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体内 果蝇运动神经突触前末梢的单分子示踪

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DOI：

10.3791/56952

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2018年1月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute, The University of Queensland, 2VIB Centre for Brain and Disease Research, KU Leuven Department of Neurosciences, Leuven Institute for Neurodegenerative Disease (LIND), 3Queensland Brain Institute, The University of Queensland

本文内容

摘要

本文展示了如何在活体运动神经末梢上进行单分子光激活定位显微镜成像 黑腹果蝇 三龄幼虫

摘要

越来越多的超分辨率显微技术正在帮助揭示调控细胞纳米尺度世界的机制。单分子成像技术因其能够出色地实现活细胞中单个分子的可视化而日益受到关注。本文中，我们描述了一种自主研发的技术，用于开展单粒子追踪光激活定位显微镜（sptPALM）研究 果蝇 幼虫。突触传递依赖于关键的突前蛋白，这些蛋白通过介导含神经递质囊泡与质膜的锚定、启动及促进其融合来发挥作用。这些过程受到一系列蛋白质-蛋白质及蛋白质-脂质相互作用的严密调控，因此突前蛋白在上述各个关键事件中均表现出相应的运动性变化。在完整活体动物中研究这些蛋白运动性与其生理功能之间的关联，对于阐明其精确的作用机制至关重要。以高分辨率提取蛋白运动性信息 在体内 需要克服光学透明度、可及性和穿透深度等限制。我们描述了如何通过轻微斜射照明来观察标记在突触前蛋白Syntaxin-1A上的光转换荧光蛋白，并在三龄幼虫的运动神经末梢或运动神经元轴突上对其进行追踪。 果蝇 幼虫

引言

神经元之间的通信依赖于神经递质的释放，这一过程通过含有神经递质的突触囊泡与细胞膜的调控性融合来实现1。这一过程称为胞吐作用2,3,4,5,6，具有高度动态性，并可根据刺激频率的变化而上调或下调7。参与这些过程的蛋白质受到布朗运动的影响，因而呈现出纳米级的组织结构，能够维持多种结合行为，从而支撑这些生理功能。细胞膜上的蛋白质具有高度动态性，可实现分子在细胞膜上被侧向捕获并形成纳米簇7,8,9,10,11,12。因此，研究这些蛋白质的运动性有助于阐明其作用机制8。例如，现已发现可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNAREs）等突触蛋白（如Syntaxin-1A）不仅表现出快速的侧向运动能力，还能在纳米簇内被侧向捕获，这些纳米簇可能作为分子储存库以及囊泡融合的位点9,13,14,15。

近年来，光转换荧光蛋白（如单体形式的 (m)Eos16,17 和 Kaede18）的发展使得通过光激活定位显微技术（PALM）和随机光学重建显微技术（STORM）等方法，能够以纳米级分辨率观察神经元质膜蛋白14,15,19。这些进展推动了对培养的活细胞和神经元中生物蛋白的运动性及纳米簇分布的研究。最近，研究人员进一步在类似高分辨率下，探究了完整活体生物（如小鼠 Mus musculus、秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans 和黑腹果蝇 Drosophila melanogaster）神经元中这些膜蛋白的动力学行为与组织结构14,20,21,22。

研究蛋白质的动力学与结构组织 体内 不仅需要使用近期开发的超分辨率成像工具（如PALM、STORM和光转换荧光蛋白），还需要克服诸如蛋白可接近性以及成像激光穿透深度等障碍。在完整动物体内对细胞内蛋白进行成像本身具有挑战性，对位于完整动物活体组织深处结构上的蛋白进行成像更是如此，例如完整小鼠的海马体。因此，位于组织表面或靠近表面的蛋白更易于成像。成像过程中的另一困难在于 体内 确保在不同动物之间具有可重复性。由于解剖结构在不同样本间可能存在差异，因此在多个完整的动物样本中选择易于重复识别的结构也可能具有挑战性。使用具有代表性的典型结构（如突触）有助于克服其中一些困难。

近期研究已对具有光学透明表皮的动物体内的蛋白质移动性进行了成像，例如 秀丽隐杆线虫22，而其他研究则对组织/器官表面的蛋白质分布进行了成像，例如通过活体小鼠颅骨对皮层神经元中的肌动蛋白进行成像21在某些情况下，曾使用麻醉剂使动物保持静止；然而，特定麻醉剂可能对目标蛋白产生不利影响。在动物实验过程中，保持动物静止的替代方法包括 体内 因此应探索成像方法以尽量减少误差。

