抗体来标记循环细胞以实现可视化。此外，也可使用荧光报告小鼠。白细胞（特别是溶菌酶 M⁺（LysM⁺）单核细胞）与血管壁之间的相互作用在促进血管功能障碍和动脉性高血压过程中发挥关键作用。本文介绍了利用IVM技术在血管紧张素II（AngII）诱导的小鼠高血压模型中，对颈动脉内白细胞滚动与黏附进行可视化和定量分析的方法。

导管植入会损伤血管壁，导致血细胞反应发生改变。我们比较了不同的注射技术和给药途径，以在广泛表达红色荧光蛋白且LysM⁺细胞条件性表达绿色荧光蛋白的LysMCre⁺IRG⁺小鼠中可视化白细胞。为了研究LysM⁺细胞的活化情况，我们采用了血管紧张素II（AngII）输注小鼠模型，该模型中白细胞在内皮上的滚动和黏附增加。我们通过颈静脉导管或直接经尾静脉注射吖啶橙，并比较了滚动和黏附细胞的数量。结果发现，与对照组相比，假输注的LysMCre⁺IRG⁺小鼠在仅植入颈静脉导管后，滚动和黏附的LysM⁺细胞数量即显著增加。这种活化在AngII输注小鼠中进一步增强。有趣的是，在假输注小鼠中，直接通过尾静脉注射吖啶橙并未增加LysM⁺细胞的黏附或滚动。因此，我们证明了在实验过程中，使用表达荧光蛋白的转基因报告小鼠时，必须避免干扰体内生理过程的重要性。此外，尾静脉注射荧光示踪剂可能是颈静脉导管注射的一种可行替代方法。

引言

动脉性高血压会增加心血管疾病和死亡的风险，并促进动脉粥样硬化、冠心病以及动脉或静脉血栓栓塞的发生¹。高血压的发生取决于环境、遗传、内分泌和血流动力学因素之间的相互作用。目前认为，免疫系统及其相关的炎症反应在高血压的病因学中发挥着重要作用²。

在免疫细胞中，T淋巴细胞以及单核细胞和巨噬细胞被发现与血管紧张素II（AngII）诱导的血管炎症和高血压具有因果关系，部分原因在于它们能够触发活性氧的产生³。巨噬细胞集落刺激因子缺乏的小鼠在AngII诱导的血压升高和血管炎症反应中表现出减弱的反应⁴。在之前的研究中，我们已证明LysM+单核细胞在AngII诱导的高血压中驱动血管功能障碍和炎症⁵。最近，我们描述了一条新途径，其中凝血因子XI与血小板和血管壁协同作用，诱导凝血酶依赖性的血管炎症⁶。Rodriguez-Iturbe et al.最近对免疫系统在高血压中作用的现有知识进行了系统总结和综述⁷

自从免疫细胞在高血压发展中的作用变得明确以来，研究血管与免疫细胞相互作用的模型和技术变得必要。血管的落射荧光体内显微成像（epifluorescence IVM）是一种用于观察 体内 循环血细胞与血管内皮之间的相互作用^8,9,10通过该技术，可注射嵌入DNA的染料（如吖啶橙），以观察有核细胞（包括循环中的细胞及内皮来源的细胞）。经染色的分离血小板 离体 可注射罗丹明-6G或二氯荧光素（DCF）以在动脉或静脉损伤模型中可视化富含血小板的血栓。

通常使用颈静脉导管注射示踪剂或标记的血小板。已知内皮的改变以及随之而来的凝血级联反应的激活均会影响单核细胞的活化。内皮损伤会立即通过内皮下基质分子激活血小板以封闭组织，进而吸引并激活单核细胞¹¹。相反，完整的内皮具有抗凝特性（例如，通过组织因子通路抑制物或血栓调节蛋白）¹²，并对单核细胞产生直接抑制作用，例如，通过分泌含有微小RNA的细胞外囊泡¹³。已知单核细胞可产生组织因子（凝血级联反应的外源性激活物），并表达蛋白酶激活受体（PARs），后者可被凝血酶激活并参与单核细胞的活化^14,15。因此，由于血管损伤导致的血小板或凝血级联反应的任何激活，都可能对单核细胞活化产生意想不到的影响，从而干扰所观察到的现象。借助IRG转基因LysM Cre转基因小鼠，即双荧光Cre报告小鼠（LysMCre⁺IRG⁺），我们拟在动脉高血压小鼠模型中，深入研究导管注射及其他替代方法对LysM⁺骨髓单核细胞的影响¹⁶。

