方法文章

人端粒酶逆转录蛋白 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的半定量检测

DOI：

10.3791/57021

⸱

2018年6月12日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人端粒酶逆转录 (叔) 合成不仅端粒长度 DNA, 而且还通过 rna 依赖性 rna 聚合酶活性的双链 rna。在这里, 我们描述了一个新建立的检测 rna 依赖 rna 聚合酶活性的内源性叔。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

端粒酶逆转录酶 (叔) 是端粒细胞的催化亚单位, 它通过 RNA 依赖性的 DNA 聚合酶活性拉长端粒。尽管叔被命名为逆转录酶, 但叔的结构和系统发育分析表明, 叔是右手聚合酶的成员, 与病毒 rna 相关的 rna 聚合酶 (RdRPs) 以及病毒逆转录酶有关。我们首先确定了人叔的 RdRP 活性, 产生互补 rna 立场的模板非编码 RNA, 并有助于 rna 沉默的癌细胞。为了分析这种非规范酶活性, 我们在2009年开发了重组叔 RdRP 化验, 然后建立了内源性叔体外RdRP 测定。在这篇手稿中, 我们描述后一种方法。简单地, 叔免疫复合物从细胞分离, 并与模板 RNA 和 rNTPs, 包括放射性 rNTP 的 RdRP 反应孵化。为消除单链 RNA, 用 RNase 对反应产物进行处理, 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析最终产物。核素 RdRP 产品可在隔夜曝光后显影检测到。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人端粒酶逆转录酶 (叔) 被称为端粒细胞催化亚单位, 它拉长端粒, 使用端粒酶 rna 组分 (TERC), 特异 RNA 模板1。虽然叔聚合端粒长度 DNA 作为端粒酶的组成部分, 结构和系统发育分析表明, 叔与病毒 rna 相关的 rna 聚合酶 (RdRPs) 和病毒反转录相关系密切, 并分享域与这些聚合酶2,3,4。RdRP 是生成互补 rna 链到模板 rna 的酶。该酶不仅编码在病毒, 而且在模型有机体, 如植物, 酵母和蠕虫, 和双链 RNA 合成由 RdRP 贡献转录和转录后基因沉默在这些有机体5,6.虽然人类 RdRP 已经失踪很长一段时间, 我们发现 RdRP 活动的人叔在 2009年7。

首先用重组蛋白7证实了 RdRP 的活性, 然后建立了一种灵敏的体外检测方法, 测定内源性叔8的 RdRP 活性。在这里, 我们展示了体外RdRP 检测 (IP-RdRP 检测) 内源性叔。该方法始于内源性叔免疫沉淀 (IP), 其次是体外RdRP 反应, 其中放射性 ribonucleotides 被纳入新生 RNA 链。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 试剂设置

