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使用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀

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DOI：

10.3791/57016

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2018年1月29日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 2Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 3Cancer Research Summer Internship Program (CARSIP), Cancer Biology Program, University of Michigan Medical School, 4Department of Biology, University of Puerto Rico-Río Piedras Campus

本文内容

摘要

表观遗传机制在胶质瘤中经常发生改变。染色质免疫沉淀可用于研究胶质瘤中由组蛋白修饰变化引起的遗传改变后果，这些修饰调控染色质结构和基因转录。本方案描述了对小鼠脑肿瘤神经球进行的天然染色质免疫沉淀实验。

摘要

表观遗传修饰可能参与胶质瘤的发生和发展。癌基因和肿瘤抑制基因的启动子及调控区域的甲基化和乙酰化改变可导致基因表达的变化，并在脑肿瘤的发病机制中发挥重要作用。天然染色质免疫沉淀（ChIP）是一种常用技术，可用于检测与DNA紧密结合的修饰或其他蛋白质。与交联ChIP不同，在天然ChIP中，细胞不经过甲醛处理以共价连接蛋白质与DNA。这种方法具有优势，因为有时交联会固定那些仅短暂与DNA相互作用、在基因调控中并无功能意义的蛋白质。此外，抗体通常是针对未固定的肽段产生的，因此在天然ChIP中抗体的特异性更高。然而，需要注意的是，天然ChIP仅适用于研究组蛋白或其他与DNA紧密结合的蛋白质。本方案描述了在小鼠脑肿瘤神经球上进行的天然染色质免疫沉淀实验。

引言

表观遗传事件在胶质瘤中十分常见，可能在肿瘤发病机制中发挥重要作用。事实上，在儿童高级别胶质瘤中，编码组蛋白变体H3.3和H3.1的基因常发生突变1。这些突变影响组蛋白修饰，并产生重大的表观遗传学后果2,3。在青少年至成年患者中，则常见异柠檬酸脱氢酶基因1/2（IDH1/2）的反复突变，该突变会抑制依赖α-酮戊二酸（α-KG）的组蛋白和DNA去甲基化酶，同时还存在其他染色质调控因子（如ATRX和DAXX）的遗传学改变4。因此，研究影响表观遗传调控因子的突变如何改变染色质结构和调控性组蛋白修饰具有重要意义，这些改变继而会对肿瘤细胞的转录组产生显著影响。

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于评估基因组中表观遗传修饰影响的有力工具5,6,7。在天然ChIP中，染色质通过微球菌核酸酶（MNase）进行消化，然后使用针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，最后从免疫沉淀的染色质复合物中纯化DNA6。该实验过程中细胞不进行固定，因此该技术仅适用于研究与DNA紧密结合的蛋白质6。由于无需交联，有助于提高抗体的特异性，因为抗体通常是针对未固定的多肽或蛋白质制备的7。此外，由于没有交联步骤，可降低非特异性且无调控功能的瞬时蛋白-DNA相互作用被固定的概率7,8。ChIP可用于鉴定特定基因组区域中组蛋白修饰的富集情况。本文详细描述了一种在源自胶质瘤基因工程小鼠模型的神经球（NS）中进行天然ChIP的实验方案。

