本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.
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摘要
摘要
肠道屏障可防御致病微生物和微生物毒素。其功能受紧密连接通透性和上皮细胞完整性的调控，肠道屏障功能的破坏可促进胃肠道及全身性疾病的发展。本文介绍了两种测量肠上皮通透性的简单方法。体外实验中，将Caco-2BBe细胞以单层形式接种于组织培养板孔中，使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）测量跨上皮电阻（TER）。该方法因操作简便且可重复性好而具有较高可靠性。体内实验中，通过口服灌胃给予小鼠4 kDa荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖，随后检测采集的小鼠血清样本中FITC-葡聚糖的浓度，以评估上皮通透性。口服灌胃可提供精确的给药剂量，因此是体内测量肠道通透性的首选方法。综上所述，这两种方法可分别用于体外和体内测量肠上皮通透性，进而用于研究疾病与屏障功能之间的关联。
引言
肠上皮细胞不仅负责营养物质的吸收，还构成重要的屏障，以抵御病原微生物和微生物毒素的侵袭。这种肠道屏障功能由紧密连接通透性和上皮细胞完整性所调控1,2,3，上皮屏障功能的失调与炎症性肠病（IBD）相关。毗邻连接的肌动球蛋白环（PAMR）位于细胞内，紧邻紧密连接。PAMR的收缩由肌球蛋白轻链（MLC）调控，对调节紧密连接通透性至关重要4,5,6,7,8,9,10。肿瘤坏死因子（TNF）通过上调肠上皮MLC激酶（MLCK）的表达并诱导闭合蛋白（occludin）内化，在肠道屏障功能丧失中起核心作用11,12,13。
Na+ 和 Cl- 等离子可通过细胞旁路中的孔道或渗漏途径跨过上皮层14。在一种"高通透性"上皮中，跨上皮电阻（TER）的变化主要反映了紧密连接通透性的改变。TER 测量是一种常用的电生理学方法，通过测定细胞单层的阻抗来定量评估紧密连接对 Na+ 和 Cl- 的通透性。已有多种细胞类型被用于 TER 测量，包括肠上皮细胞、肺上皮细胞和血管内皮细胞。该方法的优点在于其非侵入性，可用于实时监测活细胞。此外，TER 测量技术在药物毒性研究中也具有重要应用价值15。
Caco-2BBe 细胞是一种人源结肠腺癌上皮细胞，其结构和功能类似于分化的 小肠上皮细胞：例如，这些细胞具有微绒毛以及与小肠刷状缘相关的酶。因此，培养的 Caco-2BBe 单层细胞被用作一种 体外 用于检测屏障功能的模型
在小鼠中，研究肠道旁细胞通透性的一种方法是通过检测荧光素异硫氰酸盐-葡聚糖（FITC-dextran）从肠腔进入血液的能力。因此，可通过将FITC-dextran直接灌胃给予小鼠，并测定血液中的荧光强度来评估肠道通透性。以下方案描述了两种简单的方法，分别用于体外（in vitro）和体内（in vivo）评估肠上皮通透性。
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方案
本研究已获苏州大学剑桥-苏大基因资源中心（CAM-SU）动物护理与使用方案的批准。
1. 在多孔聚碳酸酯膜上接种和培养 Caco-2bbe 细胞
- 在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于T75培养瓶中培养细胞。根据细胞密度定期更换培养基。
注意：为了获得最佳的铺板效果，细胞应快速分裂并呈扁平的“煎蛋状”，这表明细胞处于生长阶段。 - 当细胞融合度达到80%时，将培养瓶从培养箱中取出，吸去培养基。用1-2 mL无钙、镁的无菌PBS冲洗残留培养基。2+。用移液管加入1.5 mL胰蛋白酶-EDTA至培养瓶中，轻轻摇晃培养瓶；然后将培养瓶放入 37 °C 孵育20分钟，期间不摇动。
- 在细胞进行胰蛋白酶消化的同时，将含有孔隙聚碳酸酯膜的插件（孔径大小， 0.4 µm；表面积，0.33 cm²2；参见 材料表) 加入24孔板中。在基底室（膜的下层空间）加入1.0 mL培养基。
- 将5 mL培养基加入培养瓶中，用力将细胞反复吹打瓶壁5-10次，以获得松散的单个细胞或2-3个细胞组成的细胞团。
- 将0.166 mL细胞（达到1:8稀释比例）接种至顶端室（膜的上层空间）。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育 37 °C 长达3周。
- 每周三次通过压力泵小心吸出每个孔基底室中的培养基。轻柔地向每个插入物的顶室滴加1 mL培养基。
2. 使用上皮细胞测量仪（伏特/欧姆）测量跨上皮电阻
