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人端粒酶逆转录酶蛋白依赖RNA的RNA聚合酶活性的半定量检测

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DOI：

10.3791/57021

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2018年6月12日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

人端粒酶逆转录酶（TERT）不仅可合成端粒DNA，还可通过依赖RNA的RNA聚合酶活性合成双链RNA。本文介绍了一种新建立的检测内源性TERT依赖RNA的RNA聚合酶活性的实验方法。

摘要

人端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶的催化亚基，通过依赖RNA的DNA聚合酶活性延长端粒。尽管TERT被命名为逆转录酶，但对其结构和系统发育的分析表明，TERT属于右手型聚合酶家族，与病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）以及病毒逆转录酶具有关联性。我们首次鉴定出人TERT具有RdRP活性，该活性可针对模板非编码RNA生成互补RNA链，并在癌细胞中参与RNA沉默过程。为了分析这种非经典的酶活性，我们于2009年开发了基于重组TERT的RdRP检测方法，随后建立了针对内源性TERT的in vitro RdRP检测体系。本文中，我们描述的是后一种方法。简言之，从细胞中分离TERT免疫复合物，与模板RNA及包含放射性标记rNTP的rNTPs共同孵育以进行RdRP反应。为消除单链RNA，将反应产物用RNase I处理，最终产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。放射性标记的RdRP产物可在过夜曝光后通过放射自显影检测。

引言

人端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶的催化亚基，它利用端粒酶RNA组分（TERC）这一特异性RNA模板来延长端粒1。尽管TERT作为端粒酶的组成部分负责端粒DNA的聚合，但结构与系统发育分析表明，TERT与病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）以及病毒逆转录酶密切相关，并与这些聚合酶共享结构域2,3,4。RdRP是一种以RNA为模板合成互补RNA链的酶。该酶不仅存在于病毒中，也存在于植物、酵母和线虫等模式生物中，RdRP介导的双链RNA合成在这些生物中参与转录和转录后水平的基因沉默5,6。尽管长期以来人类中未发现RdRP，我们在2009年发现人TERT具有RdRP活性7。

我们首先利用重组蛋白证实了TERT的RdRP活性7，然后建立了一种灵敏的 体外 检测内源性TERT的RdRP活性的实验方法8在这里，我们演示了 体外 内源性TERT的RdRP检测（IP-RdRP检测）。该方法首先对内源性TERT进行免疫沉淀（IP），随后进行 体外 RdRP 反应，其中放射性核糖核苷酸被掺入新生的 RNA 链中。

方案

1. 试剂配制

  1. 细胞同步化所用试剂
    1. 为制备含有 2.5 mM 胸腺嘧啶的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），将 30.28 mg 胸腺嘧啶溶解于 1 mL 细胞培养级水中，配制成 125 mM 胸腺嘧啶溶液。使用 0.22 μm 注射器滤器过滤该溶液。每 50 mL 添加 10%（vol/vol）胎牛血清（FBS）的 DMEM 中加入 1 mL 新鲜配制的 125 mM 胸腺嘧啶溶液。
    2. 为制备含有 0.1 μg/mL 诺考达唑的 DMEM，将诺考达唑溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 5 μg/μL 的诺考达唑溶液。每 50 mL 添加 10%（vol/vol）FBS 的 DMEM 中加入 1 µL 的 5 µg/µL 诺考达唑溶液。
    3. 为制备含有 0.002%（vol/vol）DMSO 的 DMEM，每 50 mL 添加 10%（vol/vol）FBS 的 DMEM 中加入 1 µL DMSO。
  2. IP-RdRP 实验所用试剂
    1. 配制裂解缓冲液 A：150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl（pH 7.4）和 0.5%（vol/vol）Nonidet P-40（NP-40）。将该试剂储存于 4 °C。
    2. 配制 5x 醋酸盐缓冲液：50 mM 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）-KOH（pH 7.8）、500 mM 醋酸钾和 20 mM MgCl2。将该试剂储存于室温。
    3. 配制洗涤缓冲液 1：1x 醋酸盐缓冲液、10%（vol/vol）甘油、0.1%（vol/vol）Triton X-100 和 0.06x 蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA）。洗涤缓冲液 1 应在使用当天或前一天配制，并储存于 4 °C。
    4. 配制 AGC 溶液：1x 醋酸盐缓冲液、10%（vol/vol）甘油和 0.02%（wt/vol）3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸（CHAPS）。将该试剂储存于 4 °C。
    5. 为制备含有 2 mM CaCl2 的 AGC 溶液，每 50 mL AGC 溶液中加入 100 µL 的 1 M CaCl2。将该试剂储存于 4 °C。
    6. 为制备含有 3 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）的 AGC 溶液，每 50 mL AGC 溶液中加入 375 µL 的 0.4 M EGTA（pH 7.5）。将该试剂储存于 4 °C。
    7. 配制洗涤缓冲液 2：1x 醋酸盐缓冲液和 0.02%（wt/vol）CHAPS。将该试剂储存于 4 °C。
    8. 配制 HMD 溶液：0.2 M HEPES-KOH（pH 7.8）、40 mM MgCl2 和 2 mM 二硫苏糖醇（DTT）。将该试剂储存于 -20 °C。
      注：HMD 溶液应至少每三个月更换一次。
    9. 配制 2x 蛋白酶 K 缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.6）、20 mM EDTA 和 1%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS）。将该试剂储存于 -20 °C。
    10. 配制 2x 上样缓冲液：95%（vol/vol）甲酰胺、20 mM EDTA 和 1%（wt/vol）橙 G。将该试剂储存于 -20 °C。