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方案

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 脑肿瘤NS的生成及培养条件。

  1. 准备神经干细胞培养基（NSC），成分为DMEM/F12培养基、B27添加剂（1×）、N2添加剂（1×）以及抗菌试剂。在使用当天，向NSC培养基中添加人重组表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF），终浓度均为20 ng/mL。
  2. 使用Sleeping Beauty转座子系统在小鼠中诱导脑肿瘤，将编码癌基因或靶向肿瘤抑制基因的shRNA的质粒注射到新生小鼠的侧脑室，以生成自发性脑肿瘤9选择一只肿瘤较大的小鼠，并通过生物发光成像确认。
    注意：有关Sleeping Beauty转座子系统及所用质粒构建体的更详细信息，可参见Calinescu 等9.
    1. 为成像小鼠，使用26号针头经腹腔注射100 µL浓度为30 mg/mL的荧光素溶液。
    2. 注射荧光素5分钟后，使用麻醉室，以2%异氟烷/氧气气流对动物进行麻醉。
    3. 当动物被麻醉后（通常为2-3分钟），将其放入生物发光成像室，通入含2%异氟烷的氧气。若动物麻醉时间超过5分钟，需使用眼用软膏以防止麻醉期间角膜干燥。
    4. 使用成像设备对小鼠进行成像 体内 具有以下参数的光学成像系统：自动曝光、大尺寸像素合并、光圈 f=1。判断为大肿瘤的参数是生物发光信号 >106 光子/秒/厘米²2/sr.
  3. 在密闭容器中使用过量异氟烷吸入麻醉剂处死小鼠，通过脚趾夹捏法确认动物已麻醉后，对小鼠进行断头。
  4. 提取脑组织，并按照 Calinescu 之前所述的方法进行解剖 等9.
  5. 将脑组织置于一个10 cm的培养皿中。如果诱导的肿瘤表达荧光蛋白，则使用荧光体视显微镜，设置为相应的荧光通道和0.3倍放大倍数；否则，通过组织颜色和质地的差异来识别肿瘤组织。使用手术刀和镊子将肿瘤组织与正常脑组织分离。
  6. 将肿瘤在培养皿中切碎成小块。将分离的肿瘤组织放入含有300 µL NSC培养基的1.5 mL离心管中。
  7. 使用与锥形微量离心管管壁贴合的一次性塑料研磨杵轻轻匀浆肿瘤组织。加入1 mL细胞解离液，于37 °C孵育5分钟。
    注意：使用研杵可能会导致部分细胞死亡。如果读者希望最大限度地提高细胞活力，可省略使用研杵。
  8. 将步骤1.7中的细胞悬液通过70 µm细胞滤网，并用25 mL NSC培养基冲洗滤网。
  9. 在室温下以 300 x g 离心悬浮液 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 6 mL NSC 培养基中。
  10. 将步骤1.9中的肿瘤细胞悬液接种至T-25培养瓶中，在37 °C、含95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中进行培养。2通常在3天后，会观察到部分死亡细胞、贴壁细胞以及一些在培养基中悬浮生长并形成神经球（NS）的细胞混合存在。
  11. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，使用微量移液器仅收集沉降至管底的细胞，并重新接种至T-75组织培养瓶中。
  12. 以相对较高的密度（1-3 × 10⁶ 细胞/mL）培养细胞6 T-25 培养瓶中的细胞在达到汇合时进行传代。
    注意：融合度由球体大小决定。较大的球体出现黑色中心表明其中心存在死亡细胞，提示应立即传代细胞。
  13. 每三天添加一次生长因子（EGF 和 bFGF，各 20 ng/mL）。当细胞未达到汇合且培养基变为浅橙色时，更换培养基。
  14. 更换培养基时，收集旧培养基，在室温下以300 × g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于添加了EGF和FGF（浓度按步骤1.1规定）的NSC培养基中。
    注意：如果类球体处于中等到高密度状态，但尚未准备好传代（类球体尺寸较小，直径 < 100 µm），则可将沉淀物分装至两个培养瓶中。
  15. 将细胞传代时，于室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞在细胞解离培养基中于 37 °C 孵育 5 分钟。
    1. 加入5 mL平衡盐溶液以稀释解离培养基，在室温下以300 x g离心5分钟。
    2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于18 mL NSC培养基中，并将悬液均分为三份，分别加入三个T-25培养瓶中。
  16. 为冻存细胞分装物，按照步骤1.15所述方法消化细胞，并将细胞以每管1 mL分装至含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜的冻存液中。将细胞置于冰上10分钟，随后于-20 °C保存30分钟，再于-80 °C保存1天，逐步降温。次日，将细胞转移至液氮储存容器中。