注意：在聚碳酸酯膜上培养约 3 周后，Caco-2BBe 细胞即可进行跨上皮电阻（TER）测量。
- 进行细胞因子研究时，检测前一天，将基础培养基更换为含 10 ng/mL IFNγ 的培养基。实验当天，将培养基更换为含 2.5 或 7.5 ng/mL TNF 的 HBSS。
注意：IFNγ 处理可增加肿瘤坏死因子受体 2（TNFR2）的表达16. - 为校准仪表，将校正电极插入输入端口，并选择“欧姆”模式。使用螺丝刀调节R Adj螺丝，直至仪表显示读数为1,000 Ω。
- 将电极置于70%乙醇中消毒15–30分钟，然后静置晾干15秒。用实验所用的细胞培养基冲洗电极。
- 打开电源，选择“欧姆”模式。将电极桥的长端小心插入基底室，短端插入顶室。确保较长的电极接触培养皿底部，而较短的电极位于培养基液面以下但高于组织培养插件表面。保持电极垂直。
- 测量样品插件和空白插件的电阻即， 在细胞因子处理后的0、1、2、3、4小时，记录不含细胞但含有HBSS的培养小室的电阻值。
- 为确保不同板式之间的结果一致性，计算电阻与有效膜面积的乘积：
对于 24 孔插件，有效膜面积为 0.33 cm²2.
3. 右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导结肠炎的小鼠模型
- 将DSS加入经高压灭菌的水中，使其终浓度为3.5%（wt/vol）。
- 对8周龄雄性C57BL/6小鼠给予3.5% DSS饮水，持续共7天。对照组小鼠给予不含DSS的普通饮用水。
- 在第7天后，将含DSS的饮水更换为普通饮用水。
- 每天称量小鼠体重，并评估每只小鼠的临床评分。将每只小鼠的体重归一化为其初始体重。根据疾病严重程度，通过四个参数定义评分标准：直肠脱垂（0–2分）、粪便性状（0–2分）、出血情况（0–2分）和活动能力（0–2分）5。将上述各项得分相加，得到最终临床评分。
- 为分析结肠组织的组织病理学状况，在DSS处理后第7天，通过腹腔（i.p.）注射1.2%（vol/vol）Avertin（剂量为0.6 mL/10 g体重）处死小鼠。制备100% Avertin储备液的方法：将10 g 2,2,2-三溴乙醇与10 mL叔戊醇混合，避光保存于4°C。使用时将100%储备液用水稀释至2%。
- 分离结肠和盲肠，并测量结肠长度5。
- 从远端结肠切取0.5 cm长的组织片段，置于含有10 mL 10%福尔马林的15 mL离心管中，固定过夜。用梯度乙醇（75%、95%和100%）及二甲苯洗涤固定后的组织。将组织包埋于石蜡中，切取6 mm厚切片用于苏木精-伊红染色8。
4. 测定DSS诱导结肠炎小鼠的上皮屏障通透性
- 在开始给予DSS后的第7天测定屏障通透性。
- 检测当天，禁食小鼠3小时。
- 将灌胃针进行高压灭菌以确保无菌，随后向小鼠灌胃150 µL含80 mg/mL 4 kDa FITC-葡聚糖的无菌水溶液，并保留未使用的FITC-葡聚糖用于血清采集后的标准曲线测定。称量小鼠体重以用于通透性计算。
注意：FITC-葡聚糖溶液应使用水配制。 - 使用剪刀剪取约1 cm长的尾部组织，将100 µL血液从尾部收集至血清采集管中。在室温下以10,000 × g离心10分钟处理采集的血液。
- 用纯水将血清按1:4比例稀释。为制作标准曲线，将未使用的FITC-葡聚糖用纯水依次稀释为1:300、1:1,000、1:3,000、1:10,000、1:30,000、1:100,000、1:300,000、1:1,000,000和1:3,000,000。将100 µL/孔的血清样本和标准曲线样本加入96孔板中。
- 使用酶标仪在485 nm激发波长和528 nm发射波长下读取荧光值。根据标准曲线计算通透性数值，并乘以4以校正稀释倍数。
- 将FITC-葡聚糖的浓度除以小鼠体重进行归一化处理（此步骤有助于校正因小鼠疾病或体重下降导致的FITC-葡聚糖递送差异）。
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结果
在培养条件下，Caco-2BBe 细胞以单层形式生长，并逐渐分化为具有刷状缘的成熟吸收性肠上皮细胞。在本方案中，将 Caco-2BBe 细胞以高密度接种于聚碳酸酯膜上，接种后一天细胞即达到 100% 汇合度。然而，此时细胞仍处于未分化状态：为实现细胞的完全分化，需每 2–3 天更换一次培养基，持续 3 周。通过细胞核和 F-肌动蛋白染色，可显示未分化细胞与分化细胞之间的差异。在未分化细胞中可清晰观察到张力纤维。与未分化细胞相比，分化后的细胞体积更小，细胞核更大，且张力纤维更少（图 1）。