  1. 用于细胞同步的试剂
    1. 为了生成 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM), 含有2.5 毫米胸苷, 溶解30.28 毫克的胸苷每1毫升的组织培养级水, 以准备125毫米胸苷。用0.22 微米注射器过滤器滤除溶液。添加1毫升新制备的125毫米胸苷每50毫升的 DMEM 补充与 10% (卷/卷) 胎牛血清 (血清)。
    2. 要生成含有0.1 微克/毫升 nocodazole 的 DMEM, 请在二甲基亚砜 (亚砜) 中溶解 nocodazole, 以制备5微克/ul nocodazole。添加1µL 5 µg/µL nocodazole 每50毫升 DMEM 补充 10% (卷/卷) 的血清。
    3. 要生成包含 0.002% (卷/卷) 的亚砜的 DMEM, 请添加1µL 每50毫升的亚砜 DMEM 补充 10% (卷/卷) 的血清。
  2. 用于 IP RdRP 测定的试剂
    1. 制备裂解缓冲器 A: 150 毫米氯化钠, 20 毫米三盐酸 (pH 7.4) 和 0.5% (卷/卷) Nonidet P-40 (NP-40)。将试剂贮存在摄氏4摄氏度。
    2. 准备5x 醋酸缓冲液:50 毫米 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基] 磺酸 (HEPES)-KOH (pH 7.8), 500 毫米醋酸钾和20毫米氯化镁2。在室温下贮存试剂。
    3. 准备洗涤缓冲器 1: 1x 醋酸缓冲液, 10% (卷/卷) 甘油, 0.1% (卷/卷) 海卫 X-100 和0.06x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, ethylenediamenetetraacetic 酸 (EDTA)-免费。在使用日或使用前一天准备洗涤缓冲器1。将试剂贮存在摄氏4摄氏度。
    4. 准备 AGC 解决方案: 1x 醋酸缓冲液, 10% (卷/卷) 甘油和 0.02% (重量/卷) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonat (章)。将试剂贮存在摄氏4摄氏度。
    5. 要生成包含 2 mM CaCl2的 agc 解决方案, 请添加100µL 1 M CaCl2每50毫升的 agc 解决方案。将试剂贮存在摄氏4摄氏度。
    6. 要生成包含3毫米乙二醇双 (b-aminoethylether) n, n, n ', n '-四乙酸四酸 (EGTA) 的 agc 解决方案, 增加375µL 0.4 米 EGTA (pH 7.5) 每50毫升的 AGC 解决方案。将试剂贮存在摄氏4摄氏度。
    7. 准备洗涤缓冲器 2: 1x 醋酸盐缓冲器和 0.02% (重量/卷)。将试剂贮存在摄氏4摄氏度。
    8. 准备显示器解决方案: 0.2 米 HEPES (pH 7.8), 40 毫米氯化镁2和2毫米 dithiothreitol (德勤)。将试剂贮存在摄氏-20 摄氏度。
      注: 头盔的解决方案至少应在三月内更新。
    9. 制备2x 蛋白酶 K 缓冲器:20 毫米三盐酸 (pH 7.6), 20 毫米 EDTA 和 1% (重量/卷) 月桂酸钠 (SDS)。将试剂贮存在摄氏-20 摄氏度。
    10. 准备2x 加载缓冲器: 95% (卷/卷) 甲酰胺, 20 毫米 EDTA 和 1% (重量/卷) 橙 g. 将试剂贮存在-20 摄氏度。

2. HeLa 细胞的制备

注: 制备 HeLa 细胞在有丝分裂阶段 (操作) 同步或异步分裂 (unmanipulated)。文化细胞在存在 5% CO2在37°c。

  1. HeLa 细胞在有丝分裂中的同步
    1. 板 1 x 106的 HeLa 细胞与10毫升的 DMEM 补充 10% (卷/卷) 血清在10厘米培养皿。
    2. 电镀后两天, 用10毫升的 DMEM 取代培养基, 其中含有2.5 毫米胸苷和 10% (卷/卷) 的血清。培养细胞24小时。
    3. 用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (-) 冲洗细胞三次, 并培养出10毫升 DMEM 的细胞, 含 10% (卷/卷) 的血清为 6 h。
    4. 用10毫升的 DMEM 取代培养基, 含有0.1 µg/毫升的 nocodazole 和 10% (卷/卷) 的血清, 并培养细胞为 14 h。
    5. 轻轻摇动培养基, 取出含有分离有丝分裂细胞的上清液。计算 IP RdRP 检测的细胞数。
    6. 离心样品在 490 x g 5 分钟在4°c, 并且放弃上清。
      注: 细胞颗粒可储存在-80 摄氏度。
  2. unmanipulated HeLa 细胞的制备
    1. 板 1 x 106的 HeLa 细胞与10毫升的 DMEM 补充 10% (卷/卷) 血清在10厘米培养皿。
    2. 电镀后两天, 用含有 10% (卷/卷) 血清的10毫升 DMEM 取代培养基。培养细胞30小时。
    3. 用10毫升的 DMEM 取代培养基, 其中含有 0.002% (卷/卷) 亚砜和 10% (卷/卷) 的血清, 并将细胞培养为 14 h。
    4. 用含有1毫米 EDTA 的0.7 毫升胰蛋白酶 (2.5 克/升) trypsinization 收集细胞。计算 IP RdRP 检测的细胞数。
    5. 离心样品在 490 x g 5 分钟在4°c, 并且放弃上清。
      注: 细胞颗粒可储存在-80 摄氏度。