2. 原位染色质免疫沉淀（Native ChIP）

  1. 染色质制备
    1. 配制好衍生神经球（NS）的储备液后，将NS置于T-75培养瓶中，加入15 mL NSC培养基，在37 °C、95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中进行培养。2 直至NS细胞长满。一个长满的T-75培养瓶可收获3-5 × 106 细胞
    2. 当细胞达到融合状态时，将NS以300 × g离心5分钟，弃去上清液，加入1 mL细胞解离液。在37 °C孵育5分钟。加入5 mL培养基，使用血细胞计数板对细胞进行计数。10.
      注意：1 x 106 每次免疫沉淀（IP）反应需要的细胞数量。注意，必须同时设置前免疫血清或IgG对照11.
    3. 在1.5 mL微量离心管中，以300 × g离心5分钟，弃去上清液，用1 mL平衡盐溶液重悬神经球（NS）沉淀，并将悬液转移至低蛋白结合力的1.5 mL微量离心管中。
    4. 在300 × g条件下离心NS样品5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于95 µL消化缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM CaCl₂）中2，每1×10含0.2%聚乙二醇辛基苯基醚）6 加入高浓度蛋白酶抑制剂混合物（1:100）的细胞。立即轻轻吹打细胞悬液，防止细胞结团，并避免产生气泡。
    5. 将微球菌核酸酶（MNase）重悬于50%甘油中，配制成1 mg/mL溶液（1.15单位/µL，于-20 °C保存），以下简称 "1x" 储备液。制备一个 "0.1x" 通过用50%甘油进行第二次1:9稀释来制备储备液（例如，900 µL的 "1x" MNase 和 100 µL 50% 甘油），于 -20 °C 保存。
    6. 混合 5 µL 的 "0.1x" MNase 和 145 µL 消化缓冲液。酶始终需置于冰上。每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 µL 用消化缓冲液稀释的 MNase。6 细胞。轻轻弹击离心管以混匀，将离心管置于37 °C金属浴中，准确孵育12 min。每次处理一个样本，以确保孵育时间精确为12 min。
    7. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 10 µL 10× MNase 停止缓冲液（110 mM Tris-HCl，pH 8.0，55 mM EDTA）6 细胞。从此步骤开始，样品必须始终保持在冰上。
    8. 加入 110 µL "2x RIPA 裂解缓冲液" （280 mM NaCl，1.8% 聚乙二醇辛基苯基醚，0.2% 十二烷基硫酸钠（SDS），0.2% 脱氧胆酸钠，5 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）；4 °C 保存），每 1 × 10 添加高浓度蛋白酶抑制剂混合物（1:100）6 细胞。轻轻弹击管壁以混匀。
    9. 在4 °C、1700 × g条件下，将离心管在微量离心机中离心15分钟。将上清液转移至新的普通1.5 mL微量离心管中（无需再使用低蛋白吸附的微量离心管），并置于冰上保存。弃去沉淀。
  2. 免疫沉淀（IP）
    1. 将蛋白A和蛋白G磁珠按1:1比例混合。每次免疫沉淀（IP）准备25 µL磁珠。
    2. 加入1 mL RIPA缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，140 mM NaCl，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1% SDS，0.1%脱氧胆酸钠；4 °C保存），并添加低浓度蛋白酶抑制剂（1:1000），洗涤磁珠。
    3. 使用磁铁使磁珠与洗涤液分离，倾去洗涤液（约1分钟）。重复洗涤步骤两次。
    4. 使用含有蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液将磁珠重悬至原始体积。
    5. 如有需要，使用添加了蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液稀释染色质，使每次免疫沉淀（IP）的体积为100–200 µL。为每份IP所用染色质体积的10%保留作为输入样本。
      注意：例如，如果每次免疫沉淀使用 200 µL，则应保留 20 µL 稀释后的染色质作为输入样本。若共进行四次免疫沉淀，染色质总体积应稀释至 820 µL。
    6. 准备输入样品。向输入样品中加入100 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA），并添加蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，混匀后于55 °C孵育1小时。
      注意：步骤 2.2.6–2.2.7 可与步骤 2.3.4 和 2.4.1 同时进行。
    7. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化样本，并用试剂盒提供的洗脱缓冲液洗脱，洗脱体积为50 µL。
    8. 使用微量分光光度计测定输入样品的浓度，并将结果记录在实验记录本中。以试剂盒中的洗脱缓冲液作为空白对照。
      注意：在小鼠神经球实验中，每次免疫沉淀使用约 6 µg DNA。
    9. 在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，或使用标准设置将1 µL样品上样至DNA Bioanalyzer。剩余样品保存备用，用于后续实验中的input对照。
    10. 加入10 µL洗涤后的蛋白A &每 IP 使用 #38; G 磁珠，在 4 °C 下孵育 IP 1 小时。
      注意：例如，加入 30 µL 蛋白 A & G 磁珠用于三次免疫沉淀。
    11. 将样品置于磁架上，使磁珠分离。将之前确定数量的染色质转移至新的1.5 mL离心管中，完成分样。
    12. 加入抗体，用塑料封口膜包裹管盖以防止蒸发。将样品在4 °C下旋转孵育过夜，转速为20 rpm。
      注意：浓度应根据制造商的建议通过实验确定。
    13. 第二天，使用小型离心机在室温下以2000 × g离心10秒。然后向每个免疫沉淀（IP）样品中加入10 µL磁珠，在4 °C、20 rpm转速下旋转孵育3小时。
  3. 免疫沉淀洗涤与蛋白质消化
    1. 加入150 µL含有低浓度（1:1000）蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液至每次免疫沉淀样品中，于4 °C、20 rpm转速下旋转孵育5分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠充分分离。用移液器吸除上清液。重复此步骤进行五次洗涤。
    2. 加入150 µL LiCl缓冲液（250 mM LiCl，10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Na-脱氧胆酸钠；4 °C保存），并添加低浓度蛋白酶抑制剂（1:1000），分别加入各免疫沉淀（IP）样品中，于4 °C以20 rpm转速旋转孵育5分钟。将样品置于磁力架上，静置使磁珠分离。用移液器吸除上清液。
    3. 加入150 µL冰冷的TE缓冲液（不含蛋白酶抑制剂），将样品在4 °C、20 rpm转速下旋转孵育5分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸除上清液。
    4. 最后洗涤步骤完成后，将样品重悬于100 µL含有蛋白酶K（0.5 mg/mL）的TE缓冲液中，于55 °C孵育1小时。
  4. DNA纯化与染色质免疫沉淀定量实时PCR（qPCR）
    1. 使用PCR纯化试剂盒纯化免疫沉淀的DNA。向每个样品中加入试剂盒提供的DNA结合缓冲液后，将离心管置于磁力架上，等待磁珠完全聚集，随后将上清液转移至纯化柱中。按照制造商说明书操作，最后用试剂盒提供的50 µL洗脱缓冲液进行洗脱。
    2. 为了检测免疫沉淀是否成功，进行qPCR。理想情况下，应针对阳性对照区域和阴性对照区域设计引物。
      注意：例如，在使用 H3K4me3 和 H3K27me3 进行免疫沉淀实验时，qPCR 应检测以下样品：H3K4me3、H3K27me3 和 IgG ChIP DNA、input DNA，以及无模板对照（NTC），并使用针对 H3K4me3 富集区域（阳性对照）和非 H3K4me3 富集区域（阴性对照）的引物；H3K27me3 的检测 likewise 采用相同策略。
    3. 遵循标准操作流程进行qPCR实验12简而言之，使用SYBR Green预混液、各0.5 µL的10 µM正向和反向引物工作浓度溶液，以及2 µL的ChIP或input DNA进行qPCR反应。使用实时荧光定量PCR系统读取板孔信号。引物序列见于 表2Hwang 提供的 Gapdh 引物序列 等被使用13.
    4. 将ChIP数据相对于input进行分析， 即， 输入百分比法（% IP）14. 使用以下公式计算输入百分比：
      调整后的输入值 = 输入值的平均ct - 对数2（DF）
      其中 DF 为起始输入的稀释因子
      DF = IP 总体积 / 上样体积
      % IP = 100 × 2^(校正后的输入值 - Ct (IP))
      其中Ct为阈值因子。