超分辨率成像的另一个注意事项 体内 使用激光照射目标蛋白时，可能会对周围组织产生不利影响，因此建议将激发强度保持在尽可能低的水平。激光照射周围组织还容易增加背景信号。采用低激发强度有助于降低背景信号，但需要注意的是，这也可能导致荧光蛋白的光子产率下降。在图像分析前，可通过分析过程中的背景扣除作为降低背景信号的替代方法。

果蝇 是进行研究的理想生物体 体内 成像，因为它为研究特定蛋白质功能提供了成熟的遗传工具。上游激活序列（UAS）-Gal4 系统可实现蛋白质的时间和空间特异性表达，因此可用于调控神经传递23，使得利用热遗传学刺激 黑腹果蝇 瞬时受体电位A1亚家族（dTRPA1）24 或使用远红移CsChrimson进行光遗传学刺激25 可与成像技术结合使用14我们已克服了进行中的诸多复杂问题 体内 该系统中进行单分子成像，并介绍如何开展单颗粒追踪实验 黑腹果蝇 三龄幼虫

方案

1. 表达mEos2标记蛋白的转基因Drosophila

  1. 选择待用 mEos2 蛋白标记的蛋白。为提高成像成功率，建议选择具有跨膜结构域的神经元质膜蛋白。14 (例如，突触融合蛋白-1A），位于突触小泡或自噬体上的蛋白质26,27 (例如， 突触小泡相关膜蛋白-2），或与神经元质膜蛋白密切相互作用的胞质蛋白（例如，Munc18-1）
  2. 构建编码mEos2标记蛋白的转基因图1）设计该蛋白和mEos2的正向与反向引物。
    注意：mEos2 编码序列可从 pmEos2-N1 质粒中扩增获得，该质粒设计用于与目的蛋白的C端融合。克隆可通过以下方法进行，例如 体内 重组在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 使用 pFL44S-attB-MCS-w+ 载体14,28，或者可交替使用其他克隆方法，例如Gibson组装法29.
    1. 用BamHI和XbaI线性化载体，并共转化进入 ura3- 酵母细胞与编码mEos2及目的蛋白的PCR片段一同注入 果蝇 携带该构建体的胚胎，以建立转基因果蝇品系30.
  3. 在塑料小瓶中使用标准的酵母-糖蜜培养基或其他合适的替代培养基培养转基因果蝇品系。以确保获得健康且体积较大的突触小体31避免将果蝇在小瓶中饲养过密，每天更换产卵小瓶，以确保三龄幼虫摄食充分，并在开始在培养基上爬行时达到适当的体型大小。将转基因果蝇置于室温（25 °C）下培养。
    注意：较大的突触小体在成像过程中 tends to 产生更大量的可视蛋白质。

2. 三龄幼虫的解剖

  1. 使用合适的硅橡胶试剂盒制备直径和高度均≤20 mm的圆柱形或半圆柱形聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底（图2A）。按10:1的比例将硅橡胶与硅固化剂混合。
    1. 充分搅拌混合物5分钟。将混合物倒入具有上述尺寸的模具中，在100 °C的烘箱中固化45分钟。PDMS基底将作为解剖操作的基础。确保PDMS基底能够放入玻璃底培养皿的孔中。
  2. 从培养瓶壁上选取一只爬行的三龄幼虫。在4.5倍放大倍数的立体光学显微镜下观察幼虫，将其背侧朝上放置于PDMS圆柱形基底上。
  3. 使用弯曲且带角度的镊子，将微细图钉固定在口钩上方的头部、两个前气门之间，以及肛门上方的尾部、两个后气门之间。在固定好的幼虫上加入40 µL室温的Schneider昆虫培养基。
    注：也可使用类似血淋巴的溶液（HL3或HL6）替代Schneider溶液32,33。
  4. 使用微细图钉从幼虫腹部体壁背侧中线处切开，以获得操作通路。
  5. 使用弹簧剪从切口处将体壁剪开，沿前后方向沿中线剪开体壁34。
  6. 使用精细镊子和弹簧剪去除幼虫内脏：移除包括唾液腺、气管和肠道在内的内部器官。用Schneider昆虫培养基清洗幼虫两次。
  7. 用精细镊子夹住两侧体壁瓣，轻轻拉伸，并在每侧固定两枚微细图钉。应形成六边形的制备样本（图2A）。
  8. 使用弹簧剪将脑与腹神经索分离，以减少成像过程中肌肉运动的可能性；此操作也有助于使样本平整贴附于成像培养皿中。使用弯曲镊子将全部六枚微细图钉压入PDMS基底。
    注：仅需将图钉的一小部分嵌入腹部体壁中。
  9. 为确认幼虫在解剖过程中存活，可轻微触碰腹神经索，应能引发幼虫腹部体壁的蠕动性收缩。

