小鼠脂肪组织采集与RNA分析前处理

摘要

本文的目的是介绍一种从小鼠体内采集不同白色脂肪组织、处理脂肪样本并提取RNA的逐步操作流程。

摘要

与其他组织相比，白色脂肪组织含有较少的RNA和蛋白质，因此在进行实时PCR和Western Blot等下游应用时面临挑战，因其主要成分为脂质。从脂肪组织样本中提取RNA也较为困难，需要额外步骤以避免脂质干扰。本文介绍了一种从小鼠中采集三种解剖位置不同的白色脂肪组织、处理样本并进行RNA提取的实验方法。我们进一步描述了cDNA的合成以及利用实时PCR进行基因表达分析的实验步骤。本方案可有效减少采集过程中动物毛发和血液对脂肪组织的污染，以及不同脂肪组织之间的交叉污染。该方法经过优化，能够确保提取RNA的数量和质量满足要求。本方案可广泛应用于各类需要获取小鼠脂肪组织样本进行常规实验（如实时PCR）的动物模型，但不适用于原代脂肪细胞培养中的RNA提取。

引言

肥胖是一种全球性流行病，可能导致2型糖尿病等并发症¹。饮食诱导的肥胖动物模型和基因修饰动物模型常被用于肥胖及其相关并发症的研究。传统上，白色脂肪组织被认为是储存多余能量的场所，主要由脂质构成，而棕色脂肪组织则将能量转化为热量^2,3。脂肪组织具有动态特性，其体积会随着食物摄入量和体力活动等多种因素的变化而发生扩张或收缩。因此，为了确定导致这些变化的影响因素，必须进行充分的脂肪组织采集与处理⁴。

在白色脂肪组织中，皮下脂肪库和内脏脂肪库具有不同的特性（如解剖定位和功能）是普遍公认的^2,5。因此，为了避免出现相互矛盾的结果或较大的变异性，在采集脂肪垫时需注意避免不同脂肪库之间的交叉污染。

此外，从小鼠白色脂肪组织中分离RNA或蛋白质时存在三个主要挑战。首先，在肥胖小鼠中收集脂肪垫并非易事，因为不同白色脂肪储存部位之间的边界并不总是清晰可辨，这与其他器官（如肾脏和心脏）不同。⁶第二，由于脂肪组织含有较高的脂质，在提取RNA或蛋白质时，脂质会在上层形成一层漂....

方案

实验中使用的小鼠护理遵循加拿大动物保护委员会制定的实验动物护理和使用标准。所有实验程序均获得CHUM研究中心大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 雄性小鼠的尸检与脂肪组织采集

1. 根据研究目的设置实验分组。本研究中，样本采集自两组C57Bl/6背景的雄性小鼠（每组n=12-14）。确保所用小鼠年龄为12至15周，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并分别提供普通饮食（N）或高脂饮食（HF）及饮水 随意摄取 持续10周¹¹.
2. 通过将小鼠置于密闭容器中并暴露于6% CO环境中实施安乐死₂ 10 分钟内
3. 通过将装有26G 1/2英寸针头的1 mL注射器缓慢插入动物胸骨左侧稍偏位置，进行心脏穿刺，并缓慢回抽活塞以采集动物大部分血液。确保注射器与动物身体保持平行。若血液未进入注射器，可在缓慢回抽活塞的同时轻轻旋转注射器。
   注意： 成功的心脏穿刺（采血量在0.8至1.0 mL之间）可减少血液对脂肪组织的污染。
4. 将小鼠仰卧放置，使用22G针头如图所示将每只爪子固定在垫板上 图1.
5. 用纱布蘸取酒精，从颈部开始，沿单一方向朝生殖器官方向反复擦拭小鼠皮肤，此操作可使毛发紧贴皮肤，减少毛发对脂肪组....