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结果

从表达Katushka的脑肿瘤细胞来源的脑肿瘤中生成的肿瘤NS的示意图如图所示 图1. 图2 是整个ChIP技术的示意图。 图3 显示了脑肿瘤NS来源的染色质经MNase消化12分钟后产生的代表性结果，主要生成单核小体、二核小体和三核小体。ChIP完成后，可对ChIP样品及input DNA样品进行qPCR分析。 图4 显示了针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因的代表性ChIP qPCR数据。Gapdh是一种看家基因，其启动子区域富集H3K4me3修饰，该修饰与活跃转录相关。结果显示，Gapdh基因富集H3K4me3，而不富集与染色质抑制区域相关的H3K27me3修饰。

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讨论

本文所述方案可使用户对源自基因工程脑肿瘤的神经干细胞（NS）进行天然染色质免疫沉淀（ChIP）实验。与交联ChIP相比，该方法仅适用于与DNA紧密结合的蛋白质研究6。实验所用细胞数量可根据需要调整，方案亦可按比例放大。我们每轮免疫沉淀（IP）使用1 × 106个细胞，但天然ChIP也可少至4 × 104个细胞即可完成5。在本方案中，我们通过qPCR分析ChIP所得DNA；然而，该方案亦可与下一代测序技术结合，用于全基因组水平上的蛋白质-DNA相互作用研究。我们已成功应用此ChIP方案，分析胶质瘤癌基因对肿瘤细胞基因组特定区域组蛋白修饰沉积的影响。