3. 轻微斜射照明单粒子追踪显微技术

  1. 将解剖好的幼虫-PDMS基底倒置在玻璃底培养皿上。向成像用培养皿中加入2 mL室温的Schneider昆虫培养基（图2B）。
  2. 使用荧光全内反射显微镜（TIRF）配备的63倍/1.2 NA水浸物镜，在第二和第三体节中定位支配第6和第7腹肌的运动神经元突触35。
  3. 通过显微镜目镜定位解剖后的幼虫；利用明场照明识别第6号肌肉。
  4. 使用显微镜采集软件（见材料表），设置为TIRF模式；将聚光镜相机角度滑动至1°以增加穿透深度，或调整至偏离TIRF临界角，实现斜照明。
  5. 开启488 nm激光以观察绿色荧光标记的mEos2。使用低激光功率（低于22.8 mW的5%），避免绿色荧光发生漂白。定位神经肌肉接头（呈现为串珠状结构），并采集一幅低分辨率的TIRF图像。
  6. 同时开启405 nm激光（将mEos2由绿色光谱型光转化至红色光谱型）和561 nm激光（用于成像光转化后的红色mEos2），以实现单个mEos2荧光蛋白的随机定位。
    注意：建议使用低功率的405 nm激光（4.78 mW的0.005%至0.9%），以便在视频采集过程中保持相对恒定的光转化速率。561 nm激光功率建议使用50%至75%（20.1 mW），该强度足以采集红色mEos2的荧光信号，同时不会对神经肌肉接头周围肌肉组织的形态造成不良影响。
  7. 针对每个神经肌肉接头链，采集由15,000帧或更多帧组成的图像时间序列，采集速率为33 Hz。保存为.czi格式，以保留相关元数据供后续参考。
  8. 使用ImageJ将'.czi'格式的视频文件转换为'.tiff'格式。
  9. 使用合适的单分子追踪分析软件11,14,36（如FIJI/ImageJ中的TrackMate37，见材料表）分析所采集的视频。通过强度点扩散函数（PSF）的高斯拟合，确定每次定位的“x”和“y”坐标。
    注意：故障排除：若在488 nm激光照射下未观察到绿色荧光或荧光过弱，可短暂开启光转化与成像激光（405 nm和561 nm），以促进更多mEos2红色光谱型的生成；随后切换回488 nm激光并采集TIRF图像。

4. 固定幼虫中的单分子定位

  1. 为了通过PALM测量蛋白质纳米簇的大小，在解剖后用固定液（4%多聚甲醛溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中）替换Schneider昆虫培养基。
  2. 在室温下孵育幼虫30分钟。
  3. 移除解剖针，将固定的幼虫放入一个1.7 mL透明带盖离心管中。
  4. 根据需要解剖并固定其他幼虫，然后用PBS洗涤三次。
  5. 用封闭缓冲液（含PBS、0.1% Triton X-100和3%正常山羊血清的溶液）替换PBS。
  6. 用PBS洗涤幼虫三次，然后在封闭缓冲液中加入所需的一抗进行孵育。
  7. 在4 oC下孵育过夜。
  8. 用PBS洗涤幼虫三次，然后在封闭缓冲液中加入所需的二抗进行孵育。
  9. 用PBS洗涤幼虫三次，将幼虫重新固定到PDMS基底上，并按照先前描述的单分子追踪方法进行成像。

结果

使用上述方案，Syntaxin-1A-mEos2 转基因 Drosophila melanogaster 已生成（图1). 转基因三龄幼虫 果蝇 幼虫在PDMS圆柱形基底上进行解剖（图2A- F为了观察Syntaxin-1A的单分子，我们在全内反射荧光显微镜上采用光激活定位显微技术，并使用略微倾斜的激光照明。14.