2. HeLa 细胞的制备

注意：准备处于有丝分裂期（经处理）或异步分裂（未经处理）的 HeLa 细胞。将细胞培养在含 5% CO2 的环境中，37 °C 条件下。

  1. HeLa 细胞有丝分裂的同步化
    1. 在 10 cm 培养皿中接种 1 × 106 个 HeLa 细胞，加入 10 mL DMEM 培养基（含 10% (vol/vol) 胎牛血清）。
    2. 接种两天后，弃去原培养基，更换为含 2.5 mM 胸腺嘧啶和 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 24 小时。
    3. 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）(-) 洗涤细胞三次，随后加入含 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 6 小时。
    4. 更换为含 0.1 µg/mL 诺考达唑和 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 14 小时。
    5. 轻轻摇动培养皿，收集含有脱落的有丝分裂期细胞的上清液。计数细胞数量，用于 IP-RdRP 检测。
    6. 在 4 °C 条件下，以 490 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      注：细胞沉淀可在 -80 °C 保存。
  2. 未处理 HeLa 细胞的制备
    1. 在 10 cm 培养皿中接种 1 × 106 个 HeLa 细胞，加入 10 mL DMEM 培养基（含 10% (vol/vol) 胎牛血清）。
    2. 接种两天后，更换为含 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 30 小时。
    3. 更换为含 0.002% (vol/vol) DMSO 和 10% (vol/vol) 胎牛血清的 10 mL DMEM 培养基，继续培养 14 小时。
    4. 使用含 1 mM EDTA 的 0.7 mL 胰蛋白酶（2.5 g/L）进行消化，收集细胞。计数细胞数量，用于 IP-RdRP 检测。
    5. 在 4 °C 条件下，以 490 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      注：细胞沉淀可在 -80 °C 保存。

