小鼠代表了一种不可估量的 体内 用于研究胃肠道微生物感染及相关疾病的模型。在此，我们描述了用于研究细菌定植及小鼠模型中组织病理学变化的方法 幽门螺杆菌-相关疾病
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摘要
摘要
幽门螺杆菌 是一种存在于全球一半人口中的胃部病原体，是人类发病和死亡的重要原因。多种小鼠胃部模型 幽门螺杆菌 感染已开发用于研究其分子和细胞机制 H. pylori 细菌定植于人类宿主的胃部并引发疾病。本文中，我们描述了以下实验方案：1）制备用于感染的细菌悬液； 体内 通过灌胃法感染小鼠；2）通过聚合酶链式反应（PCR）和活菌计数法测定小鼠胃组织中的细菌定植水平；3）通过组织学方法评估病理学变化。为建立 幽门螺杆菌小鼠感染实验中，首先将无特定病原体（SPF）动物接种于悬液（含≥105 菌落形成单位（CFUs）的定植小鼠菌株 幽门螺杆菌 或其他胃部 幽门螺杆菌 来自动物的 spp.，例如 幽门螺杆菌 felis 在感染后的适当时间点，取出胃组织并沿矢状面解剖为两个相等的组织片段，每个片段均包含幽门部和胃体部。其中一个片段用于活菌计数或DNA提取，另一个片段则进行组织学处理。可通过Warthin-Starry、吉姆萨（Giemsa）或苏木精-伊红（Haematoxylin and Eosin, H&E）染色的胃组织切片，常规评估胃内细菌定植情况及组织病理学改变。&E) 染色，视具体情况而定。也可在小鼠胃组织切片上通过免疫组织化学或免疫荧光进行额外的免疫学分析。以下所述方案专为在小鼠中评估类似于人类相关胃部病理而设计 H. pylori 疾病，包括炎症、腺体萎缩和淋巴滤泡形成。接种物制备和经胃灌胃操作方案也可经调整后用于研究其他定植于小鼠的肠道人类病原体的发病机制，例如 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌或 鼠伤寒柠檬酸杆菌.
引言
Helicobacter pylori 是一种螺旋形、革兰氏阴性的人类胃部病原体，存在于全球所有人群中，在发展中国家的感染率估计高达80%1。尽管大多数 H. pylori 感染者无症状，但部分感染者会发展为更严重的疾病，从消化性溃疡到胃癌不等2。H. pylori 相关癌症主要分为两类：一类是上皮细胞发生恶性改变导致胃腺癌，另一类是在胃部形成胃外淋巴组织，导致黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤。H. pylori 因具备多种毒力因子及机制，能够适应胃部严苛的生态位，从而实现黏附、生长和代谢。特别是，有毒力的 H. pylori 菌株携带一个40 kb的 cag 致病岛（cagPAI），其编码约30个基因，用于构建IV型分泌系统（T4SS）3,4。携带 cagPAI 的 H. pylori 菌株可诱导宿主产生更高水平的慢性炎症，而这种炎症被认为是胃腺癌发生的重要前期因素5。
体内动物模型，尤其是小鼠模型，已为研究人员提供了重要信息，使其能够探....
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方案
1. 细菌接种物的培养与制备
- 解冻甘油菌种保藏管 H. pylori 或 H. felis15 从 -80 °C 取出并在含以下成分的马血琼脂（HBA）平板上进行传代培养：血液琼脂基础培养基 No.2（参见 材料表）；改良的“Skirrow抗生素选择性添加剂”（含万古霉素 10 μg/mL、多粘菌素B 25 ng/mL、甲氧苄啶 5 µg/mL、两性霉素B 2.5 μg/mL）；以及5–10%（v/v）马血15,16细菌在含有适当气体包的2.5或3.5 L厌氧罐内的微需氧条件下生长良好（参见 材料表，37 °C。
注意： H. pylori 在这些条件下培养的菌株必须在培养1–1.5天后进行传代培养，而 H. felis，通常需要至少2天的孵育时间。合适的培养和保存培养基此前已有详细描述。15. - 从小至中期对数生长阶段的培养物中制备用于小鼠感染的细菌接种物。通过向每块琼脂平板加入1–2 mL脑心浸出液（BHI）肉汤，轻柔地冲洗平板以收获细菌。使用巴斯德吸管吸取平板上的菌悬液。
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结果
本方案描述了一种通过口服灌胃技术在小鼠模型中实现幽门螺杆菌（H. pylori）或猫胃螺杆菌（H. felis）胃内感染的方法（图1）。安乐死后，取出小鼠胃组织，称重，并沿胃窦、胃体及非腺体区域均分为两等份（图2）。在进行任何分析之前，需先去除非腺体区域。
动物成功定植通常通过在H. pylori感染的胃组织匀浆液上进行活菌计数，并在HBA平板上计数单个菌落来确认（图3）。或者，可采用PCR方法，使用针对H. felis和H. pylori ureB基因325 bp区域的特异性、已验证引物，来确认H. felis的感染（图4）。
胃组织经过处理、包埋并切片，用于后续组织学分析。采用苏木.......
