一种无需输血和正性肌力药物的大鼠复苏体外循环模型

摘要

本文介绍一种在大鼠中建立无需输血或使用正性肌力药物的简易复苏体外循环模型的实验方案。该模型可用于研究体外循环后长期的多器官后遗症。

摘要

体外循环（CPB）在心血管外科手术中不可或缺。尽管CPB技术和设备已取得显著改进，但与长时间CPB相关的多器官并发症仍会影响心血管手术的治疗效果，并可能加重术后发病率和死亡率。能够模拟CPB临床应用的动物模型有助于阐明CPB期间发生的病理生理过程，并推动开展临床前研究以开发防治这些并发症的策略。大鼠CPB模型具有成本效益更高、实验操作便捷、可在基因或蛋白水平采用丰富的检测方法以及遗传背景一致等优势。该模型可用于研究免疫系统激活、促炎性细胞因子的合成、补体系统激活以及氧自由基的产生。大鼠模型已不断优化，并逐渐取代了大型动物模型。本文介绍了一种在大鼠中建立的无需输血和（或）血管活性药物支持的简易CPB模型。该复苏模型可用于研究CPB后长期的多器官后遗症。

引言

1953年，小约翰·H·吉本（John H. Gibbon Jr.）博士成功实施了首例使用体外循环（CPB）的心脏手术¹，此后体外循环成为心血管外科中不可或缺的技术。尽管相关技术和设备已得到显著改进，但与体外循环相关的多器官并发症仍会影响心血管手术的治疗效果，并可能导致术后发病率和死亡率升高²。体外循环相关的器官损伤主要由免疫系统激活、促炎性细胞因子合成、补体系统激活以及氧自由基的产生所引起²。然而，其病理生理机制尚未完全阐明。

能够模拟体外循环（CPB）临床应用的动物模型有助于阐明CPB期间及之后的病理生理过程；这将促进开发避免这些并发症策略的临床前研究。自从Popovic et al. 于1967年首次报道大鼠CPB模型以来³，大鼠CPB模型已得到不断优化，并因其更高的成本效益、便捷的实验操作以及在基因和蛋白质水平上丰富的检测方法，逐渐取代了大型动物模型。此外，近交系大鼠在遗传上可以完全一致，从而减少可能存在的生物学偏差。

Fabre et al. 首次建立了一种复苏模型，可用于研究体外循环（CPB）后长期多器官后遗症⁴。这种简单的存活模型具有诸多优势，包括灵活性（CPB血流和持续时间可调）、生命体征稳定，以及在系统性炎症反应方面具有良好的可重复性。大鼠CPB模型已成为研究旨在预防CPB期间多器官损伤治疗策略的关键工具⁵，近年来已开发出多种模拟CPB期间临床情况的模型。De Lange et al. 建立了心脏停搏模型，可用于表征与心肌损伤相关的酶学、遗传学及组织学反应⁷。Peters et al. 利用微型化CPB模型构建心肌梗死并实施可控再灌注，以通过局灶性缺血与再灌注损伤分析心脏功能障碍⁸。Jungwirth et al. 首次建立了深低温停循环（DHCA）模型，该模型可阐明由DHCA引起的全脑缺血与再灌注损伤，并支持潜在神经保护策略的研究⁶。使用DHCA的研究所关注的是低温、再灌注和/或溶血触发的信号事件的影响⁹。深低温可能影响多种酶和信号通路的激活与失活，但其具体机制尚不明确¹⁰。另一方面，必须采用心脏停搏模型或心肌缺血模型来研究缺血与再灌注所致的心脏损伤。这些高度模拟人类CPB过程的大鼠CPB模型，有助于揭示与CPB相关的病理生理过程，并为减轻CPB相关并发症提供支持。

本方案展示了在大鼠中建立一种不使用输血或正性肌力药物的简单体外循环模型。该模型可用于研究体外循环引起的长期多器官后遗症。

方案

实验前，所有大鼠应给予一周时间适应环境。涉及动物的手术操作必须依照《实验动物护理与使用指南》（www.nap.edu/catalog/5140.html）或其他适当的伦理准则进行。实验方案须经相关机构动物福利委员会批准后方可实施。所有后续操作均须在无菌条件下进行。 

