小鼠饮酒模型在酒精使用障碍药物治疗开发中的应用：黑暗饮酒与双瓶选择

摘要

酒精使用障碍（AUD）是一个重大的国家健康问题，开发更有效的治疗方法是 需要采取相应措施以满足该患者群体的需求。为此，本方案采用两种简单的啮齿类动物饮酒模型，以评估先导抗酒精化合物的临床前疗效。

摘要

酒精使用障碍（AUD）是一个重大问题，全球估计有超过7600万人符合诊断标准。目前的治疗方法仅限于三种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，即使与心理社会干预联合使用，疗效也十分有限，这一点从高复发率中可见一斑。因此，寻找更有效的新型治疗方法是一项重要的公共卫生目标。为此，本方案采用两种简单的啮齿类动物饮酒模型，用于评估候选抗酒精化合物的临床前疗效：双瓶选择（TBC）和暗期饮酒（DID）。前者允许小鼠自愿适度饮酒，而后者则诱导小鼠在短时间内自愿摄入大量酒精，模拟暴饮行为。这两种模型操作简便且通量较高，可用于快速筛选药理学试剂，或鉴定表现出特定自愿饮酒行为的小鼠品系。

引言

二十多年来，人们一直在努力研发用于治疗酒精使用障碍（Alcohol Use Disorder, AUD）的药物¹。尽管已取得诸多进展，AUD 仍然是一个重大的公共卫生问题，影响超过 1800 万美国人，每年造成超过 2200 亿美元的经济损失^2,3。目前仅有三种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物——双硫仑（disulfiram）、纳曲酮（naltrexone）和阿坎酸钙（acamprosate），这些药物在临床试验中疗效不一致，即使在临床环境中与心理社会干预联合使用，疗效也十分有限^4,5,6,7。

当前酒精使用障碍（AUD）治疗失败的一个主要原因是AUD的异质性⁸。尽管环境和遗传因素均参与AUD的发生发展，但遗传因素约占发病风险的50 - 60%⁹。与抑郁症的治疗类似，目前普遍认为，AUD患者需要多种不同的药物，且应根据每位患者的具体需求进行个体化选择

方案

本研究所述所有操作程序均已获得南加州大学健康科学校区机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验设置与组装

1. 在研究开始前，准备好以下所有用品和化学品：小鼠、笼子/金属笼盖、垫料、食物、水、乙醇、移液管、吸管瓶盖、热缩膜、美工刀、扎带、胶带、本生灯、天平、头灯。
2. 获取C57BL/6J小鼠，可来自商业来源或本单位饲养群体，需注意小鼠在测试前可进行群养。
   ​注意：所需小鼠总数取决于实验设计的复杂程度。建议每组约12–15只小鼠，预实验每组不少于5–7只。在下文展示的代表性结果中，我们采用简单的两组设计，使用单一剂量（5 mg/kg）的药物（MOX）来评估因果关系。
3. 按照以下步骤组装瓶子¹⁸。
   1. 使用本生灯加热美工刀。
   2. 用该刀将塑料18 mL血清移液管的顶部和底部各切去约一英寸。
      1. 注意：也可使用较小体积的移液管（例如，10 mL），以提高测量精度。
   3. 在热风枪下加热移液管使其软化。
   4. 将钢珠吸管插入移液管的"底部"端（即靠近18 mL刻度线的开口端）。
   5. 使用商用热缩枪和热缩膜将吸管固定并密封。
   6. 用硅胶塞封住另一端开口。
   ....

结果

在以下代表性研究中，采用双瓶选择（TBC）范式模拟社交饮酒行为。简言之，小鼠可自由选择饮用两瓶溶液，其中一瓶为纯水，另一瓶为10%（v/v）乙醇溶液。随后，根据乙醇摄入量将实验对象均分为两组，分别接受莫昔克丁（MOX）或生理盐水对照处理，以确保各组间乙醇摄入水平的平均值相近且变异最小。

在注射开始前，24 小时内的初始基线 10E 摄入量稳定在 14.46 ± 1.85 g/kg（n = 8）；生理盐水注射后，再次稳定于 14.14 g/kg。为评估 MOX 急性剂量（5 mg/kg）对乙醇摄入量和偏好的影响，分别在 MOX 给药前、MOX 给药期间及 MOX 给药后评估饮水行为。我们发现，与 MOX 给药前相比，单次 MOX 给药使酒精摄入量显著降低超过 45% [F (2, 22) = 26.33, p <0.0001]（图 2A），并使偏好显著降.......

讨论

全球估计有高达7600万人符合酒精使用障碍（AUD）的诊断标准。然而，目前可用的药物治疗效果普遍不佳，亟需进一步研发以满足这一临床人群的需求²⁰。为此，本方案旨在通过示例两种最基本的啮齿类动物饮酒模型——双瓶选择（TBC）和暗期饮酒（DID），推动相关研究进展。这两种模型均用于测量非操作性乙醇自我摄入行为，即小鼠通过口服方式摄入乙醇。在TBC模型中，乙醇（10% v/v）和水持续同时供应，导致血液乙醇浓度相对较低，这是由于乙醇摄入呈间歇性和渐进性模式所致。该模型最适合评估作为偏好性味觉刺激物的低水平乙醇摄入，因此被认为类似于人类的"适度"饮酒行为。上方图2展示了TBC模型的代表性结果。

另一方面，在DID模型中，乙醇（20% v/v）仅在有限的时间内提供。与TBC模型不同，该模型用于评估化合物对具有行为学相关浓度乙醇摄入的影响，利用了C57BL/6J小鼠在其昼夜节律最活跃阶段会迅速摄入大量乙醇的特性。此类饮酒阶段连续进行4天，从第3天开始^rd

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 量筒	VWR	https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co	用于配制乙醇溶液。
1 L 玻璃瓶	Pyrex (Fisher Scientific)	https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752	用于配制乙醇溶液。
100 mL 量筒	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311	用于配制乙醇溶液。
Analox			分析DID血液样本的一种潜在方法是使用Analox仪器
钢珠吸管	Ancare Corp.	http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point	长度：2.5英寸，直径：5/16英寸，型号：TD100
C57BL/6J 小鼠	Jackson lab	https://www.jax.org/strain/000664	也可来自机构内部繁育种群
一次性血清移液管	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged	10 mL、18 mL 或 25 mL
乙醇，纯品，190 proof（95%），USP，KOPTEC	Decon Labs (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec	---
热风枪	Master Appliances Corp.	http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
热缩管	---	---	直径：3/8英寸
工业刀具/刀片	---	---	---
金属笼板	---	---	应可通过大学或机构动物房获取
小鼠用反渗透水（RO水）	---	---	应可通过大学或机构动物房获取
便携式电子天平	Ohaus (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus	---
红色照明头灯	nyteBright (Amazon)	https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1	---
硅胶塞	Fisher	---	---
温度计	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232	---
称量舟	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes	移液枪吸头盒的盖子可作为合适的替代品