3. IP RdRP 检测

  1. 蛋白质 A-琼脂糖珠制备
    1. 将亲和树脂的1毫升 (床容积500µL) 转移到1.5 毫升离心管上。离心机在 800 x g 5 分钟4摄氏度, 并丢弃上清。
    2. 添加800µL 的溶解缓冲 A 到珠, 并混合通过反转管几次。离心机在 800 x g 3 分钟4摄氏度, 并丢弃上清。重复此步骤两次 (总共三洗涤)。
    3. 添加800µL 的溶解缓冲 A 到珠, 混合好通过反转管几次。在旋转振动筛上一夜之间 (或至少4小时) 在4摄氏度旋转管子。
    4. 离心管在 800 x g 3 分钟4摄氏度, 并丢弃上清。
    5. 添加500µL 的溶解缓冲 A 到珠, 并混合通过反转管几次。把珠子存放在4摄氏度。
  2. 细胞裂解剂的制备
    1. 选如果在步骤2中冻结细胞, 将冰冻细胞放在冰上, 直到细胞松动。
    2. 用10毫升的 PBS (-) 清洗细胞。离心样品在 1450 x g 5 分钟在4°c, 并且放弃上清。
    3. 溶解的细胞与冰冷溶解缓冲 a (1 毫升溶解缓冲 a 每 1 x 107的细胞) 由温和的吹打。
    4. 油脂实验1.5 毫升管中的样品, 条件如下;设置放大的 sonicator 在 25%, 油脂实验十年代。
    5. 离心样品在 20400 x g 15 分钟在4°c。
    6. 收集上清。将1毫升的上清液转化为1.5 毫升的离心管。
      注意: 在无 RNase 条件下执行所有过程。
  3. 免疫沉淀
    1. 通过添加40µL (珠体积20µL), 每1毫升的裂解液中的水洗蛋白 A-琼脂糖珠, 预先清除从步骤3.2.6 的裂解液。混合好, 通过反转管几次, 并旋转样品30分钟, 在4摄氏度。
    2. 离心样品在 1.3万 x g 1 分钟在4°c, 并且恢复上清。
    3. 添加40µL (床容积20µL) 的水洗蛋白 A-琼脂糖珠和10µg 的抗人叔抗体 (克隆: 10E9-2)8进入预清除裂解。混合通过反转管几次, 并旋转样品在4°c 在夜间。
    4. 离心样品在 3300 x g 0.5 分钟在4°c, 并且去除上清。
    5. 用洗涤缓冲液清洗珠子 1: 将1毫升的洗涤缓冲器1添加到珠子上, 通过反转管混合好, 并将样品旋转5分钟, 在4摄氏度。离心样品在 3300 x g 0.5 分钟在4°c, 并且去除上清。重复此步骤三次。
    6. 一次用包含2毫米 CaCl2的 agc 解决方案清洗珠, 将1毫升的 agc 解决方案加在 CaCl2到珠子上, 通过反转管混合, 并将样品旋转5摄氏度。离心样品在 3300 x g 0.5 分钟在4°c, 并且去除上清。
    7. 用 Micrococcal 核酸酶 (MNase) 处理珠子: 准备表 1中描述的 MNase 反应混合物。并用重悬在60µL 的 MNase 反应混合物中的珠子由温和的吹打。轻轻摇动样品 (20 到 25 rpm) 在一个转盘上的一个在一个珀尔式孵化器在25°c 15 分钟。
      注意: 使用起伏的振动筛是非常重要的, 严格按照车速限制在这一步。其他类型的振荡器, 如旋转搅拌机, 不推荐使用。
    8. 离心样品在 3300 x g 0.5 分钟在4°c, 并且去除上清。
    9. 用包含3毫米 EGTA 的 agc 解决方案将珠子洗两次: 添加1毫升的 agc 解决方案, 其中包含3毫米 EGTA 到珠子上, 通过反转管混合好, 并将样品旋转5分钟, 在4摄氏度。离心样品在 3300 x g 0.5 分钟在4°c, 并且去除上清。重复此步骤一次。
    10. 洗涤的珠子一次与洗涤缓冲 2: 添加1毫升的洗涤缓冲 2到珠, 混合好通过反转管, 并旋转样品5分钟在4°c。离心样品在 3300 x g 0.5 分钟在4°c, 并且去除上清。在设置 RdRP 反应时, 把珠子放在冰上。
      注意: 在无 RNase 条件下执行所有过程。
  4. RdRP 反应
    1. 如表 2所述, 在新管中制备 RdRP 反应混合物。
    2. 添加6µL [α-32P] UTP (3000 Ci/毫摩尔) 的混合物, 并混合良好的吹打。
