本文介绍了一种基于探针阵列迭代对准的广域扫描探针纳米光刻技术方案，以及利用光刻图案进行细胞表面相互作用研究的方法。
方法文章
大面积扫描探针纳米光刻技术通过自动对准实现及其在细胞培养研究用基底制备中的应用
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摘要
摘要
扫描探针显微技术推动了多种构建性（“增材式”）自上而下纳米结构加工方法的发展。传统上，扫描探针光刻技术的主要局限在于单探针系统固有的低通量问题。这一问题已通过采用多探针阵列的方式得以解决，从而实现纳米光刻通量的提升。为了实施此类并行化纳米光刻，探针阵列与基底表面的精确对准至关重要，以确保在开始光刻图形化时所有探针能够同时接触表面。本实验方案描述了利用聚合物笔光刻技术在厘米尺度区域内制备纳米级结构的方法，该过程借助一种算法实现了探针阵列快速、精确且自动化的对准。在此，通过在金基底上进行硫醇分子的纳米光刻，展示了高度均一结构的生成。随后，这些图形被功能化修饰以负载纤连蛋白，用于表面导向的细胞形态学研究。
引言
纳米技术的进步依赖于能够高效且可靠地在表面制造纳米尺度结构的技术发展。1,2 然而，要在大范围区域（多个 cm）上生成此类特征2以相对较低的成本可靠地实现这一目标并非易事。大多数现有技术源自半导体工业，依赖消融性光刻技术来制造“硬”材料。近年来，源自扫描探针显微技术（SPM）的光刻方法已成为快速构建纳米级设计的一种便捷且多功能的途径。3 基于扫描探针显微镜（SPM）的技术能够方便且快速地“书写”任意用户定义的图案。其中最著名的是蘸笔纳米光刻术（DPN），由 Mirkin 率先开创。 等,4 其中，利用扫描探针作为“笔”，将分子“墨水”转移到表面，以类似于书写的方式在表面形成微纳结构。在常温环境下，当探针在表面扫描时，“墨水”分子被转移至表面 通过 探针与表面之间形成的水弯月面（图1因此，DPN 可实现多种材料的纳米光刻沉积，包括聚合物和生物分子等“软”材料。5 使用带有流体输送通道的探针构建的相关技术，也被称作“纳米移液管”和“纳米喷泉笔”，已有相关报道。6,7,8
SPM衍生光刻技术更广泛应用的主要障碍是通量问题，因为使用单个探针在厘米尺度的区域上进行图案化需要过长的时间。早期解决该问题的努力集中在基于悬臂梁的DPN并行化上，已有报道采用“一维”和“二维”（2D）探针阵列对厘米尺寸的区域进行光刻5,9。然而，这些悬臂梁阵列需通过相对复杂的多步制造工艺制备，且结构较为脆弱。聚合物笔光刻技术（PPL）的发明通过将标准SPM悬臂梁替换为键合在玻璃载片上的二维软质硅氧烷弹性体探针阵列，解决了这一问题10。这种简单的探针结构显著降低了大面积图案化的成本和复杂性，使纳米光刻技术得以拓展到更广泛的应用领域。这种无悬臂梁的架构还进一步发展为硬尖端软弹簧光刻技术11，该技术结合了软弹性体基底与硬质硅尖端，相比使用软弹性体尖端所制备的图案，可实现更高的分辨率。
在实施这些二维阵列技术时，一个关键因素是探针阵列必须与表面基底完全平行，以便在使用光刻技术时，所有探针能够同时接触表面。即使存在微小的错位，也会导致阵列一侧到另一侧的特征尺寸出现显著差异，因为在阵列下降过程中，部分探针会较早接触表面，而其他探针则会较晚接触甚至完全不接触。12 对于PPL技术而言，精确对齐尤为重要，因为柔软的弹性体探针具有可变形性：较早接触表面的探针会被压缩，从而在表面上留下更大的接触印迹。
早期关于PPL的研究采用纯视觉检查来引导对准过程，通过在阵列上方安装摄像头，观察锥形探针与表面接触时的形变情况。10 对准的判断依据是观察探针的哪一侧先与表面接触，然后调整角度并重复该过程，通过迭代方式直至探针两侧接触表面的差异在肉眼看来无法分辨。由于该对准过程依赖于操作者主观的视觉判断，因此可重复性较低。
随后，人们开发出一种更为客观的方法，即在基底下方安装力传感器，用于测量探针与表面接触时所施加的力。12 通过调节倾斜角度以最大化所施加的力，从而实现对准，该力的最大值表明所有探针已同时与表面接触。该方法表明，可实现与表面平行度偏差在0.004°以内的对准精度。目前，这种“力反馈调平”技术已在两项独立研究中被集成到全自动系统中。13,14 这两种系统均采用三组力传感器，分别安装在基底下方或探针阵列上方，用于测量探针阵列与表面接触时所施加的力的大小。这些系统具有高精度，可在1 cm的尺度上实现≤0.001°的对准误差，14 或在1.4 cm尺度上实现≤0.0003°的对准误差。13 这些自动对准系统还显著节省了操作人员的时间，并大幅缩短了光刻工艺的总体耗时。
该技术实现的高通量表面制备的一个主要应用是细胞培养基底的构建。目前已有充分证据表明，通过调控细胞与表面结构之间的初始相互作用，可以操控细胞表型，且这种调控在纳米尺度上可得到进一步增强。15 具体而言，扫描探针光刻技术已被证明是制备多种纳米结构表面以用于此类细胞培养实验的简便方法。16 例如，已有研究利用PPL和DPN技术构建出具有自组装单分子层和细胞外基质蛋白纳米图案的表面，用于探究纳米修饰材料在材料诱导干细胞分化方面的潜力。17
本方案描述了一种改进的原子力显微镜（AFM）系统，可用于实现大面积的探针诱导局部沉积（PPL）。我们详细介绍了利用多个力传感器检测作用力以确定探针与表面接触的方法，并结合一种可自动完成迭代对准过程的算法。此外，还描述了将细胞外基质蛋白纤连蛋白功能化修饰于这些图案表面，以及人源间充质干细胞（hMSC）的培养过程，以此展示PPL制备的表面在细胞培养中的应用。
方案
1. PPL 笔阵列的制备
- 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）共聚物混合物：
- 加入10 µL铂(0)-1,3-二乙烯基-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷配合物溶液和172 µL 1,3,5,7-四甲基-1,3,5,7-四乙烯基环四硅氧烷至250 g（7-8 %）的 w/w 乙烯基甲基硅氧烷-二甲基硅氧烷共聚物。将这些组分在旋转混合器中充分混合7天，以确保均匀混合。
警告：铂(0)-1,3-二乙烯基-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷具有毒性。使用该溶液前请仔细阅读材料安全数据表（MSDS）。操作该化学品时必须佩戴安全防护装备。 - 加入0.5 g（25-35 % w/w 将甲基氢硅氧烷-二甲基硅氧烷共聚物加入到称量皿中步骤1.1.1所得混合物1.7 g中，用刮刀充分混合均匀。
- 将该混合物转移至真空干燥器中，于200 mTorr（0.3 mBar）低压条件下脱气20分钟，直至所有气泡完全消失。
- 加入10 µL铂(0)-1,3-二乙烯基-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷配合物溶液和172 µL 1,3,5,7-四甲基-1,3,5,7-四乙烯基环四硅氧烷至250 g（7-8 %）的 w/w 乙烯基甲基硅氧烷-二甲基硅氧烷共聚物。将这些组分在旋转混合器中充分混合7天，以确保均匀混合。
- 将一块13 x 13 mm的玻璃载玻片放入装有20 mL 2-丙醇的塑料螺口瓶中，然后将该瓶置于超声波清洗仪中处理10分钟，以去除任何较大的残留物。用100 mL新鲜2-丙醇浸泡载玻片进行清洗，随后在氮气流下吹干。
- 放置硅胶母版18 放入直径为4 cm的培养皿中，并加入足量的脱气PDMS预聚物混合物（来自步骤1.1），直至完全覆盖。通常，制作20 × 20 mm的模具需要约100 µL。将带有预聚物混合物的模具置于真空干燥器中，再抽真空5分钟，以去除转移过程中产生的任何气泡。O2 在进行脱气的同时，应完成载玻片的等离子体处理（如下步骤1.4所示）。
- 用 O 处理玻璃方块2 在最大射频功率下，以600 mTorr的等离子体处理1分钟，以去除任何有机污染物，并在玻璃表面生成均匀的氧化层，从而促进弹性体的粘附。19 立即在下一步中使用经等离子体处理的载玻片。
- 将方形玻璃载玻片（来自步骤1.4）小心地覆盖在模具（来自步骤1.3）的预聚物上，确保经等离子清洗的一面朝下。轻轻按压玻璃载玻片，使其与硅模具贴合，以排除夹层中的气泡，并确保PDMS在模具与载玻片之间形成均匀的薄膜。
- 将上一步中制备的夹心式PDMS阵列放置于培养皿中，硅胶母模朝下即，将载玻片背面朝上）放入70−80 °C的烘箱中加热24−48 h，以热固化PDMS。
- 从烘箱中取出固化后的阵列，静置冷却15分钟，然后用刀片小心地刮除载玻片背面和侧面多余的PDMS，并用干燥氮气流吹去残留的PDMS碎屑。
注意：使用刀片时切勿刮擦硅胶母版，以免损坏防粘涂层。 - 将刀片插入阵列边缘约1 mm深度处，小心撬动使阵列与模具分离。操作时应一次性连续抬起完成；避免阵列重新落回模具上。
- 用剃刀小心地切割并刮除阵列边缘处0.5 mm的PDMS。使用干燥氮气流吹去任何松散的PDMS碎屑。
注意：在体视显微镜或放大镜下进行此修剪步骤可能会更容易。 注意不要用剃刀刮伤硅胶母版，以免损坏防粘涂层。
2. 芯片制备与基底安装
- 通过 O2 等离子体处理在探针阵列上生成亲水表面：
- 将 PPL 笔阵列放入培养皿中，置于等离子体腔室内，抽真空至 600 mTorr。开启等离子体发生器（最大功率）处理 30 秒。
- 释放真空，取出阵列，通过在阵列表面滴加 20 µL 去离子水并观察水是否均匀铺展来检测其亲水性。若未达到均匀铺展，需对阵列进行第二次等离子体处理。处理后，用干燥氮气流彻底吹干阵列。
- 使用双面导电胶带将阵列固定在探针 holder 中央位置，并将探针 holder 安装到 AFM 运动学 holder 上（图 2）。
- 用 16-巯基十六烷酸（MHA）对 PPL 阵列进行“蘸墨”加载：
- 取 8.6 mg 16-巯基十六烷酸（MHA）溶于 30 mL 乙醇中，配制成 1 mM 的 MHA 溶液，置于试管中并在超声水浴中处理 10 分钟，以确保化合物完全溶解。
注意：16-巯基十六烷酸具有毒性。使用前请仔细阅读材料安全数据表（MSDS），操作时必须佩戴适当的安全防护装备。 - 使用微量移液器将 20 µL MHA 溶液滴加至阵列表面，避免移液器吸头接触阵列。让溶液自然铺展至整个阵列，随后在常温条件下使乙醇自然挥发。
备注：PPL 阵列也可在完成对准后进行蘸墨处理。10
- 取 8.6 mg 16-巯基十六烷酸（MHA）溶于 30 mL 乙醇中，配制成 1 mM 的 MHA 溶液，置于试管中并在超声水浴中处理 10 分钟，以确保化合物完全溶解。
- MHA 溶液干燥后，将带有 PPL 阵列的探针 holder 安装至 AFM 上。
3. PPL 金基底的制备。
- 金基底可购买获得，也可通过热沉积或电子束沉积在实验室制备，其结构由2 nm的钛粘附层和20 nm的金层组成，沉积于玻璃或硅晶圆上。18
- 必要时，使用步骤1.4中所述参数，通过氧等离子体处理清洁基底。
- 将金基底置于原子力显微镜（AFM）样品台中央，并用胶带固定基底边缘（图2）。根据仪器制造商的操作说明，使用z轴控制器调节样品台至正确高度。
4. 笔阵列的自动对准
- 在计算机上打开并运行载物台控制器设置程序（SetupNSF.exe），将所有轴和角度重置（“归零”）至预校准的零点，然后使用载物台 x/y 轴控制器控制台将基底移动到所需的对准/打印位置。为获得最佳效果，应将基底放置在载物台中心附近，位于载物台力传感器之间。
注意：在某些型号的计算机上，x/y 轴控制器的 USB 信号可能与 z 轴控制器的信号相互干扰。如果发生这种情况，请在此步骤后断开 x/y 轴控制器的 USB 电缆。应在对准程序完成后（步骤 4.7）重新连接。 - 按照原子力显微镜（AFM）制造商的说明，切换载物台释放杆以释放样品载物台，并激活三组力传感器。让力传感器平衡至少 15 分钟。为获得最佳效果，建议平衡 30–50 分钟。
- 通过目视观察探针阵列和表面，升高 z 轴高度，使阵列接近基底。
注意：阵列越接近表面，对准过程所需的迭代次数越少，从而节省时间。 - 打开/运行自动对准程序（Auto Alignment v16.exe），并将相关的对准参数输入程序中。
- 输入所需的“角度步长”（Angle Step）参数值，通常为 0.15°。该参数是程序确定的每个轴“最优”角度的偏移角度。将此参数设置在 0.1 至 0.2° 之间，因为低于此范围的角度在探针接近表面时不会产生明显可检测的力差异。
注意：软件接受以毫度为单位的数值 （即，1 × 10-3 °）。例如，对于 0.15°，用户应输入“150”。 - 输入所需的“粗调步长”（Coarse Step）参数值，通常为 0.6 µm。该参数是载物台在初始粗略对准过程中接近探针时所使用的 z 轴步长。将此参数设置在 0.2 至 1 µm 之间。较大的步长可缩短对准所需时间，但会降低对准精度，并增加探针的磨损。
注意：软件接受以微米为单位的粗调步长值。例如，对于 0.6 µm，用户应输入“0.6”。 - 输入所需的“细调步长”（Fine Step）参数值，通常为 0.2 µm。该参数用于最优对准的精细调整。对于大多数应用，将此参数设置在 0.1 至 0.4 µm 之间。较大的步长值可减少对准所需时间，但会降低对准质量。
注意：软件接受以微米为单位的细调步长值。例如，对于 0.2 µm，用户应输入“0.2”。 - 配置“Excel 文件路径”，并通过点击“文件夹”图标，导航至文件位置并点击“确定”，附加所提供电子表格模板文件的未修改副本。该文件包含用于确定载物台最优倾斜角度的原始数据和计算数据。
- 输入所需的“角度步长”（Angle Step）参数值，通常为 0.15°。该参数是程序确定的每个轴“最优”角度的偏移角度。将此参数设置在 0.1 至 0.2° 之间，因为低于此范围的角度在探针接近表面时不会产生明显可检测的力差异。
- 打开/运行 AFM 控制软件。根据制造商说明，点击“光谱学”（spectroscopy）按钮，进入该程序的光谱学模块，并设置 AFM 扫描头 z 轴在 100 ms 内振荡 10 µm，暂停时间为 250 ms，然后在 100 ms 内回缩 10 µm，暂停时间为 250 ms（图 3）。
- 当 AFM 头部振荡时，点击对准软件的“开始”（start）按钮以启动自动对准过程。程序运行期间，软件会持续读写步骤 4.4.4 中所述文件的数据。
注意：对准过程耗时在 30 分钟至 3 小时之间，具体取决于步骤 4.3 中设置的初始载物台位置以及步骤 4.4 中输入的软件配置。
警告：对准过程中，载物台控制器控制台仍处于激活状态——请勿在对准过程中使用，否则会干扰对准过程。 - 当对准完成后，对准软件（来自步骤 4.4）上的绿色指示框“对准完成”（Alignment Completed）将被点亮。此时，请点击用户界面上的“停止”（STOP）按钮以结束对准过程。
- 检查电子表格模板文件中的图表，确认记录的数据点与软件生成的拟合线之间是否存在良好相关性。参见代表性结果，良好相关性的典型 R2 值通常 > 0.99。如果对准失败，请更换为新制备的探针阵列（步骤 2），并重复对准过程（步骤 4.4）。
- 使用该轴的载物台控制器控制台，沿 z 轴方向向上移动载物台。应以 500 nm 为增量逐步移动，直至从 AFM 的顶部视图相机中可观察到接触。阵列与基底之间的接触可表现为单个探针金字塔顶端出现高对比度的“白点”。
- 此时，点击 AFM 控制软件上的“停止”（stop）按钮，以停止步骤 4.5 中的光谱学程序。这将使阵列回缩 10 µm，从而保留 10 µm 的潜在 z 轴延伸空间。请检查 AFM 顶部视图相机的图像，确保探针未与基底接触。
5. 聚合物笔光刻（PPL）
- 通过点击控制软件上的“lithography”按钮，进入控制软件的光刻组件。选择 z-调制工作模式，并导入将用作光刻图案的光栅（位图）或矢量图像。为生成代表性结果中所示的特征，请使用由20 × 20个黑色像素组成的位图（见补充材料），对应于PPL阵列上每个探针位置进行20 × 20点阵光刻。
- 在AFM控制器软件的“像素图形导入”窗口中输入光刻参数。
- 设置要生成图案的“大小”， 例如，长和宽均为40 µm。这些参数表示位图图像将按此长宽进行缩放。为生成代表性结果中所示的特征，请在两个维度上均使用40 µm的宽度和长度。
- 将待生成图案的“原点”设置为两个方向上均为 25 µm x 和 y 轴。这些参数决定了图像中心相对于原子力显微镜中心的位置 x/y-轴。设置这些参数以避开探针在对准过程中接触表面的区域。
- 设置打印“参数”。这些数值决定了探针如何根据位图图像中的每个像素进行延伸（即与表面接触）。
- 从下拉菜单中选择“Modulation Abs Z Pos”和“Simplify to”两层。该模式指示原子力显微镜（AFM）根据仅有的两个结果，即“黑色（0）”或“白色（1）”区域，以确定的绝对距离延伸探针。
- 将“Black (0)”和“White (1)”字段的值分别设置为5和-5 µm。这些值决定了探针在响应位图图像上的黑色或白色像素时应移动的距离，通常“Black”的设定范围为3至5 µm即，相对于该轴的零点将探针向下延伸相应距离）以及-3至-5 µm用于“White”（即，相对于零点向上撤回探针3至5 µm。
注意：这些代表性距离假设5 µm的延伸会使探针接触到表面，从而产生特征结构，而5 µm的回缩则使探针脱离表面，导致无接触。 Z-延伸长度通过决定探针与表面接触的程度来影响特征尺寸，较大的延伸长度会使探针更深入地压入表面，从而形成更大的特征。10 - 单击“确定”按钮以应用这些设置并关闭窗口。
- 在AFM控制软件的光刻窗口中输入“暂停时间”，通常为1 s。该设置决定了探针保持在伸出的“黑色”位置的时间长度，通常设定在0.1至10 s之间。
注意：由于传输到金表面的MHA量更大，较长的停留时间会导致生成的特征尺寸更大。有关控制生成特征尺寸的更多细节，可参见其他文献报告。20 - 准备大气控制箱。
- 将大气隔离室放置到原子力显微镜（AFM）上，并启动/运行制造商提供的大气控制软件（MHG_control.exe）。
- 将相对湿度设为45%、温度设为25 °C、气体交换“流速”设为500 mL，并将这些数值输入大气控制软件中。点击“使用”以应用这些设置。随后，大气控制模块将开始向培养室中泵入加湿空气。
注意：由于笔阵列与表面之间形成的水弯月面更大，较高的湿度水平会导致特征尺寸增大。21 该值通常设置在40%至60%之间。流速通常设定在300至500 mL之间。较大的流速可更快达到目标湿度水平，但精度较低。代表性结果在初始产生湿度时采用500 mL的流速，当达到目标湿度后降低至300 mL，以在光刻过程中维持准确且稳定的湿度水平。
- 当达到所需湿度后，通过按下软件界面上的“开始”按钮来启动光刻程序。
- 光刻完成后，使用Z轴载物台控制器控制台将载物台回撤500 µm，使基底远离阵列。然后将大气隔离室从其安装座上取下。
- 将样品台释放杆切换至锁定位置，以锁定样品台并关闭力传感器（具体操作请参照原子力显微镜制造商的说明书），然后从样品台上取下基底。
6. 图案可视化
- 可使用以下方法之一观察图案：横向力扫描探针显微镜或化学蚀刻。
- 使用接触模式悬臂梁，在原子力显微镜（AFM）上以横向力模式扫描已图案化的表面，以非破坏性方式检查其特征。
注意：横向力显微镜可作为观察聚合物笔光刻所产生特征的非破坏性方法；然而，使用该方法仅能观察相对较小的区域（通常为 100 × 100 µm）。 - 由于沉积的MHA可作为蚀刻抗蚀剂，可通过化学蚀刻去除未图案化区域的金。随后可通过光学显微镜观察未蚀刻区域，从而实现大面积同时观察。18
注意：以该方式蚀刻的基底不能再用于下文所述的后续细胞培养实验。- 分别配制40 mM硫脲、27 mM硝酸铁(III)和100 mM盐酸的水溶液。将上述三种溶液各取5 mL混合，配制成蚀刻液。每次使用前需新鲜配制。22
警告：硫脲、硝酸铁(III)和盐酸具有毒性。操作前请阅读材料安全数据表（MSDS）。操作该溶液时必须佩戴安全防护装备。 - 将已图案化的基底转移至培养皿中，并用移液器加入足量蚀刻液以完全覆盖基底表面（通常为10 mL）。保持基底浸没4–5分钟，以蚀刻掉约15 nm厚的金（蚀刻速率约为3 nm/min）。
- 蚀刻完成后，取出基底，用去离子水彻底冲洗，并用氮气流吹干。
注意：蚀刻过程的完成由所获得的金膜厚度（步骤3.1）及指定的蚀刻速率（步骤6.2.2）共同决定。 - 在明场光学显微镜下检查蚀刻后的金结构。残留的金结构应与所打印的图案（来自步骤5.2）相对应。若整个表面呈现均一外观，则表明仍有大量金残留，应按照步骤6.2.2重复蚀刻1–2分钟。
- 分别配制40 mM硫脲、27 mM硝酸铁(III)和100 mM盐酸的水溶液。将上述三种溶液各取5 mL混合，配制成蚀刻液。每次使用前需新鲜配制。22
7. 使用纤连蛋白进行图案化功能化
- 将已图案化的基底浸入含1 mM (11-巯基十一烷基)六乙二醇的乙醇溶液中，反应1小时。用乙醇清洗基底三次，并用氮气流彻底吹干。此步骤用于钝化未图案化的金区域。
警告：(11-巯基十一烷基)六(乙二醇)具有毒性。使用该溶液前请仔细阅读材料安全数据表（MSDS）。操作该化学品时必须佩戴安全防护装备。 - 将底物浸入10 mM Co(NO₃)₂溶液中3)2 将底物置于水溶液中处理5分钟。随后将底物从溶液中取出，用超纯水洗涤三次，并在干燥氮气流下吹干。
警告：Co(NO3)2 有毒。使用该溶液前请阅读材料安全数据表（MSDS）。操作化学品时必须佩戴安全防护装备。 - 将基质浸入含50 µg/mL纤连蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中，4 °C孵育16 h。用PBS洗涤基质三次，然后在干燥氮气流下干燥基质。
注意：纤连蛋白通过MHA末端羧基对Co(II)的螯合作用，结合到MHA功能化的区域。随后，纤连蛋白与Co(II)发生结合。 通过 其胶原结合域23 - 必要时，可通过荧光抗体标记来观察表面结合的纤连蛋白：
- 将2 mL 1:100稀释的未标记兔抗纤连蛋白一抗溶液（溶于含5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的PBS中）加入表面，4 °C孵育16 h。吸除上清液，并用PBS洗涤3次。
- 将底物浸入含有荧光标记的山羊抗兔二抗（按生产商推荐的稀释比例，2滴/毫升）的2毫升PBS溶液中，该溶液含5%（w/v）BSA，用锡箔纸包裹后室温孵育1小时。吸除上清液，并用PBS洗涤3次。
- 根据制造商说明，使用荧光显微镜并设置激发滤光片为594 nm，记录特征的落射荧光显微图像。
8. 纳米结构表面的细胞培养
- 制备处于第4代至第8代之间、特征明确的hMSCs悬浮液th 和 6th 传代24
- 用10 mL PBS冲洗细胞一次，加入5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液至T75组织培养瓶中，使贴壁细胞解离，在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育2 最长5分钟，直至90%的细胞从表面脱落。
- 随后，向培养瓶中加入6 mL含10%胎牛血清（FCS）的新鲜培养基，并轻轻晃动培养瓶进行短暂冲洗。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在25 °C下以400 g离心5 min。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL新鲜培养基中。
- 使用血细胞计数板计数细胞密度25 并调整细胞悬液的密度至 2 x 104 通过添加适量的培养基将细胞浓度调整至 cells/mL。
- 将细胞以每平方厘米10个的密度接种到基质上4 细胞/厘米²2.
- 将底物切成 1 x 1 cm2 用金刚石刻刀划线后，将其放入12孔细胞培养板的一个孔中。
- 将2 mL细胞悬液（来自步骤8.1.4）用移液器加入孔中，并在37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育2 24 小时。
- 细胞在图案上生长后，通过免疫荧光分析细胞黏附和铺展的程度：
- 吸除培养基，用 PBS 洗涤底物一次。在通风橱中，加入 2 mL 预热至 37 °C 的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，固定细胞 20 分钟，随后用 PBS 洗涤三次。
警告：多聚甲醛具有毒性。使用该溶液前请仔细阅读材料安全数据表（MSDS）。操作该化学品时必须佩戴安全防护装备。 - 用2 mL 0.5%去垢剂溶液对细胞进行透化处理（参见 材料表在 PBS 中孵育 15 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。
- 将基底材料浸入含有未偶联的兔抗纤连蛋白一抗溶液中，该溶液用含5%（w/v）BSA的PBS配制，抗体稀释比例为1:100，于4 °C孵育16小时，随后用含0.1%（v/v）Tween 20的PBS（PBST）洗涤3次。
- 随后将底物浸入2 mL荧光标记的山羊抗兔二抗溶液中（用含5% (w/v) BSA的PBS按制造商推荐稀释比例稀释，2滴/mL），用锡箔纸包裹，室温孵育1小时，然后用0.1% PBST洗涤3次。
- 为了标记肌动蛋白丝，将2 mL以1:250比例稀释于PBS中的荧光标记鬼笔环肽溶液加入样本，用锡箔纸包裹后于4 °C孵育30分钟，随后用PBS洗涤三次。
- 同时使用含DAPI的封片剂滴加于样本上，以封片封固，实现细胞核的染色与封片。
- 吸除培养基，用 PBS 洗涤底物一次。在通风橱中，加入 2 mL 预热至 37 °C 的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，固定细胞 20 分钟，随后用 PBS 洗涤三次。
- 根据制造商说明，使用荧光显微镜观察细胞，核（DAPI）的激发滤光片为365 nm，F-actin为488 nm，纤连蛋白（fibronectin）为594 nm。
结果
为检查自动对准是否成功，需查看对准数据（来自步骤4.8的电子表格）所绘制的图表。当对准过程成功时，对应于样品台沿θ轴和φ轴倾斜角度的两条曲线会显示出一系列上升和下降的数据点。在每条曲线中，对数据点进行两次线性拟合，可得到一个明确的交点“峰”，该峰指示了最大的z向延伸量以及实现对准所对应的角度（图4A和4B）。此过程需重复四次（即，每个轴各两次），并绘制成四组坐标的集合。每对坐标之间的交点即表示整体最优角度（图4C）13。在对准未成功的情况下，可观察到相应的θ角和φ角曲线无法获得高质量的线性拟合，或不出现交点（图5）。此类对准失败通常是因为阵列修剪不当或安装至探针夹持器时位置不正（步骤1.7、1.8和2.2）。在此类情况下，应弃用该阵列，并制备和安装新的阵列（步骤1和2），然后重复对准过程（步骤4）。
在通过PPL使用MHA完成成功对准和光刻后，采用侧向力显微镜对图案化的金基底进行成像，以检测是否已发生沉积。此外，在蚀刻未被硫醇保护的金区域后，还通过光学显微镜对打印表面进行更大范围的观察（图6 和 图7）。然而，蚀刻后的图案不能用于进一步的功能化修饰，仅可用于确认一批打印基底样品中具有代表性的图案化效果。如果蚀刻图案显示出对应于单个探针笔的空白区域（图8），则表明探针阵列的制备未成功，部分探针可能已损坏或缺失。此类探针的不均匀性可能是由于使用了旧的母版，其上的全氟化涂层已磨损（步骤1.3），导致在将阵列从母版分离时部分探针被撕裂。在此类情况下，应使用新的母版。该结果也可能归因于玻璃背板与母版之间夹杂了气泡（步骤1.5），或在固化后探针阵列未能从母版上干净地分离（步骤1.8）。
孵育hMSCs后，还采集了纤维连接蛋白功能化表面的荧光显微镜图像（图9）。总体而言，所有底物在此期间均保持稳定 体外 在较小的孤立特征阵列（20 × 20）情况下，细胞在培养环境中附着并适应了所打印的图案形态。
图1. 聚合物笔光刻技术示意图，展示分子墨水传输过程 通过 探针尖端的水弯月面。 （A）聚合物笔阵列的侧视图和（B）顶视图表明，当探针阵列与表面基底完全对准时，所有探针同时接触表面，从而实现并行光刻。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2. 原子力显微镜聚合物笔光刻装置的示意图。 （A）实验装置的展开侧视图，其中制备好的探针阵列连接至探针夹持器，并安装在原子力显微镜扫描器上。基底放置于平台之上，平台下方设有三个力传感器。（B）组装完成的仪器示意图，显示原子力显微镜扫描头相对于样品台的位置。（C）底视图，显示力传感器的位置。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 表示校准过程中光谱程序的示意图。 原子力显微镜（AFM）扫描器设定为在100 ms内将探针向样品方向移动10 µm，随后在该位置保持250 ms，接着在100 ms内回缩10 µm，然后在回缩位置保持250 ms。此运动在校准过程中重复进行。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 显示成功校准的图表。 成功校准条件下，z 位置随倾斜角（A）θ 和（B）φ 变化的曲线图，其中 ● 表示实际测量值，+ 表示采用最小二乘法获得的最佳拟合值。（C）φ 与 θ 拟合角度的关系图，包含达到最大 z 位置的四个点。图中标记的交点即为两个轴向上最终的最优倾斜角。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 显示未成功对准的图表。 z 位置相对于倾斜角度 (A) θ 和 (B) φ 的关系图，用于一次未成功的对准实验，其中 ● 表示实际测量值，+ 表示采用最小二乘法得到的最佳拟合结果。(C) φ 与 θ 拟合角度的关系图，包含达到最大 z 位置的四个点。未观察到明显的极值点或交点，因此无法确定最佳对准角度。请点击此处查看该图的放大版本。
图6. 使用对准的PPL阵列在金基底上以MHA进行图案化后蚀刻所得的金基底的代表性光学显微镜和原子力显微镜图像。 （A）和（B）为蚀刻图案的逐级放大光学显微图像；（C）为单个图案网格的原子力显微镜形貌图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7. 通过排列对齐的PPL阵列在金基底上用MHA进行图案化并随后蚀刻的代表性光学显微镜图像。 （A）和（B）为蚀刻图案的逐级放大光学显微镜图像，（C）为低倍图像，显示大面积均匀的图案。请点击此处查看该图的高清版本。
图 8. 经不均匀 MHA 图案化后蚀刻的金基底的代表性光学显微镜图像。 预期图案（如插图所示）为重复的网格结构，由 20 行点线组成，每两行通过将 z 轴延伸增加 1 µm（范围从 5 到 -5 µm）生成。可以看出，在某些区域未生成图案，这是由于这些位置缺少探针所致。在仅生成两行点状结构的区域，该结果表明探针存在，但其高度与其他正常工作的探针不同，因此仅在阵列延伸至最大 z 轴距离时才沉积特征结构。本图像中，对比度已被刻意调整，以便观察部分打印区域。请点击此处查看该图的放大版本。
图9. 在PPL模板化的纤连蛋白阵列上培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的落射荧光显微图像。 （A）和（B）为显示单个细胞的高倍放大图像。（C）显示了无细胞黏附的纤连蛋白阵列的一个示例图案，（D）为细胞以网格状排列培养的宽视野图像（插图中也展示了打印图案的示意图）。细胞经染色以显示纤连蛋白（红色）、F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案旨在为用户提供一种便捷的方法，以在大面积（cm2）上快速实现具有高均匀性和可控特征尺寸的纳米光刻图案化。具有大面积纳米图案的基底可进一步用于多种应用。该技术的一个主要应用是构建用于细胞-表面相互作用研究的纳米结构表面。本报告展示了在这些材料上进行细胞培养的一些典型示例，证明了纳米结构基底对hMSC形态的调控作用。
该方案的关键在于实现了对准步骤（步骤4）的自动化，从而能够在表面上大规模、高均匀性地制备出特征结构，分辨率可达纳米级，进而显著加快细胞培养实验的周转速度。采用此对准算法进行的聚合物笔光刻技术可在约30分钟内生成纳米级结构。然而，自动对准的可重复性和准确性，以及所制备图案特征的均匀性，在很大程度上依赖于所制备探针阵列的质量（步骤1和2）。若制备过程中存在缺陷，导致探针钝化、断裂或缺失——例如封装过程中残留气泡（步骤1.5）或探针与母版分离不当（步骤1.8）——均可能导致对准不准确，从而影响光刻质量。
该报道的方法与依赖力反馈的其他对准方法具有一共同局限性。准确判断探针何时与表面接触，受限于必须考虑周围环境引起的背景振动以及样品台移动所产生的干扰。通常情况下，传感器的力灵敏度处于微牛（µN）量级（本例中为2 µN），但为了防止因背景噪声导致的“假阳性”信号，对准算法仅将至少490 µN的力认定为探针与表面之间确实发生接触。13 因此，该方法往往会产生较大的特征结构（1-2 µm），因为探针必须在较大距离上延伸 z-轴（从而产生更大的力）以记录接触。为进行补偿，可通过减小 z光刻步骤中沿轴方向行进的距离（例如，将步骤 5.2.3.2 中的“Black”设置由 5 µm 改为 3 µm。
然而，即使存在这一限制，该自动化算法仍能够解决并行扫描探针光刻技术应用中的一个关键问题，因为此前对准一直是这些技术实施过程中最耗时且最不精确的步骤。如今，该自动化技术已将制造过程的限速步骤从对准转移到光刻写入本身。尽管本方案展示了该对准程序在PPL中的应用，但该框架也可适用于多种扫描探针光刻（SPL）技术，例如脂质-DPN26 和基质辅助光刻27，以及未来潜在的催化探针系统28。
披露
比对算法及软件由曼彻斯特大学开发并拥有专有权利。可从 http://www.click2go.umip.com/ 下载。
致谢
作者感谢来自多个渠道的经费支持，包括英国工程与物理科学研究理事会（资助编号：EP/K011685/1、EP/K024485/1）以及为JH提供的研究生奖学金；勒弗休姆信托基金（RPG-2014-292）；惠康信托机构战略支持基金（105610/Z/14/Z）；英国文化协会（216196834）；曼彻斯特大学提供的曼彻斯特大学研究所（UMRI）启动基金以及授予SW的校长博士奖学金。同时，作者对Dr. Andreas Lieb（Nanosurf AG）提供的技术协助表示诚挚感谢。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| 安装在电动5轴（XYZΘΦ）平移与测角仪平台上的FlexAFM | NanoSurf | P40008 | |
| AFM控制软件 | NanoSurf | C3000 | |
| 雕刻笔 | Sigma-Aldrich | Z225568 | |
| 等离子清洗机 | Harrick plasma | PDC-32G-2 | |
| PlasmaFlo | Harrick plasma | PDC-FMG-2 | |
| 经济型干燥氧气服务泵 | Harrick plasma | PDC-OPE-2 | |
| 试管旋转仪 | Stuart | SB3 | |
| 真空干燥器 | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
| Milli-Q超纯水系统 | Merck Millipore | ZRXQ015WW | |
| 模块化湿度发生器 | proUmid | MHG32 | |
| Proline Plus移液器 100–1000 µL | Sartorius | 728070 | |
| 硅模板 | NIL Technology | 定制 | |
| 直立式快照荧光显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 显微镜物镜 | Olympus | 10x 和 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5 | |
| 直立式明场显微镜 | Leica | DM 2500M | |
| 超声波清洗机 | Ultrawave Ltd. | U95 | |
| 用于记录和解读自动对准结果的电子表格 | Microsoft | Excel | |
| 试剂 | |||
| 2-丙醇 | Sigma-Aldrich | 34863 | 易燃 |
| 显微镜载玻片，透明，磨边 | Thermo Fisher Scientific | 451000 | |
| （7–8% 乙烯基甲基硅氧烷）-二甲基硅氧烷共聚物，三甲基硅氧基封端 | Gelest | VDT-731 | |
| 1,3,5,7-四甲基-1,3,5,7-四乙烯基环四硅氧烷 | Gelest | SIT7900.0 | |
| 铂(0)-1,3-二乙烯基-1,1,3,3-四甲基二硅氧烷络合物溶液 | Sigma-Aldrich | 479527 | 有害，有毒 |
| （25–35% 甲基氢硅氧烷）-二甲基硅氧烷共聚物，三甲基硅氧烷封端 | Gelest | HMS-301 | |
| 称量舟 100 mL | Scientific Laboratory Supplies | BALI828 | |
| 巴斯德吸管 | Appleton Woods | KS230 | |
| 培养皿 | SARSTEDT | 82.1473 | |
| 剃须刀片 | Thermo Fisher Scientific | ST10-031T | |
| 导电碳胶带 | Agar scientific | AGG3939 | |
| 16-巯基十六烷酸 | Sigma-Aldrich | 448303-1G | 有害，有毒 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 34852 | 易燃 |
| 镀金显微镜载玻片 | Sigma-Aldrich | 643203 | 开封后，金表面至少1个月内仍对硫醇保持反应活性 |
| 硫脲 | Sigma-Aldrich | T8656 | 有害，有毒 |
| 硝酸铁(III)九水合物 | Sigma-Aldrich | 529303 | 有害，有毒 |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 84415 | 有害，有毒 |
| (11-巯基十一烷基)六(乙二醇) | Sigma-Aldrich | 675105 | 有害，有毒 |
| 人血浆来源纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| 硝酸钴(II)六水合物 | Sigma-Aldrich | 203106 | 有害，有毒 |
| Dulbecco’s磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MSCGM间充质干细胞生长培养基 | Lonza UK | PT-3001 | |
| 人源间充质干细胞 | Lonza UK | PT-2501 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Heraeus Multifuge X1离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| CELLSTAR离心管 | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 多聚甲醛 | Fisher Scientific | P/0840/53 | 有害，有毒 |
| Alexa Fluor 488鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | "在文稿中为“去垢剂”" |
| 含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 兔抗纤连蛋白抗体 | Abcam | ab2413 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记 | Thermo Fisher Scientific | R37117 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 12孔板 | Thermo Fisher Scientific | 10253041 | |
| T75细胞培养瓶 | Thermo Fisher Scientific | 10790113 | |
| 悬臂梁 | BudgetSensor | ContAl-G |
参考文献
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