在第二腹节肌肉6的突触前运动神经末梢上对Syntaxin-1A单分子进行了追踪。当使用488 nm激光激发时，可通过低分辨率图像观察到mEos2的绿色荧光，图中显示了1b型突触小结上Syntaxin-1A-mEos2的信号（图3A）。在成像实验中，405 nm和561 nm激发激光的成像深度分别为133.5 nm和165.6 nm。绿色图像由16帧独立图像平均获得，用于划定感兴趣区域，从而将光转化视频中定位事件的分析范围严格限定于突触前运动神经末梢内。

对获取的光转化sptPALM影片进行分析，生成了超分辨率的强度图、扩散系数图和轨迹图（图3A）。通过分析单个轨迹的均方位移（MSD），进一步量化了Syntaxin-1A-mEos2的运动性（图3B）。可利用MSD曲线下的面积进行统计比较（图3B）。对运动性的进一步分析得到了Syntaxin-1A-mEos2的扩散系数分布，该分布可通过移动组与非移动组群体的比较进行统计评估（图3C）。

质粒图谱示意图；含克隆位点 BamHI、XbaI 的 pFL44S 及其遗传元件
图1生成mEos2标记的构建体。 pFL44S-attB-MCS-w+ 载体用 BamHI 和 XbaI 进行线性化。分别编码目的蛋白（POI）和 mEos2 的重叠聚合酶链式反应（PCR）片段可通过例如以下方法进行克隆： 体内 重组在 ura3- 酵母细胞或通过吉布森组装法。请注意，为了构建Syntaxin-1A-mEos2转基因，我们克隆了由内源性Syntaxin-1A启动子和终止子序列侧翼包围的载体。所得构建体可随后显微注射至 果蝇 胚胎以创建表达目标蛋白（POI）与mEos2融合的转基因果蝇品系。 请点击此处以查看此图的放大版本。

使用斜照技术对PDMS凝胶中的幼虫进行成像的全内反射荧光显微镜装置示意图。
图2： Drosophila 幼虫解剖与斜照成像。（A）在半圆柱形PDMS基底上进行Drosophila幼虫解剖的示意图。解剖后的幼虫使用微细针固定于PDMS凝胶上。（B-C）将幼虫-PDMS样本置于含Schneider昆虫培养基的玻璃底培养皿中。采用略微倾斜照明配置的全内反射荧光显微镜（TIRF）对运动神经末梢中的Syntaxin-1A-mEos2进行观察。（D-F）带有解剖后Drosophila幼虫的半圆柱形PDMS基底。将幼虫-PDMS样本放入盛有Schneider培养基的成像皿中，并在超分辨率PALM显微镜下进行成像。比例尺：10 mm。（本图经修改自14）。请点击此处查看该图的放大版本。

单粒子追踪示意图，Sx1A-mEos2 强度、扩散、轨迹分析。
图 3： 体内运动神经末梢突触前膜 Syntaxin-1A-mEos2 的追踪。（A）在 1b 型运动神经末梢上 Syntaxin-1A-mEos2 的低分辨率 TIRF 图像。通过对以 33 Hz 采集的光转化视频进行分析，生成了 sptPALM 超分辨率强度图、扩散系数图和轨迹图。在 16,000 帧的视频采集过程中共记录到 5,309 条独立轨迹。比例尺：3 μm。（B-C）Syntaxin-1A-mEos2 的均方位移（MSD）来自 6 个不同运动神经末梢的数据；MSD 曲线下面积（AUC）用于量化其运动能力。扩散系数分布显示了可被定量比较比例的可移动与不可移动 Syntaxin-1A 亚群；每个运动神经末梢平均获得约 2,400 条轨迹（n = 3 条幼虫）。数据以均值±均值标准误表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了在神经肌肉接头处对mEos2标记蛋白进行单分子示踪的方法 果蝇 三龄幼虫。为避免转基因蛋白的过表达，Syntaxin-1A-mEos2 的表达由内源性 Syntaxin-1A 启动子驱动。关于突触蛋白运动性的研究在很大程度上局限于 体外 培养细胞与皮层神经元的研究9,11,12,13这些蛋白质在活体动物中是否表现出类似的迁移特征在很大程度上尚不清楚。为了观察单个蛋白质的迁移行为 体内，必须克服光学透明度、可及性和穿透深度等局限性。通过解剖幼虫样本并观察嵌在肌肉表面的神经肌肉接头，我们避免了光学透明度和可及性问题。尝试在常规全内反射荧光（TIRF）配置下对单分子运动进行成像未能成功。然而，采用略微倾斜的照明方式可增加激发激光的穿透深度。此外，用于固定幼虫的 minutien 针有助于避免麻醉剂使用对蛋白质运动可能产生的不利影响。可以使用更高倍率的物镜（如100x油浸物镜）来观察单个分子 体内然而，增加放大倍数可能会提高失焦漂移的发生概率。此外，我们已成功使用较低强度（约30%）的561 nm激光对运动神经末梢的单分子进行成像。若需使用更低的激光功率，可能需要进一步测试。