      注: [α-32p] ATP, [α-32p] CTP, 或 [α-32p] GTP 可用于反应, 而不是 [α-32P] UTP。
    3. 将1µL 模板 RNA (1 µg/µL) 添加到混合物中, 并由吹打混合均匀。
      注: 要建立 RdRP 化验, 推荐以下 RNA 模板: 5 '-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3 ' 9。
    4. 并用重悬珠与20µL 的 RdRP 反应混合物从步骤3.4.3 吹打。
    5. 轻轻摇动样品 (20 到 25 rpm) 在一个转台的一个转盘上的一个珀尔式孵化器为2小时在32摄氏度。
    6. 在反应混合物中加入5.4 µL 蛋白酶 k (20 毫克/毫升) 和45.4 µL 2x 蛋白酶 k 缓冲液。混合通过吹打和震动 (20 到 25 rpm) 的样品在一个转盘上设置在一个珀尔式孵化器为30分钟在37摄氏度。
    7. 在样品中添加109.2 µL 的 RNase 水。
    8. 在样品中加入200µL 酸苯酚-氯仿。用涡旋混合, 然后在室温下将试样离心 21100 x克5 分钟。将水相转移到新管上。重复此步骤一次。
    9. 添加20µL 3 米醋酸钠 (pH = 5.2), 4 µL 的沉淀载体和250µL 乙醇的水相。摇管井搅拌, 然后离心样品在 21100 x g 20 分钟在4摄氏度。放弃上清。
    10. 用300µL 的冷 70% (卷/卷) 乙醇清洗颗粒, 储存在-20 摄氏度。离心样品在 21100 x g 15 分钟在4°c。
    11. 丢弃上清液, 风干颗粒。
      注意: 在无 RNase 条件下执行所有过程。
      注: 从步骤3.4.11 的颗粒可以储存在-20 °c 至少2天。
  5. RNase 治疗
    1. 并用重悬在20µL RNase 水中, 从步骤3.4.11 中释放出颗粒。
    2. 如表 3所述, 在新管中制备 RNase 反应混合物。
    3. 将 RNase 反应混合物的180µL 添加到样品中, 并在37摄氏度上孵化管2小时。
    4. 添加2.3 µL 10% (卷/卷) SDS 的样本和孵化15分钟在37摄氏度。
    5. 添加2µL 蛋白酶 K (20 毫克/毫升) 的样品和孵化15分钟在37摄氏度。
    6. 在样品中加入205µL 酸苯酚-氯仿。用涡旋混合, 然后在室温下将试样离心 21100 x克5 分钟。将水相转移到新管上。
    7. 添加20µL 3 米醋酸钠 (pH 5.2), 4 µL 的沉淀载体和250µL 乙醇的水相。摇管井搅拌, 然后离心样品在 21100 x g 20 分钟在4摄氏度。放弃上清。
    8. 用300µL 的冷 70% (卷/卷) 乙醇清洗颗粒, 储存在-20 摄氏度。离心样品在 21100 x g 15 分钟在4°c。
    9. 丢弃上清液, 风干颗粒。
      注: 从步骤3.5.9 的颗粒可以储存在-20 °c 至少2天。
  6. 凝胶电泳与显影
    1. 并用重悬样品与20µL 的 RNase 无水。
    2. 添加20µL 2x 加载缓冲区。
    3. 将样品煮沸10分钟, 在95摄氏度。把样品压在冰上。
    4. 运行凝胶。如果模板大小为 34 (参见步骤 3.4.3), 7 M Urea-10%polyacrylamide 凝胶用于变性凝胶电泳。
    5. 用凝胶干燥器烘干凝胶。
    6. 将胶片暴露在 X 光盒内的干燥凝胶中, 屏幕上的强化屏为-80 摄氏度。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用推荐的 RNA 模板, 放射性 RdRP 产物在20到30核苷酸 (nt) 之间被观察到, 特别是在有丝分裂阶段的 HeLa 细胞在过夜暴露以后 (图 1A)。通常, RdRP 产品的信号强度显示两个峰值, 它们位于 25 nt 和 30 nt 之间, 与下一代测序9确认的产品大小分布一致。与有丝分裂细胞相比, 没有同步的 HeLa 细胞几乎没有 20–30 nt 放射性产物。椭圆信号, 在所有样品被放置在 20 nt 以下, 是非特异性漂移。