方案

实验在8至12周龄的雄性小鼠上进行，已获得莱茵兰-普法尔茨州动物实验伦理委员会批准（批准编号：23 177-07/G12-1-002 和 23 177-07/G15-1-051）。

1. 小鼠麻醉与手术准备

1. 手术前，确认动物的健康状况良好。手术前，每天监测动物 1 次，持续 2–3 天，观察其总体状况（外观、姿势、自发行为）以及体重、食物和水的摄入情况。
2. 配制麻醉用母液，包含咪达唑仑（5 mg/kg 体重）、美托咪定（0.5 mg/kg 体重）和芬太尼（0.05 mg/kg 体重），用 1 mL 注射器配制 200 µL/30 g 小鼠的剂量，使用 26 G 针头进行腹腔内（i.p.）注射。
3. 渗透泵植入及活体显微成像（IVM）实验的动物准备均在配备 39 °C 加热平台的手术区域进行。所有器械需在消毒液中消毒，加热平台也需进行表面消毒。
4. 操作过程中，使用眼膏保护动物的眼睛。在植入渗透泵前，使用剃须刀去除毛发。在 IVM 实验中进行颈动脉和颈静脉导管植入时，使用脱毛膏和棉签进行局部隔离。使用两种皮肤消毒剂对动物皮肤进行消毒：一种含聚维酮碘的抗菌消毒剂，另一种为含醇类奥替尼定的皮肤抗菌剂。 
5. 配制麻醉拮抗剂母液（"antisedan mix"），包含阿替美唑（0.05 mg/kg 体重）和氟马西尼（0.01 mg/kg 体重），用 1 mL 注射器配制 200 µL/小鼠的剂量，使用 26 G 针头进行皮下（s.c.）注射。

2. 渗透压泵的制备与植入

注意：皮下输注血管紧张素II（AngII）使用渗透泵的方法已由 Lu et al.¹⁷ 详细描述。

1. 用无菌生理盐水重悬冻干粉以配制AngII，并根据动物体重和泵的输注速率调整浓度。将重悬后的AngII保存在塑料管中（勿使用玻璃管）。
2. 将AngII溶液注入泵中，使其以1 mg/(kg·d)的剂量持续输注7天。制备完成后，将泵置于无菌生理盐水中，于37 °C孵育至少4–6小时。
3. 注射麻醉混合物后，通过后肢足部反射检测小鼠是否完全麻醉，并将其置于温暖的手术区域。麻醉诱导需10–15分钟，若将动物置于黑暗环境中，麻醉效果更佳。
4. 剃除小鼠下背部毛发，并使用含醇皮肤消毒剂进行消毒。
5. 使用剪刀沿垂直于脊柱方向做1 cm切口。用直止血钳创建一个皮下囊袋，将泵（先插入流量调节器端）置入其中。囊袋应确保泵可自由移动，且不对伤口产生压迫。
6. 使用缝线而非夹子关闭伤口，以减少炎症反应；随后用皮肤消毒剂再次消毒。
7. 皮下注射200 µL拮抗剂混合物以逆转麻醉，并将小鼠放回笼中。
8. 术后给予一次布托啡诺镇痛（0.075 mg/kg，皮下注射），之后根据动物行为按需追加给药。