进行天然染色质免疫沉淀（native ChIP）时有几个关键步骤。首先，每种细胞类型的消化条件必须通过实验经验确定。大部分染色质应为单核小体（150 bp），并伴有少量二联和三联核小体峰（图3）。我们的方案可获得超过70%的单、双或三联核小体...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助 & 美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）资助项目 R37-NS094804、R01-NS074387、R21-NS091555，授予 M.G.C.；NIH/NINDS 资助项目 R01-NS076991、R01-NS082311 和 R01-NS096756，授予 P.R.L.；NIH/NINDS R01-EB022563；神经外科系；Leah's Happy Hearts 及 Chad Though 基金会资助 M.G.C. 和 P.R.L.。RNA 生物医学资助项目 F046166，授予 M.G.C.。F.M.M. 获 NIH/NINDS F31 资助项目 F31NS103500 支持。R.I.Z.-V. 获 NIH/NIGMS 资助项目 5T34GM007821-37 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent 2100 生物分析仪AgilentG2946-90004生物分析仪
AccuSpin Micro 17R，制冷型Fisher Scientific13-100-676
C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 小鼠
氯化钙Aldrich22350-6缓冲液试剂
D-荧光素钾盐GoldbioLucK-1g
DiaMag1.5 磁力架DiagenodeB04000003用于磁珠洗涤
DiaMag 旋转混合仪 EUDiagenodeB05000001旋转混合仪
DMEM/F-12Gibco11330-057NSC 组分
Dynabeads Protein AThermo Fisher Scientific10001DProtein A 磁珠
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10003DProtein G 磁珠
EGFPeproTechAF-100-15用 0.1% BSA 配制 20 μg/mL 储存液，并分装。
乙二胺四乙酸（EDTA）SigmaE-4884缓冲液试剂
乙二醇双（β-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）SigmaE-4378缓冲液试剂
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612qPCR 试剂
胎牛血清Gibco10437028用于细胞冻存
FGFPeproTech100-18b用 0.1% BSA 配制 20 μg/mL 储存液，并分装。
镊子Fine Science Tools11008-13用于肿瘤解剖
甘油，分子生物学级EMD- Millipore356352
H3K4me3AbcamAb8580
H3K27me3Millipore07-449
HBSSGibco14175-103平衡盐溶液
FlurisoVETone501017吸入性麻醉剂
Ivis SpectrumPerkin-Elmer124262活体光学成像系统
HyqtaseHyClonSV3003001细胞解离液
氯化锂SigmaL8895缓冲液试剂
低吸附微量离心管Corning CostarCLS3207低蛋白结合微量离心管
微量离心管Fisher21-402-903普通微量离心管
微球菌核酸酶Thermo Fisher Scientific, Affymetrix70196Y不同批次可能有差异；应购买足够量并分装。
N2Gibco17502-048NSC 组分
正常兔 IgGMillipore12-372
NormocinInvivogenNOL-36-063抗菌剂，使用浓度为 0.1 mg/mL。
NP-40（Igepal CA-630）Sigma18896-50ML缓冲液试剂
Kimble Kontes 研磨杵Fisher ScientificK749515-0000
蛋白酶抑制剂混合液Sigma-AldrichP8340分装后于 -20 °C 保存。
蛋白酶 KSigma-AldrichP2308用纯水配制成 10 mg/mL 储存液；分装后于 -20 °C 保存。
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104DNA 纯化试剂盒
手术刀Fine Science Tools10007-16用于肿瘤解剖
氯化钠VWR0241-5KG缓冲液试剂
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD670-25G缓冲液试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）SigmaL-4390缓冲液试剂
Tris 碱Thermo Fisher ScientificBp152-1缓冲液试剂
吐温 X-100Thermo Fisher ScientificBP 151-500聚乙二醇辛基苯基醚
标准小型离心机Fisherbrand12-006-901标准小型离心机
SZX16 显微镜OlympusSZX16荧光体视显微镜
ViiA 7 快速 96 孔实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems4453535
Nanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W

参考文献

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