如果在有丝分裂 HeLa 细胞中只有 30 nt 的产品有微弱信号, 则表明 RdRP 反应不顺利。例如, 如果 MNase 治疗是粗略和不恰当的, 有丝分裂 HeLa 细胞的信号强度显著下降 (图 1B)。RdRP 反应与旧的头盔的解决方案也减少了产品 (图 1C)。

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图 1: 在有丝分裂 HeLa 细胞中内源性叔 RdRP 的代表性产品。(A)三 nocodazole (操作) 或亚甲基亚砜 (unmanipulated) 治疗 HeLa 细胞中的 IP RdRP 测定结果。用化学合成的 34 nt RNA 作为模板。(B)在不适当的 MNase 治疗下进行的有丝分裂 HeLa 细胞的 RdRP 检测。(C)用新的或旧的显示器溶液进行的有丝分裂 HeLa 细胞的 RdRP 检测。请单击此处查看此图的较大版本.

试剂体积
Micrococcal 核酸酶, 20 U/µL1µL
Micrococcal 核酸酶缓冲器, 10x8µL
RNase 水51µL

表 1: MNase 反应组合件。

试剂体积
小伙子们, 0.07% (重量/音量)6µL
头盔解决方案2µL
rATP, 80 毫米0.5 µL
rGTP, 8 毫米1µL
rUTP, 0.4 毫米1µL
rCTP, 8 毫米1µL
RNase 抑制剂, 40 U/µL0.5 µL
RNase 水1µL

表 2: RdRP 反应组合件。

试剂体积
RNase 一核糖核酸, 10 U/µL0.2 µL
反应缓冲器, 10x20µL
RNase 水159.8 µL

表 3: 核糖核酸反应组合件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RdRP 检测是一种检测人叔 RdRP 活性的敏感方法。叔蛋白在有丝分裂 HeLa 细胞中高度表达, 其中叔形成 RdRP 复合物8,9,10。这表明有丝分裂 HeLa 细胞是检测 RdRP 活性的最佳材料。在上文所述的协议中, 有丝分裂和非同步 HeLa 细胞分别被列为阳性和阴性的例子。如图 1A所示, RdRP 从有丝分裂 HeLa 细胞中推荐的 RNA 模板中检测出的产品在20到 30 nt 之间显示出广泛的放射性信号。除了 hela 细胞外, 我们还进行了不同类型细胞系的检测, 发现信号模式可以在不同的细胞类型中改变9: 有些显示一个强信号只有大约 30 nt, 有些显示一个相似的模式与 HeLa 细胞。我们也进行了与 RNA 模板的检测, 除了 34 nt 模板8, 短和长 (300 nt) rna 与各种序列, 并成功地获得了 RdRP 产品从这些模板, 虽然可能有一些偏好。然而, 对于第一次试验, 我们建议使用 HeLa 细胞有丝分裂阶段和 34 nt RNA 模板。RdRPs 可以产生双链 RNA 两个在底漆依赖和在底漆独立方式11。我们报告, 叔保留此财产作为人类 RdRP7,9;叔合成 dsRNA 从一个 RNA 模板与 3 '-保护结构通过一个后启动机制7。对于 34 nt RNA 模板, 叔合成互补链, 不使用底漆9。为了专门检测以底漆为独立的方式合成的 RdRP 产品,即合成的 RNA 产品, [α-32p] ntp 可替换为 [γ-32p] ntp 在 RdRP 反应9。

MNase 治疗微珠上的叔免疫复合物是达到预期效果的关键步骤。如果 MNase 治疗时间过长或进行了激烈的震动, RdRP 产品将显著减少。为了避免这样的麻烦, 我们强烈建议严格遵守协议。头盔的解决方案是成功的另一个关键因素。如果您发现信号非常微弱, 请将显示器的解决方案替换为新准备的。

在整个议定书中, 人们应该小心避免 RNase 污染。核糖核酸应使用专用设备进行处理。在操纵核糖核酸后, 你应该立即丢弃提示和 RNase, 消除 RNase 与专门的解决方案 (如RNase 安静), 并改变树林。