3. 免疫沉淀-依赖RNA的RNA聚合酶（IP-RdRP）检测

  1. 蛋白A-琼脂糖微珠制备
    1. 将1 mL亲和树脂（柱体积500 µL）转移至1.5 mL微量离心管中。以800 x g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。
    2. 向珠子中加入 800 µL 裂解缓冲液 A，通过反复倒置试管充分混匀。在 800 x g 4 °C下离心3分钟，弃上清液。重复此步骤两次（共洗涤三次）。
    3. 向珠子中加入800 µL裂解缓冲液A，通过反复倒置试管数次充分混匀。将试管置于旋转摇床中，4 °C旋转孵育过夜（或至少4小时）。
    4. 以 800 x 离心试管 g 4 °C下离心3分钟，弃去上清液。
    5. 向珠子中加入500 µL裂解缓冲液A，通过反复倒置离心管充分混匀。将珠子置于4 °C保存。
  2. 细胞裂解液的制备
    1. （可选）如果在步骤2中细胞已被冷冻，请将冷冻的细胞置于冰上解冻，直至细胞变得松散。
    2. 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（无钙镁，PBS (-)）洗涤细胞一次。在 1,450 x g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。
    3. 用预冷的裂解缓冲液A裂解细胞（每1 × 10⁶个细胞加入1 mL裂解缓冲液A）7 通过轻柔吹打混悬细胞。
    4. 在1.5 mL离心管中对样品进行超声处理，条件如下：将超声仪的振幅设为25%，超声10秒。
    5. 以 20,400 x g 4 °C 下离心 15 分钟。
    6. 收集上清液。将上清液各1 mL转移至1.5 mL微量离心管中。
      注意：所有操作均须在无RNase条件下进行。
  3. 免疫沉淀
    1. 将步骤 3.2.6 得到的裂解液进行预清除，每 1 mL 裂解液中加入 40 µL（珠体积为 20 µL）预清洗的蛋白 A-琼脂糖珠。通过反复倒置离心管充分混匀，并在 4 °C 下旋转孵育样品 30 分钟。
    2. 以 13,000 x g 离心样品 g 在 4 °C 下离心 1 分钟，收集上清液。
    3. 加入40 µL预清洗的蛋白A-agarose微珠（床体积20 µL）和10 µg抗人TERT抗体（克隆号：10E9-2）8 加入预清除的裂解液中，通过反复倒置离心管充分混匀，并于4 °C旋转孵育过夜。
    4. 将样品在 3,300 x g 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。
    5. 用洗涤缓冲液1洗涤磁珠：向磁珠中加入1 mL洗涤缓冲液1，通过倒置离心管充分混匀，并在4 °C下旋转孵育5 min。在3,300 x g 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。重复此步骤额外三次。
    6. 用含有 2 mM CaCl 的 AGC 溶液洗涤磁珠一次2：加入1 mL含有2 mM CaCl的AGC溶液2 加入珠子后，通过倒置离心管充分混匀，并在4 °C下旋转孵育样品5分钟。随后在3,300 x g 4 °C下离心0.5分钟，弃上清液。
    7. 用微球菌核酸酶（MNase）处理珠子：配制如下所述的MNase反应混合液 表1将珠子用60 µL MNase反应混合液通过轻柔吹打重悬。将样品置于帕尔帖型孵育箱中，于摇床上以20至25 rpm轻轻振荡15分钟，温度为25 °C。
      注意：此步骤中必须使用往复式摇床，并严格遵守速度限制。不建议使用其他类型的摇床，例如旋转混合器。
    8. 将样品在 3,300 x g 4 °C下离心0.5分钟，弃上清液。
    9. 用含有 3 mM EGTA 的 AGC 溶液洗涤磁珠两次：向磁珠中加入 1 mL 含有 3 mM EGTA 的 AGC 溶液，通过倒置试管充分混匀，并在 4 °C 下旋转孵育 5 分钟。在 3,300 x g 在 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。重复此步骤一次。
