本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.
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本文内容
摘要
摘要
肠道屏障可防御致病微生物和微生物毒素。其功能受紧密连接通透性和上皮细胞完整性的调控，肠道屏障功能的破坏可促进胃肠道及全身性疾病的发展。本文介绍了两种测量肠上皮通透性的简单方法。体外实验中，将Caco-2BBe细胞以单层形式接种于组织培养板孔中，使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）测量跨上皮电阻（TER）。该方法因操作简便且可重复性好而具有较高可靠性。体内实验中，通过口服灌胃给予小鼠4 kDa荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖，随后检测采集的小鼠血清样本中FITC-葡聚糖的浓度，以评估上皮通透性。口服灌胃可提供精确的给药剂量，因此是体内测量肠道通透性的首选方法。综上所述，这两种方法可分别用于体外和体内测量肠上皮通透性，进而用于研究疾病与屏障功能之间的关联。
引言
肠上皮细胞不仅负责营养物质的吸收，还构成重要的屏障，以抵御病原微生物和微生物毒素的侵袭。这种肠道屏障功能由紧密连接通透性和上皮细胞完整性所调控1,2,3，上皮屏障功能的失调与炎症性肠病（IBD）相关。毗邻连接的肌动球蛋白环（PAMR）位于细胞内，紧邻紧密连接。PAMR的收缩由肌球蛋白轻链（MLC）调控，对调节紧密连接通透性至关重要4,5,6,7,8,9,10。肿瘤坏死因子（TNF）通过上调肠上皮MLC激酶（MLCK）的表达并诱导闭合蛋白（occludin）内化，在肠道屏障功能丧失中起核心作用11,12,13
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方案
本研究已获苏州大学剑桥-苏大基因资源中心（CAM-SU）动物护理与使用方案的批准。
1. 在多孔聚碳酸酯膜上接种和培养 Caco-2bbe 细胞
- 在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于T75培养瓶中培养细胞。根据细胞密度定期更换培养基。
注意：为了获得最佳的铺板效果，细胞应快速分裂并呈扁平的“煎蛋状”，这表明细胞处于生长阶段。 - 当细胞融合度达到80%时，将培养瓶从培养箱中取出，吸去培养基。用1-2 mL无钙、镁的无菌PBS冲洗残留培养基。2+。用移液管加入1.5 mL胰蛋白酶-EDTA至培养瓶中，轻轻摇晃培养瓶；然后将培养瓶放入 37 °C 孵育20分钟，期间不摇动。
- 在细胞进行胰蛋白酶消化的同时，将含有孔隙聚碳酸酯膜的插件（孔径大小， 0.4 µm；表面积，0.33 cm²2；参见 材料表) 加入24孔板中。在基底室（膜的下层空间）加入1.0 mL培养基。
- 将5 mL培养基加入培养瓶中，用力将细胞反复吹打瓶壁5-10次，以获得松散的单个细胞或2-3个细胞组成的细胞团。
- 将0.166 mL细胞（达到1:8稀释比例）接种至顶端室（膜的上层空间）。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育 37 °C 长达3周。
- 每周三次通过压力泵小心....
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结果
在培养条件下，Caco-2BBe 细胞以单层形式生长，并逐渐分化为具有刷状缘的成熟吸收性肠上皮细胞。在本方案中，将 Caco-2BBe 细胞以高密度接种于聚碳酸酯膜上，接种后一天细胞即达到 100% 汇合度。然而，此时细胞仍处于未分化状态：为实现细胞的完全分化，需每 2–3 天更换一次培养基，持续 3 周。通过细胞核和 F-肌动蛋白染色，可显示未分化细胞与分化细胞之间的差异。在未分化细胞中可清晰观察到张力纤维。与未分化细胞相比，分化后的细胞体积更小，细胞核更大，且张力纤维更少（图 1）。
TNF 通过依赖 MLCK 的紧密连接调节在肠道屏障功能丧失中起核心作用。检测了不同时间点未处理或经 TNF 处理细胞的 TER。如图 2所示，TNF 以剂量依赖性方式显著降低 Caco-2BBe 单层细胞的 TER，表明 TNF 增加了上皮通透性。.......
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讨论
该实验方案中有多个关键步骤。始终使用Caco-2BBe（表达刷状缘的）细胞进行TER测定，该细胞系是从Caco-2细胞系中筛选出的、能够表达刷状缘蛋白的亚系。当Caco-2BBe细胞完全分化后（汇合后培养约3周），会呈现出绒毛状吸收性表型17。在测定过程中必须避免污染，并对电极进行灭菌处理。由于该操作为非无菌操作，大多数情况下测定时间不得超过8小时。在测量过程中，我们确定了插入物内外两个点之间的电阻值。由于细胞状态的差异，不同位点的电阻测量值有时可能存在显著差异；这是该方法的主要局限性之一。然而，这种变异可通过统计学方法及其他方法显著降低。TER方法也可应用于其他细胞类型，例如用于评估肺上皮细胞和血管内皮细胞的屏障完整性。此外，TER测定还可用于药物毒性研究。
给予可通过扩散进入肠上皮的不可消化大分子，可用于评估肠道通透性。该方法的优点在于可在体检测肠道的屏障功能。可使用的标记物有多种类型，包括放射性同位素、聚乙二醇和糖类18。然而，为精确测量通透性，需考虑若干因素：（.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢哈佛医学院布莱根妇女医院的Jerrold R. Turner博士在完成本研究过程中提供的慷慨帮助。本工作由国家自然科学基金委员会（资助编号 81470804, 31401229 和 81200620）、江苏省自然科学基金（项目编号 BK20180838 和 BK20140319）、江苏省研究生科研创新计划项目（项目编号 KYLX16-0116）、苏州大学高级研究项目（项目编号 SDY2015_06）以及克罗恩病 & 结肠炎基金会研究奖学金（资助编号 310801）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22 G 灌胃针 | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-葡聚糖 | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| 黑色荧光检测用 96 孔板 | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 小鼠 | 南京大学南京生物医药研究院 | ||
| Caco-2BBe 细胞 | ATCC | CRL-2102 | |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 2160110 | |
| 含高糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基 | Hyclone | SH30243.01B | |
| 上皮电阻（伏特/欧姆）测量仪 | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 | |
| Falcon 管（15 mL） | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | FV1000 | |
| 荧光计 | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM 葡萄糖 | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| 模块化组织包埋中心 | Leica | EG1150H | |
| 血清采集管 | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 培养瓶 | Corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| 石蜡 | Sigma | A6330-1CS | |
| 聚碳酸酯膜（Transwell） | Costar | 3413 | |
| 压力泵 | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| 旋转切片机 | Leica | RM2235 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
参考文献
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & ....
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重印与许可
