中性粒细胞来源微颗粒的功能研究分离与表征

摘要

本文描述了分离和表征来源于人和小鼠中性粒细胞的微颗粒的新方案。这些方案利用超速离心、流式细胞术和免疫印迹技术来分析微颗粒的内容物，可用于研究来源于不同细胞类型的微颗粒在细胞功能中的作用。

摘要

多形核中性粒细胞来源的微颗粒（PMN-MPs）是由脂质双分子层构成的球形微囊泡，直径大小在50–1,000 nm之间。微颗粒（MPs）是细胞间通讯和信号传导机制中一个新近被认识且重要的组成部分。由于其体积微小以及释放方式的特殊性，MPs的存在直到最近才被关注。然而，随着技术进步和分析方法的改进，MPs在健康和疾病中的功能正逐渐被揭示。本文所述的实验方案旨在通过流式细胞术和免疫印迹法对PMN-MPs进行分离和表征，并提供了多个具体应用示例。这些MPs分离方案具有快速、低成本的优点，无需使用昂贵的试剂盒。此外，这些方法允许在分离后对MPs进行标记，也可在MPs释放前使用膜特异性荧光染料对来源细胞进行预标记，以便通过流式细胞术进行可视化和分析。然而，这些方法也存在若干局限性，包括中性粒细胞（PMNs）和微颗粒（MPs）的纯度问题，以及对复杂分析仪器的需求。为可靠地分析MPs并最大限度减少因背景噪声或自发荧光导致的假阳性结果，需要使用高性能的流式细胞仪。所描述的方案可用于分离并定义MPs的生成过程，表征其标志物以及在不同刺激条件下组成成分的变化。可利用其大小的异质性来探究膜源性微颗粒与外泌体的内容物是否存在差异，以及它们在组织稳态中是否发挥不同的作用。最后，在完成MPs的分离与表征后，可进一步研究其在细胞应答及多种疾病模型（包括与中性粒细胞相关的炎症性疾病，如炎症性肠病或急性肺损伤）中的功能。

引言

最近，源自细胞质或质膜的"微粒/微囊泡"引起了广泛关注，因为越来越多的研究表明，这些直径在50–1,000 nm之间的结构能够携带生物信息，并作为细胞间通讯的一种非经典途径。来源于免疫细胞、尤其是多形核中性粒细胞（PMN）的微粒备受关注，这是因为PMN在宿主防御^1,2、炎症反应³以及伤口愈合⁴中发挥着重要作用。有趣的是，迄今为止已有大量研究报告显示PMN微粒具有促炎和抗炎双重功能⁵，提示微粒的作用可能具有微环境、疾病类型、物种及器官特异性。

本文所述的实验方案为研究微囊泡（MPs）在健康与疾病中的功能提供了一种经济高效、创新且可灵活调整的方法。该方法适用于多种模式生物、器官及刺激条件，能够鉴定多种类型的微囊泡，并可用于未来进一步探究其促炎与抗炎功能。本文以中性粒细胞来源的微囊泡（PMN-MPs）在上皮伤口愈合中的功能研究为例，介绍了其体外（in vitro）和体内（in vivo）的研究方法。所展示的小鼠骨髓来源中性粒细胞（PMNs）的分离方案，是在先前报道的方法⁶基础上经若干修改后建立的。

方案

所有动物实验均经西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有实验均按照并遵守所有相关的监管和机构指南进行。对于捐献血液的人类受试者，均提供了知情同意书并签署；此外，本研究中所有人类受试者均按照机构和联邦关于人类福利的指南进行处理。

注意：实验方案步骤列于以下小节中：(i) 小鼠骨髓细胞的分离；(ii) 从小鼠骨髓中分离中性粒细胞；(iii) 从人血液中分离中性粒细胞；(iv) 通过超速离心法从中性粒细胞上清液中分离微颗粒；(v) 通过蛋白质印迹法对微颗粒进行表征；(vi) 通过流式细胞术对微颗粒进行表征；(viii) 应用分离的微颗粒研究伤口愈合

1. 小鼠骨髓细胞的分离

1. 小鼠后肢股骨和胫骨的解剖
   1. 准备一个用于吸入麻醉的安乐死箱（例如，一个空的1 mL枪头盒）。将几滴100%异氟烷滴加到固定在塑料盒盖内侧的无菌布上。根据最新的IACUC指南，动物不应直接接触异氟烷，因此应在小鼠与含有异氟烷的纱布之间放置一个枪头架。
      注意：异氟烷是一种强效吸入性麻醉剂，必须在通风橱内极其谨慎地操作。
   2. 按照IACUC建议对小鼠实施安乐死。将一只小鼠放入步骤1.1.1所述的安乐死箱中，持续1–5分钟，直至呼吸停止。通过颈椎脱位法确认动物死亡。