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讨论
本方案描述了一种的使用方法 体内 小鼠模型用于 幽门螺杆菌 感染。该操作的关键步骤包括：1）制备 幽门螺杆菌 含有可存活且具运动性的细菌的接种物；2）通过经口灌胃将适量细菌递送至小鼠体内；3）通过菌落计数和/或PCR检测细菌感染情况；以及4）处理胃组织，以便对感染胃组织进行组织病理学评估。下文将进一步讨论相关修改建议、故障排除及技术注意事项。
生长方法 幽门螺杆菌 在本实验室，使用添加马血的2号血琼脂基础培养基培养spp.已有成熟方法。然而，也可选用其他琼脂基础培养基，如布氏琼脂和哥伦比亚血琼脂。22必须确保仅使用无洗涤剂残留且经过灭菌的玻璃器皿来配制培养基。此外，为获得最佳生长效果， H. pylori 细菌应常规接种于含有残留水分且未干燥的琼脂平板上进行传代培养。在准备时 幽门螺杆菌 种（spp）. 用于感染的接种物时，必须进行转接培养 H. 幽门螺杆菌 和 H. fel.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 A. De Paoli 女士和 Georgie Wray-McCann 女士提供的技术协助。作者感谢莫纳什大学解剖学与发育生物学系莫纳什组织学平台提供的设施与技术支持。本实验室的研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）资助（项目编号：APP1079930、APP1107930）。RLF 获 NHMRC 高级研究员奖学金支持（项目编号：APP1079904）。KD 和 MC 均获得莫纳什大学研究生奖学金支持。KD 还获得莫纳什医学研究所先天免疫与传染病中心的支持，而 MC 获得莫纳什大学医学、护理与健康科学学院国际研究生奖学金支持。莫纳什医学研究所的研究工作得到维多利亚州政府运营基础设施支持计划的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌学试剂 | |||
| Oxoid 血琼脂基础培养基 No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | 使用前溶于去离子水中，再行灭菌 |
| 优质脱纤维马血 | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto 脑心浸出液肉汤 | BD Bioscience | 237500 | 使用前溶于去离子水中，再行灭菌 |
| CampyGen 气体发生包 | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| 组织学试剂 | |||
| 中性缓冲福尔马林，10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| 无水乙醇，100% 变性 | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| 异丙醇（2-丙醇） | Merck | 100995 | |
| 二甲苯（无硫） | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer 苏木精染液 | Amber Scientific | MH-1L | 使用前过滤 |
| 伊红水溶性染液 | Amber Scientific | EOCA-1L | 使用前过滤 |
| 改良 Wright-Giemsa 染色液 | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | 使用前稀释（20% Giemsa，80% 去离子水） |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX 封片介质 | VWR | 1.00579.0500 | |
| 分子生物学试剂 | |||
| Qubit dsDNA BR 定量检测试剂盒 | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| 寡核苷酸 | Sigma Aldrich | 本研究中所用 ureB 引物的退火温度为 61 °C | |
| GoTaq Flexi DNA 聚合酶 | Promega | M8291 | 试剂盒包含 10× PCR 缓冲液和氯化镁 |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | 使用前用无菌无核酸酶水稀释至 10 mM |
| 分子生物学级琼脂糖 | Bioline | BIO-41025 | |
| 碳酸氢钠 | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| 七水合硫酸镁 | Chem-Supply | MA048-500G | |
| 抗生素 | |||
| 万古霉素 | Sigma Aldrich | V2002-1G | 溶于去离子水中 |
| 多粘菌素 B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | 溶于去离子水中 |
| 甲氧苄啶（≥98% HPLC） | Sigma Aldrich | T7883 | 溶于 100%（无水）乙醇中 |
| 两性霉素 | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | 溶于去离子水中 |
| 来自 Bacillus licheniformis 的杆菌肽 | Sigma Aldrich | B0125 | 溶于去离子水中 |
| 萘啶酸 | Sigma Aldrich | N8878 | 溶于去离子水中 |
| 其他试剂 | |||
| 甲氧氟烷（Penthrox） | Medical Developments International | 不适用 | |
| 石蜡 | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| 仪器与塑料耗材 | |||
| Oxoid 厌氧罐 | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN 玻璃巴斯德吸管 | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R 离心机 | 以 2,200 rpm 离心 10 分钟（4 °C）收集细菌沉淀 | ||
| 23 号精密针头 | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M 封口膜 | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex 细内径聚乙烯导管 | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| 塑料喂养导管 | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 mL 无菌结核菌素鲁尔滑动一次性注射器 | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf 1.2 - 2 mL 管用微型研磨杵 | Sigma Aldrich | Z317314 | 用于胃组织匀浆的可高压灭菌聚丙烯研磨杵 |
| GentleMACs 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | 使用预设的 GentleMACS 程序处理小鼠胃组织 |
| M 管（橙色盖） | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit 荧光计 | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| 无菌塑料接种环 | LabServ | LBSLP7202 | |
| 冷台，Leica EG1160 包埋系统 | Leica Biosystems | 不适用 | |
| Tissue-Tek 基底模具系统，基底模具 38 × 25 × 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III 通用包埋盒系统 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Leica RM2235 切片机 | Leica Biosystems | ||
| 带电荷的 SuperFrost Plus 玻片 | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
参考文献
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori su....
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