    10. 用洗涤缓冲液2洗涤磁珠一次：加入1 mL洗涤缓冲液2 加入珠子后，通过倒置离心管充分混匀，并在4 °C下旋转孵育样品5分钟。在3,300 x g 4 °C 下离心 0.5 分钟，弃上清液。在准备 RdRP 反应时，将磁珠置于冰上保存。
      注意：所有操作均须在无 RNase 条件下进行。
  4. RdRP 反应
    1. 在新管中按照所述方法配制 RdRP 反应混合液 表 2.
    2. 加入6 µL的[α-32将P]UTP（3,000 Ci/mmol）加入混合物中，用移液器充分混匀。
      注意：[α-32P]ATP，[α-32P]CTP，或[α-32P]GTP 可用于该反应，以替代[α-32P]UTP
    3. 加入1 µL模板RNA（1 µg/µL），用移液器吹打混匀。
      注意：为建立 RdRP 检测，建议使用以下 RNA 模板：5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.
    4. 用移液器将20 µL步骤3.4.3中的RdRP反应混合物重悬珠子。
    5. 将样品置于帕尔帖式培养箱内的摇床转盘上，以32 °C轻轻振荡（20至25 rpm）2小时。
    6. 加入5.4 µL蛋白酶K（20 mg/mL）和45.4 µL 2×蛋白酶K缓冲液至反应混合物中。用移液器吹打混匀，将样品置于帕尔帖式孵育器内的转盘上，以20至25 rpm振荡反应30分钟，温度设为37 °C。
    7. 加入 109.2 µL 无 RNase 水至样品中。
    8. 加入 200 µL 酸性酚-氯仿至样品中。涡旋充分混匀，然后在 21,100 x g 室温下孵育5分钟。将水相转移至新管中。重复此步骤一次。
    9. 向水相中加入 20 µL 3 M 醋酸钠（pH = 5.2）、4 µL 沉淀载体和 250 µL 乙醇。充分振荡混匀试管，然后在 21,100 x g 4 °C 下离心 20 分钟。弃去上清液。
    10. 用 300 µL 预冷至 -20 °C 的 70%（体积/体积）乙醇洗涤沉淀。在 21,100 x g 4 °C 下离心 15 分钟。
    11. 弃去上清液，空气干燥沉淀物。
      注意：所有操作均须在无 RNase 条件下进行。
      注意：步骤 3.4.11 中获得的沉淀物可在 -20 °C 下保存至少 2 天。
  5. RNase 处理
    1. 将步骤 3.4.11 中的沉淀重悬于 20 µL 无 RNase 水中。
    2. 在新管中按如下所述配制 RNase 反应混合液 表3.
    3. 向样品中加入180 µL RNase反应混合液，37 °C孵育2小时。
    4. 加入2.3 µL 10%（体积比）SDS至样品中，37 °C孵育15分钟。
    5. 加入 2 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）至样品中，37 °C 孵育 15 分钟。
    6. 加入205 µL酸性酚-氯仿至样品中。涡旋充分混匀，然后在21,100 x g 室温下孵育5分钟。将水相转移至新管中。
    7. 向水相中加入 20 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）、4 µL 沉淀载体和 250 µL 乙醇。充分振荡混匀管内液体，随后在 21,100 x g 4 °C 下离心 20 分钟。弃去上清液。
    8. 用 300 µL 预冷至 -20 °C 的 70%（体积/体积）乙醇洗涤沉淀。将样品在 21,100 x g 4 °C 下离心 15 分钟。
    9. 弃去上清液，空气干燥沉淀。
      注意：步骤 3.5.9 中获得的沉淀物可在 -20 °C 下保存至少 2 天。
  6. 凝胶电泳和放射自显影
    1. 用20 µL无RNase的水重悬样品。
    2. 加入20 µL的2x上样缓冲液。
    3. 将样品在 95 °C 下煮沸 10 分钟。在冰上研磨样品。
    4. 运行凝胶。若模板长度为34个核苷酸（参见步骤3.4.3），则使用7 M 尿素-10%聚丙烯酰胺凝胶进行变性凝胶电泳。
    5. 使用凝胶干燥仪干燥凝胶。
    6. 将胶片与干燥的凝胶置于X射线暗盒中，并在-80 °C下使用增感屏曝光。