结果

按照解剖程序，从两组小鼠（正常饮食组和高脂饮食组）中采集了三种白色脂肪组织并称重。与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠的最终体重和体重增加均显著升高（表1）。此外，与正常饮食组相比，肥胖小鼠的前列腺周围脂肪（PGF）、肾周脂肪（PRF）和皮下脂肪（SCF）重量均增加了2倍以上。

在对分离的RNA进行任何实验之前，需按照步骤4.9所述评估其纯度。对于每份白色脂肪组织，采用酚溶液法提取RNA所得样品质量合格，其OD260/OD280比值约为2.0，符合RNA纯度标准（表2）。实时PCR结果显示，与正常饮食（N饮食）小鼠相比，肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF中瘦素（leptin）mRNA表达水平显著升高（图4A）。事实上，两组小鼠之间leptin mRNA表达的差异并非源于用于结果标准化的参照基因s.......

讨论

高脂饮食喂养后，与正常饮食喂养的小鼠相比，肥胖小鼠的体重和白色脂肪组织重量均增加。使用苯酚溶液提取的RNA具有良好的纯度。瘦素（leptin）是一种主要由脂肪组织产生的脂肪因子，已知其与脂肪质量呈正相关¹⁶。正如预期，随着脂肪质量的增加，肥胖小鼠中瘦素mRNA的表达也相应升高。

该方法包含若干关键步骤。其中最主要的一步是避免不同白色脂肪组织储存部位之间的交叉污染，因为已知不同的脂肪组织储存部位具有不同的功能^2,5。污染可能导致后续应用中产生误导性结果。此外，由于脂肪暴露于空气中后容易干燥，因此若需称重，建议在不同小鼠之间以规律且一致的速度收集白色脂肪组织，否则脂肪垫的总重量可能不准确。为了获得高质量和高得率的RNA，遵循近期发表的MIQE指南具有重要意义¹⁷。特别是，在研磨过程中将样品制成极细的粉末，有助于最大化得率，从而在RNA提取过程中增加组织粉末与苯酚溶液之间的接触.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器
1X TE 溶液（10 mM Tris-HCl 和 1 mM EDTA•Na2，pH 8.0）
22 G 针头
26 G 针头
75% 乙醇
金属浴（干式加热器）
氯仿	Sigma	C2432-500mL
dATP	Thermo scientific	R0141
dCTP	Thermo scientific	R0151
dGTP	Thermo scientific	R0161
DNase I（1 U/µl）	Thermo scientific	EN0521
dTTP	Thermo scientific	R0171
Faststart Universal SYBR green Master (Rox)	Roche	4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox) 荧光染料	Roche	4913914001
滤芯吸头
镊子	Instrumentarium	HB275
纱布
锤子
高脂啮齿类动物饲料	Bio-Serv, Frenchtown, NJ	F3282
异丙醇	Laboratoire MAT	IH-0101
瘦素正向PCR引物（5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’）10 uM
瘦素反向PCR引物（5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’）10 uM
液氮
Maxima 逆转录酶（酶及5x缓冲液）	Thermo scientific	EP0742
纳米纯水（即超纯水）
丁腈检查手套
丁腈手套
正常啮齿类动物饲料	Harlan Laboratories, Madison, WI	Harlan 2018
P1000 移液器
P2 移液器
P20 移液器
P200 移液器
苯酚溶液（TRIzol）	Ambion Life Technologies	15598018
预先标记的铝箔
石英分光光度计比色皿
PCR管条架
RT-PCR管条架
随机六聚体	Invitrogen	58875
实时PCR Rotor Gene系统	Corbett research	RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler
带制冷功能的台式离心机
RiboLock RNase抑制剂	Thermo scientific	EO0381
无RNase的1.5 mL离心管
无RNase的1.5 mL螺口管
无RNase的PCR管条（0.2 mL）及管盖
无RNase水	Hyclone	SH30538.02
RT-PCR仪	Qiagen	Rotor-Gene Corbett 3000
RT-PCR管条（0.1 mL）及管盖
S16正向PCR引物（5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’）10 uM
S16反向PCR引物（5’-ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’）10 uM
分光光度计	Biochrom	Ultrospec 3100 pro
不锈钢研钵和研杵
手术垫	自制，由泡沫板包裹一次性吸水垫制成
手术剪	Intrumentarium	130.450.11
热循环仪
热循环仪	Biometra	Thermocycler
涡旋混合器
药匙