我们介绍了一种利用STED显微镜同时成像B细胞中肌动蛋白结构、微管以及微管正端结合蛋白的实验方案。该B细胞模型通过在覆盖有B细胞受体抗体的盖玻片上铺展，模拟免疫突触形成的初始阶段。
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摘要
摘要
结合膜结合抗原的B细胞（例如抗原呈递细胞表面的抗原与B细胞受体（BCR）相互作用，形成免疫突触——一种优化BCR信号传导及BCR介导的抗原摄取的特化细胞结构。免疫突触的形成依赖于肌动蛋白细胞骨架的重塑以及微管网络向抗原接触位点的重定向。肌动蛋白细胞骨架重塑为致密的外周F-actin环结构，同时伴随着微管组织中心向免疫突触的极化。微管正端结合蛋白以及皮层正端捕获蛋白介导了肌动蛋白与微管细胞骨架之间的物理相互作用，从而使二者得以协调重组。阐明调控这种细胞骨架重排的分子机制，并理解这些细胞骨架结构如何影响免疫突触的形成和BCR信号传导，将为B细胞活化提供新的认识。超分辨显微成像技术的发展为此类研究提供了有力支持，能够揭示细胞骨架网络组织的新细节。本文介绍了一种利用受激发射损耗（STED）显微镜同时对B细胞中的肌动蛋白结构、微管以及转染表达的GFP标记微管正端结合蛋白进行成像的方法。为模拟免疫突触形成的早期事件，我们将B细胞铺展于包被抗免疫球蛋白（anti-Ig）抗体的盖玻片上，以启动BCR信号传导和细胞骨架重塑。本文提供了在A20 B淋巴瘤细胞中表达GFP融合蛋白、诱导anti-Ig介导的细胞铺展、以及后续的细胞固定、免疫染色、图像采集和图像去卷积等步骤的详细实验方案。通过该方法获得的高分辨率图像可同时显示肌动蛋白结构、微管以及可能连接这两种细胞骨架网络的微管正端结合蛋白。
引言
当B细胞结合到极化的抗原阵列时（例如，呈现在抗原呈递细胞（APCs）表面），由此产生的B细胞受体（BCR）信号转导可驱动经典免疫突触结构的形成，该结构最初是在T细胞中被描述的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13最初，在B细胞与抗原呈递细胞（APC）接触部位的边缘形成抗原结合的BCR微簇。这些微簇随后向抗原接触区域的中心移动，并在中心融合形成中央超分子激活簇（cSMAC），构成免疫突触的核心。免疫突触的形成可优化BCR信号....
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方案
所有动物实验程序均经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准。
1. 在 A20 B 淋巴瘤细胞中表达 GFP 融合蛋白
- 在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、50 µM 2-巯基乙醇、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、50 U/mL 青霉素和50 µg/mL 链霉素的完全RPMI培养基（RPMI-1640）中，于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中培养A20细胞。
- 根据生产商说明书配制转染试剂（参见材料表）。
注意：本实验方案已针对材料表中所述的特定试剂和转染程序进行了优化。我们尝试过的其他转染试剂均未能达到足够的转染效率。 - 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将2.5 × 106个A20细胞（每次转染）在525 × g离心5分钟。用含有1–2.5 µg质粒DNA的100 µL转染试剂重悬细胞。若转染编码CLIP-170-GFP23的DNA，每次转染使用2.5 µg。轻轻混匀。
- 将细胞转移至6孔板的一个孔中，并加入预热的完全RPMI培养基调整总体积至2 mL。于37 °C继续培养18小时，以允许蛋白表达。
2. 分离原代小鼠B细胞并用LPS激活
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结果
对于在固定化抗Ig上铺展的B细胞，联合使用STED显微镜与去卷积软件可比共聚焦显微镜提供更高分辨率的细胞骨架结构图像。这一点在图1中尤为明显，其中使用上述方案对F-actin网络进行了可视化。同一标本的共聚焦与STED超分辨率图像对比显示，STED图像分辨率更高，能够揭示肌动蛋白细胞骨架更精细的结构（图1）。该图还表明，去卷积对于获得高质量的STED图像至关重要，在这些图像中肌动蛋白丝的轮廓更加清晰。尽管共聚焦图像的去卷积已显著提升了图像分辨率，但去卷积后的STED图像仍比去卷积后的共聚焦图像提供更详细的结构信息。特别是，周边F-actin环的树状结构在STED显微镜下呈现得更为清晰（图1和图2）。使用上述样品制备和成像方案，也在抗原接触位点对微管网络进行了成像（图3）。微管从.......