本方案适用于在神经元质膜附近观察突触蛋白的运动性。体内成像已成功用于研究SNARE蛋白Syntaxin-1A以及与自噬体结合的蛋白Atg18a的运动性14,26。此外，也可利用该方法研究运动神经元轴突上蛋白的运动性27。然而，由于脑组织或腹神经索下方组织产生的背景信号较强，对其蛋白运动性的评估可能较为困难；此外，若要在相同的脑结构上观察蛋白运动性，需对该脑结构进行荧光标记（以确保实验可重复性），并需要使用双相机成像系统。

目前可用于超分辨率显微镜的方法 果蝇 主要局限于成像胚胎，而非发育更成熟的三龄幼虫38,39主要问题在于这些方案在成像区域内获得的轨迹数量较少，因而无法对运动状态进行深入分析22,40. 我们的 体内 单分子示踪技术能够产生大量轨迹数据，因此可应用于其他动物模型，例如 秀丽隐杆线虫 以及斑马鱼。事实上，每条NMJ链可产生约2,400条轨迹，适用于分析不同运动状态及其状态间的转换14,27此外，许多 体内 单分子成像策略依赖于使用麻醉剂来固定动物20,22，这可能会影响成像过程中生物体的正常生理功能。在此，我们优化了一种“无麻醉”方案，使用微细针固定幼虫。

该方案的一个潜在应用是用于可视化蛋白质在三维空间中的移动性。近年来，超分辨率显微镜技术的进步使得蛋白质移动性的可视化成为可能 体外 在 x、y 和 z 三个维度上41,42目前的方法未考虑蛋白质在“z”轴方向上的移动性。然而 果蝇 运动神经末梢是一种球形结构，未来一个有价值的研究方向是在三维空间内定量分析蛋白质的移动性43通过使用像散透镜可实现z轴方向的成像。或者，在全内反射荧光（TIRF）模式下44,45，z轴分辨率也得到提高。然而，在我们的实验中，我们采用略微倾斜的照明方式，在不使用像散透镜的情况下实现了syntaxin1A-mEos2单分子的可视化。

总之，拥有表达带有光转换蛋白标签的蛋白质的转基因 Drosophila 果蝇品系、用于解剖转基因幼虫的PDMS基底，以及配备可调节照明角度功能的全内反射荧光显微镜，是本实验方案中可视化单个蛋白质所需的最重要工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢让-巴蒂斯特·西巴拉塔和丹尼尔·肖凯（IINS，法国国家科学研究中心/波尔多大学）在单分子分析方面提供的大力支持。我们特别感谢尼克·瓦尔马斯和杰西卡·麦高（昆士兰大学脑研究所，昆士兰大学）在视频录制、配音以及图表图形设计方面的帮助。本研究得到了澳大利亚研究理事会（AR）发现项目（DP170100125，授予F.A.M.）、澳大利亚研究理事会（LIEF资助LE0882864，授予F.A.M.）、未来研究员项目（FT100100725，授予B.V.S.）、澳大利亚研究理事会（LIEF资助LE130100078，授予F.A.M.）以及澳大利亚国家健康与医学研究理事会项目资助（APP1103923，授予B.V.S.）的支持。F.A.M. 是澳大利亚国家健康与医学研究理事会高级研究员（ONT1060075）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒）Dow Corning Corporation000000000001064291
玻璃底培养皿In Vitro ScientificD29-20-1.5-N
光学体视显微镜OlympusSZ51
弯头镊子（Style 5/45）Electron Microscopy Sciences0208-5AC-PO
显微销钉（0.1 mm）Fine Science Tools26002-10
施耐德昆虫培养基（Schneider's Insect Medium）Sigma, Life SciencesS0146
万纳斯弹簧剪Fine Science Tools15000-00
精细镊子（Dumont #5）Fine Science Tools11254-20
ELYRA PS.1 显微镜ZeissPS.1
磷酸盐缓冲液（PBS）Lonza17-515Q
多聚甲醛（16%）Electron Microscopy Sciences15710
曲拉通 X-100（Triton X-100）Sigma-AldrichT-9284
正常山羊血清Sigma-AldrichG9023
Maxyclear 扣盖微量离心管（1.7 mL）AxygenMCT-175-C
Zen Black 采集软件Carl Zeiss, 2012
Metamorph 软件Molecular Devices7.7.8PALM Tracer 插件
果蝇品系w1118; HA-Sx1A-mEos2

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果蝇幼虫突触前神经末梢sptPALM技术光转换荧光蛋白全内反射荧光显微镜Syntaxin-1A蛋白神经肌肉接头扩散系数分析单粒子追踪
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