结果

使用推荐的RNA模板，在过夜曝光后，仅在处于有丝分裂期的HeLa细胞中可观察到20至30个核苷酸（nt）之间的放射性RdRP产物（图1A）。通常，RdRP产物的信号强度呈现两个峰值，分别位于约25 nt和30 nt处，这与通过下一代测序确认的产物大小分布一致9。与有丝分裂细胞相反，未进行同步化的HeLa细胞几乎不产生20–30 nt的放射性产物。所有样本中位于20 nt以下的椭圆形信号为非特异性漂移。

如果在有丝分裂的 HeLa 细胞中仅观察到约 30 nt 的微弱信号产物，则表明 RdRP 反应进行不充分。例如，若微球菌核酸酶（MNase）处理操作过于粗略或不适当，有丝分裂 HeLa 细胞中的信号强度会显著降低（图 1B）。使用陈旧的 HMD 溶液进行 RdRP 反应也会减少产物生成（图 1C）。

电泳结果，比较DMSO/诺考达唑对RNA完整性的影响；可见nt标记物。
图1：有丝分裂期HeLa细胞中内源性TERT的代表性RdRP产物。（A） 经诺考达唑（处理）或DMSO（未处理）处理的HeLa细胞中IP-RdRP检测的三个代表性结果。使用化学合成的34 nt RNA作为模板。（B） 在有丝分裂期HeLa细胞中进行IP-RdRP检测时，使用了不适当的MNase处理。（C） 在有丝分裂期HeLa细胞中进行IP-RdRP检测时，使用新鲜或陈旧的HMD溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂体积
微球菌核酸酶，20 U/µL1 µL
微球菌核酸酶缓冲液，10x8 µL
无RNase水51 µL

表1：MNase 反应混合液组分。

试剂体积
CHAPS, 0.07% (wt/vol)6 µL
HMD 溶液2 µL
rATP, 80 mM0.5 µL
rGTP, 8 mM1 µL
rUTP, 0.4 mM1 µL
rCTP, 8 mM1 µL
RNase 抑制剂, 40 U/µL0.5 µL
无 RNase 水1 µL

表2：RdRP反应体系组分。

试剂体积
RNase ONE 核糖核酸酶，10 U/µL0.2 µL
反应缓冲液，10x20 µL
无RNase水159.8 µL

表3：核糖核酸酶反应体系组分。

讨论

IP-RdRP 检测是一种用于检测人 TERT 的 RdRP 活性的敏感方法。TERT 蛋白在有丝分裂的 HeLa 细胞中高表达，其中 TERT 形成 RdRP 复合物8,9,10这表明有丝分裂期的HeLa细胞是检测RdRP活性的理想材料。在上述方案中，有丝分裂期细胞和非同步化的HeLa细胞分别作为阳性对照和阴性对照。如图所示 图1A在有丝分裂的HeLa细胞中，使用推荐的RNA模板进行RdRP实验，产物在20至30 nt范围内显示出广泛的放射性信号。除HeLa细胞外，我们还在多种不同类型的细胞系中进行了该实验，发现信号模式在不同细胞类型中可能发生变化。9：一些样品仅在约30 nt处显示出强信号，另一些则表现出与HeLa细胞相似的模式。我们还使用了除34 nt模板以外的其他RNA模板进行该检测8，短链和长链（约300 nt）且序列各异的RNA，并已成功利用这些模板获得RdRP产物，尽管可能存在一定的序列偏好性。然而，首次实验建议使用处于有丝分裂期的HeLa细胞以及34 nt的RNA模板。RdRP能够以引物依赖性和引物非依赖性两种方式生成双链RNA11我们已报道，TERT 作为人类 RdRP 可维持这一特性7,9TERT 通过反向引物机制，以具有 3'-折叠结构的 RNA 模板合成双链 RNA7对于34 nt的RNA模板，TERT在不使用引物的情况下合成互补链9为了特异性检测以非引物依赖方式合成的RdRP产物， 即从头合成 合成的RNA产物，[α-32P]NTP 可替换为 [γ-32P]NTP 在 RdRP 反应中的作用9.

在磁珠上的TERT免疫复合物中进行MNase处理是获得理想结果的关键步骤。如果MNase处理时间过长或振荡过于剧烈，RdRP产物将显著减少。为避免此类问题，我们强烈建议严格遵循本实验方案。HMD溶液是另一个影响成功的关键因素。如果发现信号非常微弱，应更换为新配制的HMD溶液。

在整个实验过程中，应格外注意避免RNase污染。核糖核酸酶处理应使用专用设备进行。操作核糖核酸酶后，应立即将接触过RNase的枪头和离心管丢弃，并使用专用溶液清除RNase例如 RNase Quiet) 并更换槽道。