3. 颈静脉导管植入与颈动脉准备

1. 注射麻醉混合物后，通过后肢足底反射检测小鼠是否完全麻醉，并将麻醉后的小鼠仰卧置于39 °C的手术加热板上 ，同时插入直肠探头以维持体温，并在眼睛上涂抹眼膏以在手术过程中保护角膜。
2. 使用脱毛膏去除颈部毛发。用棉签涂抹并揉搓脱毛膏约2分钟，直至毛发开始脱落。再等待2分钟后，用刮刀清除脱毛膏及脱落的毛发，并用酒精类皮肤消毒剂对皮肤进行消毒。
3. 在体视显微镜下进行手术。沿颈部气管旁1 cm处纵向切开皮肤，切口长度为1–1.5 cm，随后在该切口两端各作一条垂直切口。
4. 小心剥离皮下组织，移除覆盖左侧颈静脉和气管区域的皮肤片。
5. 使用两把弯头镊子仔细分离腮腺、舌下腺和颌下腺，使其远离操作区域。避免切割或损伤这些腺体，将其适当移位以充分暴露颈静脉和颈动脉。
6. 为分离颈静脉，使用细镊子缓慢开合，轻柔地将血管从周围组织中游离出来。待静脉完全暴露后，将镊子置于血管下方，并在其下放置两根各长10 cm的7-0缝线。
7. 将靠近头部一侧的缝线打双结结扎。另一根缝线先打一个活结，暂不收紧。
8. 一手用镊子夹持充满37 °C无菌生理盐水的导管（内径0.28 mm，外径0.61 mm），另一手用细剪刀或弯曲的26 G针头在血管壁上剪开一小口，随后将导管插入颈静脉，再将活结打紧两次完成固定。最后，在导管上方将靠近头部的缝线打结，以确保导管完全固定。
9. 为分离并准备颈动脉，使用细弯镊子解剖覆盖气管区域的组织。
10. 当颈动脉完全游离于周围组织后，将迷走神经（外观呈紧邻颈动脉的一条白色细线）从血管表面轻轻分离（但不得切断）。可使用细镊子闭合后缓慢张开的方式轻柔移动神经。
11. 待两侧颈动脉均彻底清洁后，将镊子置于第一条颈动脉下方，并在其下放置一根黑色塑料支撑片（宽3 mm，长2.5 cm）。操作中切勿过度牵拉血管，并在放置血管夹持器后立即确认血流是否通畅。将第二条颈动脉也置于夹持器上。若小鼠未直接置于显微镜下操作，应将腺体复位覆盖气管，并滴加37 °C无菌生理盐水以防止组织干燥。

4. 使用体内显微成像技术评估白细胞/LysM+细胞的滚动与黏附

1. 从保存在 -20 °C 的 2 mg/mL 储存液中配制吖啶橙，用无菌生理盐水按 1:4 稀释（最终浓度为 0.5 mg/mL），装入 1 mL 注射器中。避光保存，并每只小鼠使用 200 µL。
   1. 测试不同条件：（1）通过颈静脉导管注射吖啶橙；（2）直接向尾侧静脉注射吖啶橙（此条件下未植入颈静脉导管）；（3）使用荧光 LysMCre⁺IRG⁺ 小鼠不注射吖啶橙进行检测（同样未植入颈静脉导管）。
2. 导管放置到位且两侧颈动脉分离后，将小鼠置于显微镜下。使用配备长距离聚光镜、10X（NA 0.3）水浸物镜、单色器、分光镜和电荷耦合器件相机的高速宽场荧光显微镜进行检测。通过实时成像系统完成图像采集与分析。
3. 将显微镜物镜聚焦于颈动脉中段的内皮表面。缓慢注射 50 µL 吖啶橙（0.5 mg/mL）（首次注射时需考虑导管的死体积）。设置软件以每幅图像曝光 120 毫秒的参数连续采集 100 幅图像。
4. 每侧颈动脉（左侧和右侧）在不同位置各录制四段视频。若荧光信号减弱，可再次注射 50 µL 吖啶橙。
5. 完成所有视频录制后，通过颈椎脱位法处死动物。
6. 将视频播放速度设为每秒 10 帧，在每段视频中选取位于血管中央的 200 µm × 250 µm 矩形区域，定量分析滚动和黏附的细胞数量；其中黏附细胞定义为在 10 秒视频中未移动或未从内皮脱离的细胞。为简化定量过程，去除红色荧光通道，仅使用绿色荧光通道计数滚动和黏附的细胞。
7. 对于使用吖啶橙的实验，需手动设定荧光阈值，以消除内皮细胞产生的背景信号。