叔与TERC和多种内源 rna 相互作用, 我们报告了其中的一部分7。在 ip-RdRP 检测中进行的修改, 如无 MNase 治疗的 ip RdRP 化验, 将提供一份完整的关于叔相关 RdRP 活动的内源 RNA 模板和生物信息学指南的序列特征。我们已经成功地将此协议应用于组织裂解。由于叔的表达在各种正常和肿瘤组织, 这可能是有益的研究非规范化的酶功能的人的叔。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作部分是由日本机构发展癌症治疗学创新研究 (p 直接) (15cm0106102h0002、K.M.) 和癌症研究和治疗进化项目 (16cm01061150001、K.M.) 的项目所支持的。为医学研究开发, 阿曼德;武田科学基金会 (Y.M.);授予高松公主癌症研究基金 (13-24520, Y.M.);和 jsp KAKENHI 授予编号 JP16K07133 (Y.M.)。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科s 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）和光044-29765
胎牛血清 （FBS）康宁35-010-CV
青霉素-链霉素混合溶液nacalai tesque26253-84
胰蛋白酶-乙二甲酸四乙酸 （EDTA） 溶液nacalai tesque32777-44
磷酸盐缓冲盐水 （PBS（-））和光166-23555
Thymidinenacalai tesque07147-61
诺考达唑SigmaM1404
二甲基亚砜 （DMSO）nacalai tesque08904-85
氯化钠nacalai tesque31333-45
三（羟甲基）氨基甲烷nacalai tesque35434-21
盐酸nacalai tesque18321-05
Nonidet P-40 （NP-40）nacalai tesque25223-04
Pierce Protein A Plus 琼脂糖Thermo Scientific22812
2-[4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸 （HEPES）nacalai tesque17514-15
氢氧化钾Wako168-21815
钾醋酸盐Nacalai Tesque28405-05
氯化镁六水合物 （MgCl2•6H2O）Wako135-00165
甘油nacalai tesque17045-65
聚氧乙烯（10） 辛基苯醚 （Triton X-100）Wako169-21105
cOmplete，不含 EDTA氏应用科学11 873 580 001
氯化钙二水合物 （CaCl2•2H2O）nacalai tesque06731-05
微球菌核酸酶 （MNase）Takara Bio2910A
乙二醇双（b-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （EGTA）nacalai tesque15214-92
3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基铵基]-1-丙磺酸 （CHAPS）nacalai tesque07957-64
二硫苏糖醇 （DTT）nacalai tesque14128-91
rCTP， rATP， rUTP， rGTP， 每个 100mMPromegaE6000
[a-32P]UTP （3,000 Ci/mmol）PerkinElmerNEG507H使用新鲜的 RI 进行检测
RNase 抑制剂TOYOBOSIN-201
蛋白酶 KTakara9033
酸-苯酚：氯仿，pH 4.5 （与 IAA， 125：24：1）Life TechnologiesAM9720
3 M 乙酸钠NIPPON GENE316-90081
乙醇 （99.5）nacalai tesque14713-95
Dr. GenTLE 沉淀载体Takara Bio9094
RNase One 核糖核酸酶PromegaM4265
十二烷基硫酸钠 （SDS）nacalaitesque02873-75
去离子甲酰胺nacalai tesque16345-65
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 （EDTA）nacalai tesque15130-95
橙子 Gnacalai tesque25401-22
CO2 培养箱，例如 ASTECSCA-325DRS
离心机例如 TOMYEX-135对于步骤 B）
微量冷冻离心机，例如，KUBOTA3740对于步骤 6.2
超声波仪QsonicaQ125在超声波仪上设置一个微尖 （#4422），对于步骤 6.4
微量冷冻离心机，例如，TOMYMX-305对于步骤 6.5
冷却培养箱，例如，PanasonicMIR-154-PJ在内部
旋转摇床，例如 TAITECRT-5
冷却培养箱 例如，TAITECBR-43FLSet a shaker "迷你波"内部，用于步骤 7.7
MINI WAVEAS ONEWEV-03用于步骤 7.7、8.5 和 8.6
的摇床 培养箱例如，TAITECHB-80设置摇床"迷你波"内部，用于步骤 8.5 和 8.6
块培养箱，例如 ASTECBI-516S
罗，设置旋转振荡器，

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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