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讨论
利用STED超分辨率显微镜可以获得细胞骨架结构的详细图像，其理论分辨率可达50 nm，而传统共聚焦显微镜受衍射极限限制，分辨率约为200 nm24。通过使用去卷积软件，从观测到的"模糊"荧光信号中计算原始光源最可能的位置，可进一步增强对细微结构的分辨能力。本实验方案描述了使用STED技术对肌动蛋白和微管细胞骨架以及与细胞骨架相关蛋白进行成像的方法。
B细胞活化会诱导肌动蛋白细胞骨架和微管网络的重塑，这两种细胞骨架的协调调控对于免疫突触的形成具有重要意义17,42。本文所介绍的方法已优化用于在抗原接触位点处通过多色STED显微技术同时成像肌动蛋白和微管细胞骨架，但也同样适用于单色STED成像。我们此前关于B细胞细胞骨架的研究表明，STED显微技术能够为细胞结构的组织方式及其相互作用机制提供新的见解。利用共聚焦显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜，我们曾观察到微管与抗原接触位点边缘的F-肌动蛋白环发生接触.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所（LSI）成像中心对STED显微镜的支持与维护。本研究由加拿大卫生研究院（M.R.G.）资助，项目编号为#68865。感谢日本名古屋大学的Kozo Kaibuchi博士提供CLIP-170-GFP质粒。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| A20 小鼠 B 淋巴瘤细胞 | ATCC | TIB-208 | 源自 Balb/c 小鼠的 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 B 细胞受体（BCR） |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | 56 oC 水浴 30 分钟灭活 |
| 2-巯基乙醇 | Millipore Sigma | M3148 | |
| 谷氨酰胺 | Millipore Sigma | G5763 | |
| 丙酮酸钠 | Millipore Sigma | P5280 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 液体，10,000 单位 |
| 原代 B 细胞附加材料 | |||
| 70-µm 细胞筛 | Corning | 352350 | |
| 基于磁珠的 B 细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep 小鼠 B 细胞分离试剂盒 |
| 脂多糖（LPS） | Millipore Sigma | L4391 | 来自 E. coli 0111:B4 的 LPS |
| B 细胞活化因子（BAFF） | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 转染 | |||
| 编码 CLIP-170-GFP 的质粒 | 由日本名古屋大学 Kozo Kaibuchi 博士惠赠；参见 Fukata 等，《细胞》109:873-885, 2002 | ||
| 推荐的转染试剂与设备 | |||
| Amaxa 核转染试剂盒 V | Lonza | VCA-1003 | 按照生产商说明将转染试剂与 DNA 混合 |
| Amaxa Nucleofector 2b 型仪器 | Lonza | AAB-1001 | 使用程序 L-013 |
| Falcon 6 孔板，TC 处理，无菌 | Corning | 353046 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 包被盖玻片 | |||
| 18 mm 直径圆形 #1.5 盖玻片 | Thomas Scientific | 1217N81 | 类似产品：Marienfield-Superior 目录号 #117580 |
| 镊子 | Fisher Scientific | 1381242 | 解剖用超细尖镊 |
| Falcon 12 孔无菌聚苯乙烯组织培养板 | Corning | 353043 | |
| 100% 甲醇 | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 无钙镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| 山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | 用于 A20 细胞 |
| 山羊抗小鼠 IgM 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | 用于原代小鼠 B 细胞 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 染色 | |||
| 多聚甲醛（16% 储存液） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 用 PBS 稀释至工作浓度 |
| 戊二醛（50% 储存液） | Millipore Sigma | 340855 | 用 PBS 稀释至工作浓度 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 皂苷 | Millipore Sigma | S2149 | |
| 牛血清白蛋白（BSA），第五组分 | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| 兔抗微管蛋白抗体 | Abcam | ab52866 | 推荐 1:250 稀释，但应优化 |
| Alexa Fluor 532 标记的山羊抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 推荐 1:100 稀释，但应优化 |
| Alexa Fluor 568 标记的鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 推荐 1:100 稀释，但应优化 |
| Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36970 | 不含 DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 材料 | |||
| Parafilm 封口膜 | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | D16-500 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 显微镜 | |||
| Leica SP8 TCS STED 显微镜 | Leica | ||
| Huygens 去卷积软件 | Scientific Volume Imaging | 参见 https://svi.nl/HuygensProducts |
参考文献
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the ....
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