1. 准备体外循环回路

注意：穿戴个人防护装备，包括手套、护目镜以及洁净外套或一次性防护服。

1. 体外循环（CPB）管路的建立
   1. 将聚氯乙烯管路与专为体外循环（CPB）设计的静脉储血器及改良的新生儿膜式氧合器连接，如图1所示。确保所有连接处紧密，无漏水现象。
   2. 根据制造商的操作说明，将体外循环（CPB）管路安装至滚压泵装置上。
   3. 将滚压泵置于可调节高度的台面上，并将台面高度调节至低于实验台10 cm处。
2. 体外循环（CPB）管路的预充
   1. 将12 mL羟乙基淀粉溶液与0.1 mL肝素及0.5 mL 7%碳酸氢钠溶液混合，用于体外循环（CPB）管路的预充。
   2. 在滚压泵缓慢转动的同时，用11 mL预充液对管路进行预充。将一根18号排气针插入储血器中以排出空气。
   3. 轻敲膜式氧合器并倾斜其位置，以充分排除其中空气。必须彻底排除空气，以避免空气栓塞及氧合不足。在管路预充过程中，使用置于储血器上方的电热灯对管路进行加热。

2. 体外循环前的操作步骤

注意：手术区域和器械在使用前应使用70%酒精或季铵盐化合物进行消毒。

1. 麻醉与动物准备
   1. 使用3.0%异氟烷混合空气通过麻醉机吸入法麻醉大鼠。将大鼠置于操作台架上，经口插入16号套管针至气管。根据当地动物护理指南确定镇痛药物的剂量与给药频率（例如
      布托啡诺 0.005 mg/kg 皮下注射
      ​注意：大鼠必须处于深度麻醉状态并丧失反射。呼吸应保持节律性，但不可停止。
   2. 将大鼠转移至配备电热垫的手术台。启动机械通气，潮气量为8 mL/kg，呼吸频率为70次/分钟，并通过氧传感器监测30%的吸入氧浓度。
   3. 以1.5–2.0%异氟烷维持麻醉，并在体外循环（CPB）开始时追加给予氯胺酮/赛拉嗪。
   4. 使用直肠探头监测直肠温度。通过调节加热垫的温度并将电路置于加热灯下，维持37 °C的正常体温。
   5. 将大鼠置于仰卧位，用针固定四肢以拉直。通过将心电图电极针置于双侧肩部和左侧腹部来监测心率。用湿润纱布覆盖眼睛或涂抹眼膏以防止干燥。
2. 插管
   1. 用70%乙醇或其他消毒液喷洒全身表面进行消毒后，使用剃刀剃除双侧腹股沟区域和右侧颈部区域的毛发。皮肤切口前应使用局部麻醉剂（如利多卡因）。注意：作为替代方案，可对切口部位进行外科刷洗，代替全身喷洒70%乙醇，以避免体温下降。
   2. 在双侧腹股沟区及右侧颈部用剪刀切开皮肤（约5 mm），钝性分离组织，暴露右侧主股动脉。仔细分离动脉与其邻近的静脉和神经。用4-0丝线结扎股总动脉末端，并通过牵拉暴露血管。
   3. 用显微剪刀垂直于右股总动脉方向剪开动脉壁（约1 mm），从切口处小心插入24号静脉导管，深度达1 cm，用于监测全身动脉压及分析动脉血中气体分压。
   4. 从导管给予肝素钠（500 IU/kg）。
   5. 按照步骤 2.2.2 和 2.2.3，将 24 号静脉导管插入左侧股总动脉，作为体外循环回路的动脉灌注通路。
   6. 将一根17号多孔血管导管插入右侧颈内静脉，并推进至右心房和下腔静脉（IVC）。切勿粗暴推进导管，以免血管破裂。将导管连接至体外循环（CPB）管路以进行静脉引流。
   7. 用湿润的纱布覆盖每个插管区域，以避免污染。

3. 体外循环期间的操作步骤

1. 在体外循环期间，以 0.8 L/min 的流速向氧合器输送 100% 的氧气，并将呼吸频率降低至 30 次/分钟。动脉血氧分压应维持在 200 至 400 mmHg 之间。
2. 体外循环开始时，将加热垫的温度设定调至最高值 42 °C，以缓解体外循环启动后体温的急剧下降。当体温恢复至 36 °C 时，将设定温度调整为 37 °C。
3. 谨慎启动体外循环血流，并密切观察储血器内血液体积。储血器排空可能导致空气栓塞。若储血器内血液体积减少，可通过调节台面高度或改变引流导管位置来降低泵流量。切勿重新调整静脉引流导管位置，以免造成右心房穿孔和/或心律失常。
4. 将泵流量逐步增加并维持在 100 mL/kg/min，同时将平均动脉血压维持在 70 mmHg。当血压稳定时，储血器内至少保留 1 mL 的少量血液是可接受的。若储血器内血液少于 1 mL，则可能引发器官空气栓塞。
5. 若血压不稳定，可向循环管路中加入 2–3 mL 预充液（但可能导致体外循环后贫血）。