结果

通过体内显微镜（IVM）观察了输注 AngII 的 LysMCre⁺IRG⁺ 小鼠的颈动脉。通过颈静脉导管注射吖啶橙。我们旨在评估与血管壁接触的 LysM⁺ 细胞占所有有核循环细胞的比例（这些有核细胞均可能与血管发生相互作用，因为此前研究中尚未明确何种类型细胞与血管发生相互作用）。在基线状态下，颈静脉导管的存在可导致 LysM⁺ 细胞发生黏附（图 2A，D）。注射吖啶橙后，相同的细胞呈现荧光，同时内皮细胞也呈现荧光（图 2B，E）。在降低背景荧光以排除内皮细胞相关荧光干扰后，数据表明所有黏附的有核细胞均为 LysM⁺ 细胞（图 2C，F）；该结果在输注 AngII 后仍然成立，验证了我们此前的研究结果，并证明 LysMCre⁺IRG⁺ 小鼠是观察 AngII 对 LysM⁺ 细胞活化作用的良好模型。

我们评估了吖啶橙在LysMCre⁺IRG⁺小鼠中经血管紧张素II（AngII）输注后，通过不同给药途径对LysM⁺细胞活化的影响。在AngII输注一周后，通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙，利用活体显微成像技术（IVM）对LysMCre⁺IRG⁺小鼠颈动脉中的白细胞-内皮细胞相互作用进行成像和观察。与未处理小鼠相比，未进行任何导管插入或注射的情况下，AngII输注后LysM⁺细胞的滚动显著增加，黏附亦有所上升（图3）。通过颈静脉导管注射吖啶橙后，AngII处理小鼠的黏附和滚动程度较未置入导管的小鼠进一步增强（图3）。而通过尾静脉注射吖啶橙的小鼠，其细胞黏附和滚动水平与未注射吖啶橙的小鼠相似（图3）。

图1. 小鼠血管紧张素II输注及LysM⁺细胞在颈动脉滚动与黏附的检测示意图。 LysMCre⁺IRG⁺小鼠经血管紧张素II（AngII）输注7天后，通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙，对颈动脉上黏附及滚动的LysM⁺细胞进行定量分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2. LysM⁺ 细胞在 LysMCre⁺IRG⁺ 小鼠颈动脉中黏附与滚动的评估。 通过颈静脉导管注射吖啶橙前（A, D）和注射后（B, E）LysMCre⁺IRG⁺ 小鼠体内 LysM⁺ 细胞的黏附情况。记录红色和绿色荧光，可见 LysM⁺ 细胞（绿色）和平滑肌细胞（红色）。注射吖啶橙后，内皮细胞也呈绿色可见，但通过去除背景荧光可实现仅对循环有核细胞的观察（C, F）。请点击此处查看该图的高清版本。

图3. 荧光染料在血管紧张素II输注的LysMCre小鼠中给药途径的评估⁺IRG⁺ 小鼠 滚动细胞的定量分析（A）以及黏附（BLysM⁺ 假手术或血管紧张素II输注动物的细胞，无论是否通过颈静脉导管或尾静脉注射吖啶橙。不同条件下的代表性图片（C）结果以均值 ± 均值的标准误表示。采用双因素方差分析（2-way ANOVA），并进行 Bonferroni 校正。 事后检验 检验，n = 3-12/组；*p < 0.05. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