TNF 通过依赖 MLCK 的紧密连接调节在肠道屏障功能丧失中起核心作用。检测了不同时间点未处理或经 TNF 处理细胞的 TER。如图 2所示，TNF 以剂量依赖性方式显著降低 Caco-2BBe 单层细胞的 TER，表明 TNF 增加了上皮通透性。...
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讨论
该实验方案中有多个关键步骤。始终使用Caco-2BBe（表达刷状缘的）细胞进行TER测定，该细胞系是从Caco-2细胞系中筛选出的、能够表达刷状缘蛋白的亚系。当Caco-2BBe细胞完全分化后（汇合后培养约3周），会呈现出绒毛状吸收性表型17。在测定过程中必须避免污染，并对电极进行灭菌处理。由于该操作为非无菌操作，大多数情况下测定时间不得超过8小时。在测量过程中，我们确定了插入物内外两个点之间的电阻值。由于细胞状态的差异，不同位点的电阻测量值有时可能存在显著差异；这是该方法的主要局限性之一。然而，这种变异可通过统计学方法及其他方法显著降低。TER方法也可应用于其他细胞类型，例如用于评估肺上皮细胞和血管内皮细胞的屏障完整性。此外，TER测定还可用于药物毒性研究。
给予可通过扩散进入肠上皮的不可消化大分子，可用于评估肠道通透性。该方法的优点在于可在体检测肠道的屏障功能。可使用的标记物有多种类型，包括放射性同位素、聚乙二醇和糖类18。然而，为精确测量通透性，需考虑若干因素：（...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢哈佛医学院布莱根妇女医院的Jerrold R. Turner博士在完成本研究过程中提供的慷慨帮助。本工作由国家自然科学基金委员会（资助编号 81470804, 31401229 和 81200620）、江苏省自然科学基金（项目编号 BK20180838 和 BK20140319）、江苏省研究生科研创新计划项目（项目编号 KYLX16-0116）、苏州大学高级研究项目（项目编号 SDY2015_06）以及克罗恩病 & 结肠炎基金会研究奖学金（资助编号 310801）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22 G 灌胃针 | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-葡聚糖 | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| 黑色荧光检测用 96 孔板 | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 小鼠 | 南京大学南京生物医药研究院 | ||
| Caco-2BBe 细胞 | ATCC | CRL-2102 | |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 2160110 | |
| 含高糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基 | Hyclone | SH30243.01B | |
| 上皮电阻（伏特/欧姆）测量仪 | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 | |
| Falcon 管（15 mL） | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | FV1000 | |
| 荧光计 | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM 葡萄糖 | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| 模块化组织包埋中心 | Leica | EG1150H | |
| 血清采集管 | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 培养瓶 | Corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| 石蜡 | Sigma | A6330-1CS | |
| 聚碳酸酯膜（Transwell） | Costar | 3413 | |
| 压力泵 | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| 旋转切片机 | Leica | RM2235 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
参考文献
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