4. 体外循环后操作步骤

1. 夹闭静脉引流管并将其从体外循环管路中移除。将管路中剩余的血液缓慢输注至动脉，以维持血压。
2. 将呼吸频率增加至 70 次/分钟。
3. 移除静脉引流导管和左侧动脉导管，随后在血管的近端和远端进行结扎。
4. 在体外循环（CPB）结束 60 分钟后，从右侧股动脉移除动脉导管。
5. 用生理盐水清洗各处伤口，并用缝线闭合伤口。
6. 检查动物自主呼吸恢复情况后，停止麻醉并拔除气管插管。
7. 给予加温的无菌等渗液体，并使用加热垫和电热灯为动物保温。在动物从麻醉中恢复期间应频繁检查其状态。必要时提供呼吸支持。注意：一旦动物开始活动，应将热源从笼子的一部分移开，以便动物可自行选择温暖或凉爽区域。
8. 在呼吸功能完全恢复前，将动物单独饲养，避免与其他动物接触。在动物完全恢复前不得将其归群。
9. 麻醉恢复后监测食物和水的摄入情况，并提供适当的营养支持。给予镇痛药物，并观察是否存在不适或疼痛的迹象。

结果

图1 显示了完整的体外循环（CPB）管路。该模型中的生理变量如图2所示，包括直肠温度、平均动脉血压和心率。图3展示了体外循环期间的动脉血气分析结果，包括动脉血氧分压、动脉血二氧化碳分压、红细胞压积、碱剩余、血清钾浓度以及氢离子浓度（pH）。在整个过程中，心率和平均动脉压保持稳定。由于预充液体引起的血液稀释，体外循环开始时直肠温度和红细胞压积有所下降。由于膜式氧合的作用，动脉血氧分压在体外循环期间显著升高。图4展示了肺组织的代表性苏木精-伊红染色图像，包括体外循环组（图4B、D）和假手术组（图4A, C）的图像，以及体外循环后与基线相比的PaO_...

讨论

在该大鼠体外循环（CPB）模型中，血清和肺组织中炎症细胞因子及高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）的表达水平显著升高，其中HMGB-1是调控炎症反应的关键转录因子。既往临床研究表明，接受心血管手术的患者血清中HMGB-1的分泌水平升高¹¹，且CPB期间血清HMGB-1水平的峰值与术后更严重的全身性炎症反应综合征及肺氧合功能障碍相关¹²。此外，血清HMGB-1水平是预测重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者重症监护病房死亡率的独立生物标志物¹³。该大鼠CPB模型成功模拟了与炎症细胞因子及HMGB-1激活相关的严重CPB后ARDS。

由于大鼠模型在研究全身性炎症反应方面具有重要价值，许多关于体外循环（CPB）相关全身炎症的研究均采用大鼠模型，这些反应包括促炎性细胞因子表达¹⁴、核因子κB活化¹⁵、黏附分子介导的中性粒细胞活化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
啮齿类动物呼吸机 7025	Ugo Basile	7025	呼吸机
OxiQuant B	ENVITEC	46-00-0023	氧气传感器
CMA 450 温度控制器	CMA	8003759	温度控制器
CMA 450 加热垫	CMA	8003763
CMA 450 直肠探头	CMA	8003761
DIN(8) 转一次性血压传感器	ADInstruments	MLAC06
一次性血压传感器	ADInstruments	MLT0670
IX-214 数据记录仪	iWorx Systems	IWX-214	放大器
LabScribe 软件	iWorx Systems		软件
滚压泵	Furue Science	Model RP-VT	泵
Happy Cath	Medikit	EB 19G 4HCLs PP	17 号多孔血管导管
SURFLO ETFE 静脉导管	Terumo	SR-OX2419CA	24 号血管导管
氧合器	Mera	HPO-002
体外循环管路	Mera	custom-made
Hespander 液体溶液	Fresenius Kabi	3319547A4035	羟乙基淀粉