小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化

摘要

本文介绍了培养小鼠髓系前体细胞32D/G-CSF-R细胞系、进行病毒感染以及开展增殖和分化检测的详细实验方案。该细胞系适用于研究髓系细胞发育，以及目的基因在髓系细胞生长和中性粒细胞分化中的作用。

摘要

对造血干细胞和祖细胞生物学的理解在再生医学及血液系统疾病治疗中具有重要意义。尽管通过体内模型或原代培养可获得最为相关的数据，但造血干细胞和祖细胞数量稀少，极大地限制了可用于其研究的合适技术范围。因此，使用细胞系可大量生产生物材料，满足需要大量细胞的筛选或检测实验。本文详细描述了用于研究粒细胞生成及中性粒细胞分化过程的增殖与分化检测实验的方法、结果读取与解释。这些实验采用依赖细胞因子的32D/G-CSF-R小鼠髓系细胞系，该细胞系可在IL-3存在下增殖，并在G-CSF刺激下分化。我们提供了处理32D/G-CSF-R细胞的优化方案，并讨论了可能影响所述检测实验及预期结果的主要陷阱与局限性。此外，本文还包含慢病毒和逆转录病毒的制备、滴定及对32D/G-CSF-R细胞转导的实验方案。我们证明，对这些细胞进行遗传操作可用于成功开展功能与分子研究，从而补充通过原代造血干细胞和祖细胞或体内模型所获得的结果。

引言

造血干细胞和祖细胞群体为机体提供大量成熟的细胞，包括髓系谱系的细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞）。由造血干细胞生成髓系细胞的过程称为髓细胞生成（myelopoiesis），根据需求变化充分产生成熟髓系细胞，是机体应对感染和失血等应激状态的重要前提。成熟髓系细胞生成不足可能导致无法清除病原体、血液凝固能力下降以及其他危及生命的状况^1,2。此外，髓系谱系发育的异常也可能与血液系统恶性肿瘤相关，例如急性髓系白血病（AML）³。髓细胞生成的异常可由多种因素引起，例如细胞表面受体缺陷⁴、转录因子表达改变⁵、信号通路受损⁶、导致原癌基因形成或激活的突变⁷，或抑癌基因失活⁸。

已开发出多种方法用于研究髓系发育以及评估特定遗传改变在该过程中的影响。研究髓细胞生成的常用方法包括使用原代细胞和转基因小鼠。尽管这些模型能够获得具有生物学意义的数据，但仍存在一定的局限性。使用原代细胞面临细胞数量有限和培养时间较短的问题，限制了对基因表达进行干预以及后续生物学或生物化学分析的可能性....

方案

注意：以下步骤描述了 32D/G-CSF-R 细胞的扩增、分化和转导过程。

1. 准备

1. 培养基制备
   1. 制备250 mL培养基：RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培养基，添加10%热灭活胎牛血清（FBS）和小鼠IL-3（10 ng/mL）。
      1. 可选方案：使用自制IL-3。为制备自制IL-3，用表达IL-3的载体转导HEK293细胞，并收集含IL-3的上清液²²。
         注：除非另有说明，可在本方案的任何步骤中使用抗生素，如青霉素G（100 IU/mL）、链霉素（100 µg/mL）和庆大霉素（40 µg/mL），用于细胞培养。
   2. 制备50 mL分化培养基：RPMI 1640培养基，添加10% FBS和人G-CSF（100 ng/mL）。
      注：（重要）并非所有批次的血清均支持32D/G-CSF-R细胞的分化。在实验开始前应测试不同批次的血清。建议至少测试4个不同批次，并根据32D/G-CSF-R细胞的分化能力选择最优批次。参见下方32D/G-CSF-R细胞分化方案。
   3. 制备10 mL冻存培养基：RPMI 1640培养基，添加40% FBS和10% DMSO（二甲基亚砜）。
   ....

结果

32D/G-CSF-R 细胞的增殖与分化

为了评估32D/G-CSF-R细胞在促增殖和促分化条件下的增殖情况，将32D/G-CSF-R细胞分别培养在含有IL-3和G-CSF的培养基中。观察发现，培养在含IL-3（10 ng/mL）培养基中的细胞大约每24小时分裂一次（图2A）。当用G-CSF（100 ng/mL）替代IL-3后，细胞增殖逐渐减慢，并在4天后停止（图2A）。此外，通过May-Grünwald Giemsa染色的细胞涂片评估了在G-CSF存在下培养的细胞的分化状态。结果显示，在第0天（G-CSF处理开始前），细胞呈现未成熟的类似原粒细胞的形态，其特征为细胞核较大、细胞质呈深色（图2B）。随着处理时间的延长，细胞核体积减小，核形态逐渐变为月牙形或环形；同时，细胞质体积增大.......

讨论

实验模型的选择是研究中的主要问题之一。尽管原代动物和人类细胞被认为能够产生最具生物学相关性的数据，但这些模型可能涉及伦理问题，并且通常伴随着昂贵和/或复杂的分离/培养步骤。原代细胞数量有限，且难以进行遗传操作。此外，原代细胞代表由多种细胞类型组成的异质性群体，这可能会使数据分析变得复杂²⁹。相比之下，细胞系可提供近乎无限的生物材料来源，成本较低，并可避免伦理问题。然而，重要的是需要认识到，细胞系被视为一种人工实验系统，其在基因和表型上可能与其来源组织存在差异。尽管如此，当细胞系与其他实验方法结合使用时，仍可作为生成可重复且具有生物学相关性数据的有价值模型。

32D/G-CSF-R 细胞系以及 32D cl-3 细胞是研究小鼠嗜中性粒细胞分化的成熟且广泛应用的细胞培养模型^{14,15,24,30<.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 粉末培养基	Merck, Kenilworth, NJ, USA	T 121-10	不含 NaHCO3，含 L-谷氨酰胺
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15028
Opti-MEM I 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	31985-047	含 L-谷氨酰胺、酚红
胎牛血清（FBS）	PAA Laboratories (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)	MT35011CV	用于 32D/G-CSF-R 细胞的分化
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270	用于 HEK293T、NIH3T3、BOSC23 细胞的培养
青霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
链霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	硫酸链霉素盐粉末
庆大霉素	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
小鼠 IL-3	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA	213-13
人 G-CSF	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA	300-23
聚乙烯亚胺	Polyscience, Warrington, PA, USA	23966	线性，分子量 25,000（PEI 25000）
聚凝胺	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	H9268
胰蛋白酶	VWR Chemicals, Radnor, PA, USA	0458
EDTA	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	E5134
结晶紫	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	C0775
台盼蓝	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	T6146
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	D2650
May-Grünwald Giemsa	DiaPath, Martinengo, BG, Italy	10802