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小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化

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DOI：

10.3791/57033

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2018年2月21日

 ,  ,  , 
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了培养小鼠髓系前体细胞32D/G-CSF-R细胞系、进行病毒感染以及开展增殖和分化检测的详细实验方案。该细胞系适用于研究髓系细胞发育，以及目的基因在髓系细胞生长和中性粒细胞分化中的作用。

摘要

对造血干细胞和祖细胞生物学的理解在再生医学及血液系统疾病治疗中具有重要意义。尽管通过体内模型或原代培养可获得最为相关的数据，但造血干细胞和祖细胞数量稀少，极大地限制了可用于其研究的合适技术范围。因此，使用细胞系可大量生产生物材料，满足需要大量细胞的筛选或检测实验。本文详细描述了用于研究粒细胞生成及中性粒细胞分化过程的增殖与分化检测实验的方法、结果读取与解释。这些实验采用依赖细胞因子的32D/G-CSF-R小鼠髓系细胞系，该细胞系可在IL-3存在下增殖，并在G-CSF刺激下分化。我们提供了处理32D/G-CSF-R细胞的优化方案，并讨论了可能影响所述检测实验及预期结果的主要陷阱与局限性。此外，本文还包含慢病毒和逆转录病毒的制备、滴定及对32D/G-CSF-R细胞转导的实验方案。我们证明，对这些细胞进行遗传操作可用于成功开展功能与分子研究，从而补充通过原代造血干细胞和祖细胞或体内模型所获得的结果。

引言

造血干细胞和祖细胞群体为机体提供大量成熟的细胞，包括髓系谱系的细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞）。由造血干细胞生成髓系细胞的过程称为髓细胞生成（myelopoiesis），根据需求变化充分产生成熟髓系细胞，是机体应对感染和失血等应激状态的重要前提。成熟髓系细胞生成不足可能导致无法清除病原体、血液凝固能力下降以及其他危及生命的状况1,2。此外，髓系谱系发育的异常也可能与血液系统恶性肿瘤相关，例如急性髓系白血病（AML）3。髓细胞生成的异常可由多种因素引起，例如细胞表面受体缺陷4、转录因子表达改变5、信号通路受损6、导致原癌基因形成或激活的突变7，或抑癌基因失活8。

已开发出多种方法用于研究髓系发育以及评估特定遗传改变在该过程中的影响。研究髓细胞生成的常用方法包括使用原代细胞和转基因小鼠。尽管这些模型能够获得具有生物学意义的数据，但仍存在一定的局限性。使用原代细胞面临细胞数量有限和培养时间较短的问题，限制了对基因表达进行干预以及后续生物学或生物化学分析的可能性。转基因小鼠成本较高，且需要充分的生物学合理性支持。此外，在动物实验中工作还涉及 体内 模型增加了理解特定过程中目标基因作用的复杂性，因此需要采用替代方法来克服这些局限性。细胞系具有无可争议的优势：（1）具有无限增殖能力，可提供充足的材料用于生物化学和生物学研究；（2）易于进行遗传操作（如基因敲低、基因敲除、过表达）；（3）成本相对较低；（4）可在某些实验方法中实现所需的生物学简化程度。

亲代的IL-3（白细胞介素-3）依赖性32D细胞系由Greenberger及其同事于1983年建立，方法是用Friend小鼠白血病病毒感染C3H/HeJ小鼠的骨髓细胞9。文献中已报道了多个32D克隆：cl-239、cl-310和cl-1011。研究表明，32D cl-3细胞可在IL-3存在下增殖，并在粒细胞集落刺激因子（G-CSF）处理后发生中性粒细胞分化10。相反，32D cl-10细胞虽然依赖IL-3生长，但最初对G-CSF处理不发生分化反应。1995年，Ivo Touw博士的研究组通过逆转录病毒将野生型和突变型G-CSF受体（G-CSF-R）导入32D cl-10细胞，以鉴定该受体中功能重要的区域11。该研究成功构建了32D/G-CSF-R细胞系，这些细胞与亲代一样依赖IL-3，但在用G-CSF替代IL-3后的6至10天内，细胞停止增殖并不可逆地分化为成熟的中性粒细胞。这些特性使得32D cl-3和32D/G-CSF-R细胞成为可由两种明确的生长与分化因子——IL-3和G-CSF——调控的小鼠中性粒细胞分化的简化模型。在过去的几十年中，多个研究团队利用32D/G-CSF-R细胞研究特定基因在髓系细胞体外增殖与分化中的作用12,13,14,15,16，以及G-CSF信号通路17,18。重要的是，使用该细胞系获得的结果与原代细胞及转基因小鼠实验所得数据具有良好的一致性16,19,20,21。因此，我们认为，32D/G-CSF-R细胞作为一种被广泛使用且已确立的模型，是研究髓系分化的宝贵体系，可与其他方法并行用于解答相关科学问题。

本文提供了处理32D/G-CSF-R细胞系的详细实验方案，涵盖这些细胞的扩增、分化以及增殖和分化能力的评估。同时详细介绍了通过逆转录病毒或慢病毒转导对32D/G-CSF-R细胞进行遗传修饰的方法，并提供了病毒滴定的实验流程。此外，还列举了多个代表性实验结果，展示了32D/G-CSF-R细胞的潜在应用。