TERT 不仅与 TERC 相互作用，还与多种内源性 RNA 相互作用，我们已报道了其中一部分7。对免疫沉淀-逆转录依赖性 RNA 聚合酶（IP-RdRP）检测方法进行改良，例如在不进行微球菌核酸酶（MNase）处理的情况下实施 IP-RdRP 检测，将能够全面列出 TERT 相关 RdRP 活性的内源性 RNA 模板，并通过生物信息学分析提供其序列特征的指导。我们已成功将该方案应用于组织裂解液。由于 TERT 在多种正常组织和肿瘤组织中均有表达，该检测方法可能有助于研究 TERT 在人类中的非经典酶学功能。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分由日本医疗研究开发机构（AMED）的癌症治疗创新研究开发项目（P-DIRECT）（15cm0106102h0002，K.M.）和癌症研究与治疗进化项目（P-CREATE）（16cm01061150001，K.M.）；武田科学振兴财团（Y.M.）；高松宫妃癌症研究基金资助项目（13-24520，Y.M.）；以及日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 JP16K07133（Y.M.）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM培养基和光044-29765
胎牛血清（FBS）CORNING35-010-CV
青霉素-链霉素混合溶液nacalai tesque26253-84
胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液nacalai tesque32777-44
磷酸盐缓冲液（PBS(-)）和光166-23555
胸腺嘧啶脱氧核苷nacalai tesque07147-61
诺考达唑SigmaM1404
二甲基亚砜（DMSO）nacalai tesque08904-85
氯化钠nacalai tesque31333-45
三(羟甲基)氨基甲烷nacalai tesque35434-21
盐酸nacalai tesque18321-05
Nonidet P-40 (NP-40)nacalai tesque25223-04
Pierce Protein A Plus 琼脂糖凝胶赛默飞世尔科技22812
2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）nacalai tesque17514-15
氢氧化钾和光168-21815
乙酸钾nacalai tesque28405-05
六水合氯化镁（MgCl2•6H₂O和光135-00165
甘油那可利得司17045-65
聚氧乙烯(10)辛基苯基醚（Triton X-100）和光169-21105
cOmplete，无EDTA罗氏应用科学11 873 580 001
二水合氯化钙（CaCl2•2H2Onacalai tesque06731-05
微球菌核酸酶（MNase）Takara Bio2910A
乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）nacalai tesque15214-92
3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）nacalai tesque07957-64
二硫苏糖醇（DTT）nacalai tesque14128-91
rCTP、rATP、rUTP、rGTP，各100 mMPromegaE6000
[α-32P]UTP（3,000 Ci/mmol）PerkinElmerNEG507H使用新鲜的RI进行检测
RNase 抑制剂TOYOBOSIN-201
蛋白酶KTakara9033
酸性酚-氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）Life TechnologiesAM9720
3 M 醋酸钠NIPPON GENE316-90081
乙醇（99.5）nacalai tesque14713-95
Dr. GenTLE 沉淀载体Takara Bio9094
RNase One 核糖核酸酶PromegaM4265
十二烷基硫酸钠（SDS）nacalai tesque02873-75
甲酰胺，去离子nacalai tesque16345-65
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）nacalai tesque15130-95
橙黄Gnacalai tesque25401-22
CO2 培养箱例如，ASTECSCA-325DRS
离心例如，TOMYEX-135对于步骤 B)
微型制冷离心机例如，KUBOTA3740对于步骤 6.2
超声波破碎仪QsonicaQ125在步骤 6.4 中，将微尖（#4422）安装到超声波破碎仪上
微型制冷离心机例如，TOMYMX-305对于步骤 6.5
低温培养箱例如，PanasonicMIR-154-PJ在内部设置一个旋转摇床
旋转摇床例如，TAITECRT-5
低温培养箱 例如，TAITECBR-43FL设置摇床 “MINI WAVE” 内部，用于步骤 7.7
MINI WAVEAS ONEWEV-03用于步骤 7.7、8.5 和 8.6 的摇床
培养箱例如，TAITECHB-80设置摇床 “MINI WAVE” 内部，用于步骤 8.5 和 8.6
孵育块例如，ASTECBI-516S

参考文献

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RdRP TERT RNase I rNTP Protein A agarose TERT
人端粒酶逆转录酶蛋白依赖RNA的RNA聚合酶活性的半定量检测
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