LysM⁺ 单核细胞先前已被证明与高血压的发生有关⁵. 这里我们证明 LysM⁺ 免疫细胞在血管紧张素II输注后发生滚动并黏附于内皮层。该发现通过LysMCre获得⁺IRG⁺ 我们先前研究免疫细胞在高血压中作用时使用的小鼠 体内 通过注入吖啶橙对白细胞进行可视化观察^6,10因此，无法区分黏附于内皮细胞的细胞类型。

IVM 是进行血管研究的一种非常有用的工具 体内 直接观察血管内的细胞，但通过手术植入导管注射染料在高血压炎症环境下的影响仍不清楚。为了评估导管及吖啶橙注射的潜在影响，我们利用了 LysMCre⁺IRG⁺ 小鼠。AngII输注增加了滚动的LysM⁺ 细胞与内皮的黏附。将导管插入颈静脉后，该效应得到增强，在接受血管紧张素II输注并植入导管的小鼠中，检测到的滚动和黏附白细胞数量多于未植入导管的小鼠。这表明，在高血压相关的免疫反应背景下，颈动脉导管植入会引发与伤口愈合相关联的全身性炎症反应。¹⁸此外，由于颈静脉与颈动脉位置相近，穿刺过程中可能影响到颈静脉，从而引发额外的免疫激活。由于直接注入尾静脉时未观察到该效应，因此可推断此效应并非由染料引起，而是导管插入操作所致。本文证明了在使用表达荧光蛋白的转基因报告小鼠时，所采用的方法不应干扰 体内 实验过程中，尾静脉注射荧光示踪剂可能是颈静脉导管注射的一种可行替代方法。

该实验流程中的一个关键步骤是血管紧张素II（AngII）的输注。可通过尾套法测量血压，以监测泵输注AngII的效果。输注2−3天后，血压应有所升高。为了减少可能影响LysM⁺细胞活化的炎症反应，在植入泵的切口闭合时应使用缝线而非夹子。关于尾静脉注射需指出一个局限性：为了获得最佳的数据采集效果，通常需要对每侧颈动脉采集4段视频。如果荧光信号减弱，可注射50 µL吖啶橙，但通过尾静脉注射时，多次给药操作更为困难，且难以在显微镜物镜下保持颈动脉的稳定。导管在颈静脉中留置的时间长度也可能调节免疫细胞的活化状态，因为导管植入4小时后制备的富血小板血浆中凝血活化会受到影响¹⁹。这一导管植入相关问题仍需进一步研究。

最后，即使我们认识到颈静脉导管植入对LysM的影响⁺ 在血管紧张素II输注后细胞活化的情况下，我们无法充分评估制备过程、皮肤去除以及颈动脉分离对潜在LysM的影响⁺ 细胞激活。我们得出结论：使用LysMCre等荧光报告小鼠⁺IRG⁺ 建议使用小鼠，以避免在动物制备过程中对血管完整性造成破坏 体内 成像

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
咪达唑仑	Ratiopharm GmbH		麻醉混合液
美托咪定	Pfizer Deutschland GmbH		麻醉混合液
芬太尼	Janssen-Cilag GmbH		麻醉混合液
Alzane	Zoetis		安替西丹混合液
氟马西尼	Hikma pharma		安替西丹混合液
Braunol	B Braun
Octeniderm	施ülke
渗透压泵	Alzet	1007D	渗透泵植入
血管紧张素 II	Sigma-Aldrich		渗透泵植入
7-0 Prolene缝合线	Ethicon		渗透泵植入
吖啶橙	Sigma-Aldrich
导管	Smiths Medical Deutschland GmbH		内径，0.28 mm；外径，0.61 mm
显微镜	Olympus	BX51WI 荧光显微镜
分光镜	Photometrics	CMR-DV2-SYS - DualView2 显微成像系统
目的	奥林巴斯	UMPLFLN10X	水浸物镜配合单色器
相机	滨松光子	ORCA-R2
图像采集与分析软件	Olympus	实时成像系统 eXcellence RT
小鼠	杰克逊实验室	Jax 008705	B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
小鼠	杰克逊实验室	Jax 004781	LysM Cre（B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )