使用条件性位置偏爱范式在小鼠中重建觅药行为

摘要

本方案描述了条件性位置偏爱（Conditioned Place Preference, CPP）作为复吸模型的方法。该实验程序可用于测量实验动物的复吸行为，因为目前药物滥用治疗项目重点关注的是药物相关环境线索对戒断成瘾者渴求感和复吸行为的影响。

摘要

本实验方案描述了条件性位置偏爱（Conditioned Place Preference, CPP）作为药物成瘾复吸的动物模型。在此模型中，首先训练动物对与药物配对的环境 compartment 产生条件性位置偏爱；在完成条件化后的测试之后，动物需经历多个消退训练阶段，以消除已建立的位置偏爱。CPP 模型可用于评估与环境线索相关的药物条件性奖赏效应。随后，通过非依赖性给予药物激发剂量或暴露于应激刺激，均可有效诱导已消退的 CPP 重新出现。本文将详细说明这两种诱导复现的方法。当动物重新表现出先前的行 为反应时，即认为条件性奖赏已发生复现。

本方案的主要优点在于其具有非侵入性、成本低廉、操作简便，并具备良好的效度标准。此外，该方法可用于研究多种环境干预因素（如应激或饮食）对药物觅药行为复吸的调节作用。然而，其局限性在于，若研究者旨在探究药物的动机性作用及其主要强化效应，则需结合自给药实验程序，因为后者涉及动物的操作性反应。

引言

条件性位置偏爱（Conditioned Place Preference, CPP）范式为评估多种刺激所诱导的条件性奖赏效应提供了一种简便方法^1,2，并已被广泛用于研究成瘾性药物的条件性奖赏作用³。该模型基于巴甫洛夫条件反射原理，用于评估与药物相关的环境线索在维持成瘾行为中的动机价值⁴。在此模型中，当环境线索与初级强化物配对时，便获得了次级诱因特性（即条件性奖赏效应）³。例如，在若干次条件化训练过程中，一个原本中性的场所（如CPP实验箱中某一隔间的颜色）与某种滥用药物的特定效应相匹配，而另一个隔间则与溶剂注射相关联⁵。条件化训练结束后，若动物在先前与药物配对的隔间中停留的时间更长，则认为已形成条件性位置偏爱³。这种偏好的建立源于动物赋予了与药物相关的环境线索以正向价值，而药物本身即为初级强化物。因此，动物会在这些情境线索的刺激下表现出寻求药物的行为反应⁶。CPP模型还可用于评估低于阈值剂量药物的奖赏特性，揭示处于特定状态下的动物（例如，曾遭受社会挫败）是否对在未受干预动物中无效的药物剂量更为易感和敏感⁷。

CPP模型还被用于评估消退/复燃，作为研究复吸的动物模型³，这也是本方案的目标。实验包含三个不同阶段：获得、消退和复现（图1）。在条件性位置偏爱复吸模型中，动物首先获得对药物配对隔室的条件性位置偏爱，随后进行多次消退训练。我们将消退定义为动物对其已移除的条件性奖赏刺激的趋近行为反应减少的时刻（例如，药物）⁸在消退阶段，动物在无药物条件下探索各个隔室，从而使已形成的偏好逐渐减弱。⁹一个需要考虑的重要问题是，动物在消退过程中表现出的行为改变（即在与药物配对的箱室中停留时间逐渐减少）可能是由于与先前习得反应相竞争的新学习过程所致，也可能是由于受试对象内部动机状态的降低所致³最后，通过情境或药物线索重新建立位置偏好的过程将作为我们研究复燃的模型。¹.

给予相关药物的启动注射可恢复其偏好，这被认为是对情境线索的近似性重新建立。药物启动恢复现象的发生是由于机体持续记忆着该药物带来的愉悦效应，从而引发渴求，并促使动物寻找与奖赏相关的环境线索。

CPP复现模型的一些优点在于该操作是非侵入性的（与需要手术的自我给药模型相比）、成本低廉且操作简单。此外，该模型具有良好的效标效度，因为它能很好地模拟人类中的实际情况^10,11，可通过诱发复吸的刺激诱导复现行为，例如再次接触药物^12,13或应激刺激¹⁴。

还有其他技术，例如静脉自我给药的消退-复燃模型。在此模型中，动物通过按压杠杆来自行给予药物，从而可以评估动物的操作性反应、强迫性行为以及动机^14,15,16。与自我给药程序相比，条件性位置偏爱（CPP）的主要优势在于，CPP的复燃被认为反映了与药物配对的环境刺激所具有的奖赏-动机价值的重新激活，表现为动物再次趋向该环境的行为重现¹⁷。此外，非药物性刺激（如应激）也能诱导复燃^18,19。例如，一项自我给药研究报道，在大鼠接受足底电击或束缚应激后，对海洛因摄入的复燃无显著影响²⁰。作者讨论指出，这可能是因为这些应激源是在自我给药箱之外的不同环境中施加的。相比之下，在采用CPP复燃模型时，使用相同的应激源并在与CPP环境不同的场所、于应激暴露后不同时间点（0和15分钟）施加，均能明显恢复吗啡诱导的CPP¹⁸。

文献中的多项研究表明，药物和应激诱导复吸存在不同的方式。一方面，已有研究报道在大鼠和小鼠中可通过吗啡^5,21,22,23、可卡因^24,25、苯丙胺^26,27、乙醇^28,29以及3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺（MDMA）³⁰诱导复吸。另一方面，暴露于应激可能是导致药物滥用易感性的决定性因素。已知应激会增强药物的奖赏效应^7,31,32，其在复吸中的作用也已得到充分证实^33,34。例如，与同种个体社交互动中的失败可使吗啡和可卡因的条件性位置偏爱（CPP）复现^18,19。此外，经历反复社交挫败的动物对低于阈值剂量的可卡因的条件性奖赏效应更为敏感，并可在极低剂量可卡因下恢复偏爱行为⁷。

应用CPP复燃模型是评估动物复吸易感性的一种有效且敏感的方法，同时允许评估多种细微的环境干预措施，这些干预措施正是威胁人类复吸的主要诱因，例如药物或应激诱导的复燃。

方案

所有涉及小鼠的操作及其护理均遵守国家、地区和地方的法律法规，符合欧洲议会和理事会于2010年9月22日发布的关于保护用于科学目的动物的指令2010/63/EU。本实验方案已获瓦伦西亚大学动物使用与护理委员会批准。

1. 条件性位置偏好的材料与设置：

1. 在测试前3天开始对小鼠进行抓握训练，每次持续1至2分钟。应抓握小鼠尾部的基部。 若可能，应支撑其身体。 此操作旨在尽量减少动物在抓握过程中所感受到的疼痛与痛苦， 并避免引入干扰变量（如应激反应）。
   注：本实验采用60日龄（年轻成年）雄性OF1小鼠，体重为35至40 g。  药物诱导的复吸实验可在两种性别的小鼠中进行。然而，对于应激诱导的复吸，社会挫败范式仅适用于雄性啮齿类动物，因为雌性不会在居住小鼠中引发攻击性反应。
2. 进行位置偏好实验时，使用由两个相同隔室（30.7 cm长 × 31.5 cm宽 × 34.5 cm高）组成的相同实验箱，两个隔室之间由一个较小的中央灰色区域（13.8 cm长 × 31.5 cm宽 × 34.5 cm高）分隔。
   注：两个隔室具有不同的地板质地和墙壁颜色（黑色隔室为光滑地板，白色隔室为粗糙地板）。条件性位置偏爱（CPP）箱的每个隔室配备四个红外光束，中央隔室配备六个红外光束，可用于记录动物在各隔室间的穿梭次数及其位置。
3. 每天设置房间灯光（关闭或调暗），建议使用红光，因为动物无法感知红光，且对实验人员而言光线较弱（在距地面1 m处测得照度约为40 lux）。
4. 设置程序以记录前条件化和后条件化测试各15分钟（参见材料表中的软件）（图2）。
5. 准备整个实验所需的可卡因溶液。将盐酸可卡因溶解于0.9% NaCl（生理盐水）中，给药体积为0.1 mL/10 g体重。混合后涡旋振荡，并在当天实验结束后于4 °C保存。
   注：可卡因浓度可根据研究目的进行调整。若旨在评估亚阈值剂量的可卡因效应，可使用1 mg/kg浓度，该剂量在对照动物中无效，如先前研究所示^24,35。若需使用有效剂量，可选择6 mg/kg浓度，该剂量有效但不会诱导复吸²⁴，或选择25 mg/kg浓度，该剂量有效且可诱导偏好行为的复吸¹⁹。
6. 在动物的黑暗期进行测试，并在连续几天内对同一只动物使用相同的实验箱。
7. 每天将动物连同其原代饲养笼带入测试房间，并静置15分钟，使其适应与测试相关的所有环境噪音。

2. 测试

1. 采集
   注意：位置偏爱实验（对初始自发偏好无偏向性）包括三个阶段：前条件化阶段、条件化阶段和后条件化阶段（图1).
   1. 预处理（Pre-C）（3天）(图2, 图3, 图4)
      注意：此处评估 CPP 箱中各隔室的中性值。记录在每个隔室中停留的时间，随后与条件化后测试中在同一隔室停留的时间进行比较。
      1. 将动物带入测试室，使其适应环境15分钟。
      2. 检查确认笼子中已移除断头器。
      3. 设置计算机和程序。输入动物编号，然后按下 "试验" 和 "开始" 命令图2).
      4. 将小鼠轻柔地放入中间腔室（灰色隔间），并尽量减少噪音后离开测试房间。
      5. 试验结束后，将所有动物放回其原代笼具中，并保存数据。
      6. 让小鼠每天可进入装置的两个隔室，持续15分钟（900秒），连续3天。
      7. 第3天，记录900秒内每个区域的停留时间，并保存以用于下一阶段的区域分配图3).
      8. 将每组中一半的动物分配至一个隔室，接受药物或溶剂处理（例如，黑色），另一半位于另一个区室中（例如，白色）（图4).
         注意：动物的最终分配必须确保一半动物被分配至最初偏好的隔室，另一半分配至非偏好隔室。此外，一半动物在其中一个隔室（例如黑色隔室）接受药物，另一半在另一隔室（本例中为白色隔室）接受药物。
      9. 在组内两个区室之间以及各组之间比较平衡得分（使用方差分析（ANOVA）检验组间差异）。作为大致参考，Pre-C 测试中的数值应约为 360 - 370 s图4）。注意：在条件化前测试（Pre-C测试）中，药物配对箱与载体配对箱之间的停留时间不应检测到显著差异。
      10. 排除对任一区域表现出强烈厌恶或偏好的动物。若动物在某区域停留时间少于总时间的33%，视为厌恶；若停留时间超过总时间的67%，视为偏好。
   2. 诱导（4天）图5)
      1. 称量动物体重，并根据这些体重数据计算条件化过程中可卡因的给药剂量。
      2. 根据体重准备含有可卡因或生理盐水的注射器。
      3. 每次对一只小鼠进行腹腔注射（ip），然后立即将其轻轻放入其盒子中指定的黑色或白色隔间。
      4. 间隔4小时后，在将小鼠限制在药物配对舱室前立即注射药物剂量，持续30分钟（图5).
      5. 每天交替进行此操作，第1天和第3天使用可卡因，第2天和第4天使用生理盐水。
      6. 检查在两种情况下是否通过关闭分隔两个隔间的闸门，使中央区域无法进入，以确保隔离的实施。
         注意：在此阶段，无需设置PC程序。
   3. 后处理（Post-C）（1天）
      1. 将动物带入测试室，使其适应环境15分钟。
      2. 移除分隔两个隔间的闸门。
      3. 设置计算机和程序。输入动物编号，然后按下 "开始" 命令
      4. 记录未经处理的小鼠在900秒观察期内于每个隔室中停留的时间。
      5. 试验结束后，将所有动物放回其原居住笼具，并保存数据。
      6. 如果在药物配对隔室中的停留时间在后条件化阶段（Post-C）显著长于前条件化阶段（Pre-C），则认为该药物诱导了位置偏爱；若相反，则认为动物对药物配对隔室产生了厌恶。
2. 灭绝
   1. 对所有产生药物配对舱室偏好的组/动物进行每周一次的消退训练。
   2. 将动物放入装置中（不使用斩首器），持续15分钟（与Pre-和Post-C测试相同）图1).
      注意：如果在条件性位置偏爱实验（CPP）中使用的剂量较高（25 mg/kg），则每周进行1次消退训练；如果使用亚阈值剂量（1 mg/kg），则每周进行2次消退训练。例如 周一和周四
   3. 当消退测试的数据与Pre-C测试相比无显著差异，但与Post-C测试相比存在显著差异时，可认为偏好已消退。
   4. 24小时后重复该测试，以确认消退效果。
3. 条件性位置偏爱的恢复
   1. 启动诱导的复现
      1. 在确认消退后24小时，评估可卡因启动剂量的作用。
         注意：启动剂量为动物在条件化阶段所接受剂量的一半。复燃测试的流程与前条件化（Pre-C）和后条件化（Post-C）测试相同，不同之处在于，动物在测试前15分钟于非条件性场所接受一次非自主给药的可卡因剂量。经过多次消退/复燃训练后，药物启动诱导复燃的效果可得到增强。²³，尽管给药顺序似乎对所得结果并无影响³⁶.
      2. 将动物带至与测试房间不同的区域（非关联性场所）（图6).
      3. 注射先前剂量一半的可卡因例如，如果动物以25 mg/kg的可卡因进行条件化，则激发剂量为12.5 mg/kg。
      4. 将它们送回饲养室，持续15分钟。
      5. 将动物带入测试室，并立即将其放入装置中（隔室之间不安装闸门），持续15分钟（与Pre-和Post-C测试相同）。
      6. 将药物配对箱在最后一次消退训练阶段与复燃测试阶段所花费时间的差值（以秒为单位）作为衡量药物诱导的偏好复燃程度的指标。
      7. 每次均重复进行消退-复燃实验程序，剂量逐渐降低，直至确认其无效为止。
         注意：可使用生理盐水注射作为对照，以排除注射操作本身的影响，从而特异性地评估可卡因引燃诱导复吸的能力。
   2. 应激诱导的复现
      1. 在确认消退后24小时评估应激诱导复现的效应
         注意：复测实验与“后C期”（自由活动15分钟）中进行的实验相同，不同之处在于，动物在经历社会挫败后的15分钟，在攻击性遭遇中接受测试图6)
      2. 将动物转移到与条件性位置偏爱实验不同的房间。
      3. 将实验小鼠与一只年龄、体重相匹配的同性别攻击性对手小鼠一同放入塑料笼中（图6).
         注意：攻击性对抗实验是在一个中性透明塑料笼（23×13.5×13 cm）中进行的为期10分钟的测试，实验小鼠在该测试中经历失败结果。为准备具有攻击性的对手，首先将与实验小鼠年龄和体重相匹配的不同个体隔离饲养至少3周，以训练其获得打斗经验，并筛选出具有高度攻击性和领地行为的个体。为获得具有攻击性的同种个体，需将小鼠隔离至少3周，随后进行攻击行为训练。训练在中性环境中进行，将小鼠两两配对面对。我们允许它们相互撕咬2至3次后即移出笼子，每次训练均在其中一只小鼠表现出屈服行为前结束，以确保此次互动经历强化其攻击性行为。实验小鼠在遭受攻击（来自攻击性同种个体的威胁与攻击）后，应表现出回避/逃跑以及防御/顺从行为。判定标准为呈现特定的失败姿态，其特征为直立的顺从姿势、前肢松弛下垂、头部向上翘起且耳朵向后贴伏。图6). 根据 Burke 等，2016年，我们认为如果入侵者表现出顺从的仰卧姿势，则社会接触更早结束 >8 s 或者如果发生了13次攻击性咬伤。另一种无显著伤害风险的动物筛选方法是将动物置于带有小孔的网状围栏中，孔径大小不足以让任一动物通过。  无需使动物经历直接的攻击性行为，即可检测其攻击性。  如果动物受伤后伤口直径达到1厘米和/或  肌肉直接暴露的个体应被排除在研究之外，并实施安乐死。
      4. 在攻击性互动10分钟后，立即将小鼠带入测试房间，并放入条件性位置偏爱（CPP）装置中（无需用隔板分隔各区域），持续15分钟（与前测和后测C阶段相同）。

3. 统计分析

注意：理想的样本量应为每组至少15只动物。

1. 采用混合型方差分析（mixed ANOVA）分析各组在药物配对箱中停留的平均时间，其中组间变量为处理方式（treatment），包含两个水平（对照组、实验组，两组示例见图7c），组内变量为天数（Days），包含两个水平（Pre-C 和 Post-C）。
   注意：在对照组中，动物接受药物处理但无环境干预；而在实验组中，动物暴露于不同的环境条件下。通过比较 Post-C 日与 Pre-C 测试期间在药物配对箱中停留的时间，判断两组对药物的敏感性是否存在显著差异。
2. 此外，进行 Bonferroni 事后检验，以验证任何显著性得分。
3. 对于表现出偏好行为的组别，使用 Student's t 检验分析其消退（extinction）和复燃（reinstatement）相关数据，以在实验过程中继续进行消退-复燃程序；但在最终阶段，应采用重复测量方差分析（ANOVA），其中组内变量为天数（Days），其水平数根据各组具体情况而定。
   注意：当比较次数增加时，偶然出现显著结果的可能性也随之增加。因此，为避免假阳性结果（I 类错误），需对 p 值进行校正，即在进行多次 t 检验时采用 Bonferroni 校正，使检验更为保守。然而，在复燃测试中，仅需将复燃测试与最后一次消退测试进行比较，因此无需进行校正。

结果

首先，使用成年OF1雄性小鼠展示了启动和应激诱导复燃的典型结果，如图7所示。

对 图7a-b 中显示的动物在条件化前（Pre-C）和条件化后（Post-C）测试中停留在与药物配对区域的时间数据，采用重复测量方差分析（ANOVA）进行分析，组内变量为测试天数（比较Pre-C与Post-C）。结果显示，测试天数具有显著性主效应 [F(1,34) = 51.179；p <0.001]，所有动物在Post-C测试日均表现出对药物配对区域的偏好。所有动物均使用25 mg/kg的可卡因进行条件化训练；当消退训练完成后，一组动物接受12.5 mg/kg的可卡因激发剂量以检测复吸效应（图7a），另一组则经历社会交互应激，即实验动物被具...

讨论

药物成瘾研究的关键在于开发能够减轻渴求感、从而降低复吸风险的治疗方法。得益于条件性位置偏爱（CPP）范式中的复吸模型，研究者可以探讨不同程序性和环境因素对复吸的影响，这也是未来研究的重点方向。需要注意一些重要问题，因为CPP范式是一种对环境因素高度敏感的行为检测方法。

修改与故障排除： 根据所研究的药物不同，应修改复吸模型的 CPP 版本。多个因素可能影响条件性偏好的强度，例如条件化训练的持续时间和次数。通常关联次数范围为一次至六次，其中四次最为常见。条件化测试的持续时间应根据药物的特性及其药代动力学来确定。

CPP 研究通常涉及多次试验，因此采用可缩短所需时间的实验方案具有重要意义。一种方法是减少试验次数，另一种方法是每天进行两次条件化训练，如本实验方案所示。在此情况下，必须确保前一次给药的影响不会延续至第二次训练³⁹，因此选择在可卡因-溶剂对照组训练之间设置4小时的时间间隔。例如，在条件化阶段使用可卡因时，配对时间应为每24小时一次，持续4天...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MONPRE 2Z 软件	CIBERTEC S.A., Spain	N/A
带有两个相同大小隔室的透明有机玻璃箱，隔室之间由一个灰色中央区域分隔。	CIBERTEC S.A., Spain	N/A	隔室具有不同颜色的侧壁（黑色与白色）以及不同的地面纹理（黑色隔室为细网格，白色隔室为粗网格）。每个箱子的两个隔室内均装有四束红外光束，中央区域装有六束，可用于记录动物的位置及其在隔室之间的穿梭次数。
盐酸可卡因	Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain	N/A
动物：OF1远交系小鼠	Charles River, Barcelona Spain	N/A	雄性小鼠在出生后第42天（PND 42）进入实验室，并在出生后第60天（PND 60）进行条件性位置偏爱（CPP）测试。该品系动物特别适用于社会挫败和攻击行为模型研究。
标准饮食 – Teklad Global Diet 2014	由 Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain) 提供		脂肪占13 kcal %，碳水化合物占67 kcal %，蛋白质占20% kcal；总能量密度为2.9 kcal/g
高脂饮食 TD.06415			脂肪占45 kcal %，碳水化合物占36 kcal %，蛋白质占19% kcal；总能量密度为4.6 kcal/g