结果

代表性流式细胞术分析显示，从人和小鼠中性粒细胞分离出的微颗粒（MPs） 图1通过与已知尺寸的微球进行比较，可评估PMN-MPs的大小异质性，如图所示。 图1A，B 用于人源MPs。注意，小鼠与人源MPs在大小异质性方面未观察到显著差异。同样，通过流式细胞术结合荧光标记，可检测分离自小鼠或人源MPs中目标蛋白的表达水平。例如，可通过Annexin V染色检测磷脂酰丝氨酸（PhS）的表达。图中显示的是小鼠骨髓PMN-MPs 图1C，D. 还可检测多种所选标志物的表达，例如人单核细胞（MPs）的Annexin V和CD11b染色结果所示， 图2A，B另一种通过流式细胞术检测中性粒细胞微颗粒（PMN-MPs）的方法是在刺激前对 freshly-.......

讨论

本文介绍了中性粒细胞来源微囊泡（MP）的分离与表征方法。为确保实验成功，需注意以下几个关键点：首先，中性粒细胞（PMNs）必须新鲜分离，并在分离后2小时内用于实验，以防止其自发激活和脱颗粒。在整个分离过程以及刺激前的所有操作步骤中，均需在冰上进行，以避免细胞激活和过早释放微囊泡¹²。其次，采用超速离心1小时或更长时间，可最大程度地沉淀微囊泡。第三，在进行流式细胞术分析时，仪器必须使用仪器指定的荧光微球混合物进行正确校准（微球类型需根据具体仪器调整），以准确界定微囊泡的大小。例如，某些流式细胞仪制造商推荐使用前向角散射（FSC）微球作为与尺寸相关的参数，而其他仪器则针对侧向散射（SSC）微球进行了优化。此外，用于微囊泡分析的流式细胞仪必须配备升级的电子系统，以便更有效地将微囊泡信号与背景噪声区分开来。

除了尺寸参数外，为正确鉴定微颗粒（MPs），强烈推荐使用上述步骤中所述的荧光染色方法。此外，在制备和分离过程中，所有溶液均应通过0.1 µm滤膜系统过滤，以最大限度减少尘埃颗粒或其他沉淀物的混入，从而降低流式细胞术检测时的背景噪声。重要的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Corning	10-041-CV
胎牛血清（热灭活）	Atlanta Biologics	S11150
青霉素/链霉素（10,000 单位青霉素 / 10,000 mg/ml 链霉素）	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Fisher	BP2482
氯化钠	Sigma	S9888	无菌并经 0.1 微米滤器过滤
无菌过滤的 Histopaque 1077	Sigma	10771
无菌过滤的 Histopaque 1119	Sigma	11191	密度为 1.119 g/ml。  多蔗糖与 泛影酸钠溶液。使用前恢复至室温
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）	Cellgro	210-40-CV
乙醇（200 证明）	Decon labs	2701
HBBS	Corning	21-022-CV
台盼蓝溶液，0.4%	Sigma	T8154 SIGMA	按 1:2 稀释用于细胞活力计数
异氟烷	Abbot	50033
抗人 CD11b-APC 偶联抗体	Biolegend	301350	克隆号 ICRD44（终浓度：1 µg/mL）
BODIPY FL	Invitrogen	B10250	N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺
Annexin V 结合缓冲液	Biolegend	422201
流式细胞术校准微球	BioCytex	7803
FITC Annexin V	Biolegend	640906
Polymorphprep	Axis-Shield PoC AS		泛影酸钠/葡聚糖 500，密度 1.113 g/ml
C57BL/6 小鼠	Jackson Labs
15 ml 离心管	Corning	430053
50 ml 离心管	BD Falcon	352070
25 ml 移液管	Celltreat	229225B
10 ml 移液管	Celltreat	229210B
5 ml 移液管	Celltreat	229205B
巴斯德吸管	BD Falcon	357575
25 G × 5/8 英寸针头（精密滑动针头）	BD	305122
100 µm 细胞筛	Celltreat	229485
真空采血管	BD	367251
设备
LSR Fortessa 特殊订单研究产品（SORP）	BD	(SORP)
水平转子离心机	ThermoFisher Scientific	75007210
超速离心机	Beckman	(L8-80 M)
微量离心机	ThermoFisher Scientific	VV-17703-15 (Fresco 17)
水平转子离心机	ThermoFisher Scientific	75004503 (Megafuge 40R)
活检钳，28 cm	Storz	27071zj
软件
Image J	美国国立卫生研究院	开源