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方案

注意：以下步骤描述了 32D/G-CSF-R 细胞的扩增、分化和转导过程。

1. 准备

  1. 培养基制备
    1. 制备250 mL培养基：RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培养基，添加10%热灭活胎牛血清（FBS）和小鼠IL-3（10 ng/mL）。
      1. 可选方案：使用自制IL-3。为制备自制IL-3，用表达IL-3的载体转导HEK293细胞，并收集含IL-3的上清液22。
        注：除非另有说明，可在本方案的任何步骤中使用抗生素，如青霉素G（100 IU/mL）、链霉素（100 µg/mL）和庆大霉素（40 µg/mL），用于细胞培养。
    2. 制备50 mL分化培养基：RPMI 1640培养基，添加10% FBS和人G-CSF（100 ng/mL）。
      注：（重要）并非所有批次的血清均支持32D/G-CSF-R细胞的分化。在实验开始前应测试不同批次的血清。建议至少测试4个不同批次，并根据32D/G-CSF-R细胞的分化能力选择最优批次。参见下方32D/G-CSF-R细胞分化方案。
    3. 制备10 mL冻存培养基：RPMI 1640培养基，添加40% FBS和10% DMSO（二甲基亚砜）。
  2. 逆转录病毒的制备
    1. 将Bosc23细胞的单细胞悬液（6 × 106）接种于16 cm培养皿中，加入18 mL含10% FBS的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），在37 °C培养至细胞融合度达80%（约24小时）。
      注：细胞应呈单层生长，不应在培养过程中形成团块。细胞计数可采用多种方法（适用于本文所述其余方案）。若样本数量较少，推荐使用血球计数板在显微镜下进行手动计数。此情况下，使用台盼蓝排除死细胞。将细胞与PBS中的0.4%台盼蓝按1:1混合。若需对大量样本进行计数，可使用自动细胞计数仪。
    2. 将40 µg逆转录病毒载体（如MSCV）、20 µg pCL-Eco（包装质粒）23、80 µL PEI（聚乙烯亚胺）和2 mL无抗生素的低血清培养基（如Opti-MEM）混合，室温（RT）孵育20分钟。
    3. 小心吸除Bosc23细胞原有培养基，更换为16 mL含2% FBS的DMEM，使用前将培养基预热至37 °C。
      注：转染过程中不得使用抗生素，因其可能降低转染效率。
    4. 将步骤1.2.2中制备的混合液逐滴、轻柔地加入Bosc23细胞培养物中，37 °C孵育4小时。由于PEI具有毒性，孵育时间不得超过6小时。
    5. 孵育结束后，更换为18 mL预热的含10% FBS的DMEM，37 °C继续培养48小时。从本步骤起，将培养皿置于生物安全二级实验室中，并遵循标准安全操作规程。
    6. 使用25 mL移液管将Bosc23细胞培养上清液（含嗜鼠逆转录病毒颗粒）收集至50 mL锥形管中，4 °C保存。
      注：（重要）转染效率应达到90%，以获得高滴度病毒。
    7. 向Bosc23细胞中加入18 mL预热的含10% FBS的DMEM，继续培养24小时。
    8. 重复步骤1.2.6。
      注：步骤1.2.6和1.2.8收集的逆转录病毒上清液可在达到相同温度（4 °C）后合并，以保持病毒完整性。
    9. 为避免Bosc23细胞污染病毒上清液，将收集的病毒在4 °C、1500 × g离心10分钟。分装病毒，使用干冰或液氮速冻，-80 °C保存。但需注意，新鲜制备的病毒在感染效率方面优于冻存病毒。
      注：（重要）避免病毒反复冻融，因其会导致病毒降解。
  3. 慢病毒的制备
    1. 将HEK293T（人胚胎肾293T）细胞的单细胞悬液（6 × 106）接种于16 cm培养皿中，加入18 mL含10% FBS的DMEM，37 °C培养至细胞融合度达80%（约24小时）。
      注：细胞应呈单层生长，不应在培养过程中形成团块。
    2. 将15 µg慢病毒载体（如pGhU6）、包装质粒pCMVdR8.74（编码gag/pol，12 µg）和pMD2.VSVG（编码VSV-G，1.4 µg）、85.2 µL PEI以及2 mL无抗生素的低血清培养基混合，室温孵育20分钟。
    3. 小心吸除HEK293T细胞原有培养基，更换为16 mL含2% FBS的DMEM，使用前预热至37 °C。转染过程中不得使用抗生素，因其可能降低转染效率。
    4. 将步骤1.3.2中制备的混合液轻柔滴加至HEK293T细胞培养物中，37 °C孵育4小时。为防止PEI毒性，孵育时间应控制在6小时内。
    5. 更换为18 mL预热的含10% FBS的DMEM，37 °C继续培养48小时。从本步骤起，将培养皿置于生物安全二级实验室中，并遵循标准安全操作规程。
    6. 使用25 mL移液管将HEK293T细胞培养上清液（含兼嗜性慢病毒颗粒）收集至50 mL锥形管中，4 °C保存。
      注：（重要）转染效率应达到90%，以获得高滴度病毒。
    7. 向HEK293T细胞中轻柔加入18 mL预热的含10% FBS的DMEM，37 °C继续培养24小时。
    8. 重复步骤1.3.6。
      注：步骤1.3.6和1.3.8收集的慢病毒上清液可在达到相同温度（4 °C）后合并，以保持病毒完整性。
    9. 为避免HEK293T细胞污染病毒上清液，将收集的病毒在4 °C、1500 × g离心10分钟。分装病毒，使用干冰或液氮速冻，-80 °C保存。但需注意，新鲜制备的病毒在感染效率方面优于冻存病毒。
      注：（重要）避免病毒反复冻融，因其会导致病毒降解。
  4. 含GFP报告基因的病毒滴度测定
    1. 将1 × 105个NIH/3T3细胞接种于24孔板中，每孔加入300 µL含10% FBS的DMEM。每种病毒滴定需使用7个孔。
    2. 在37 °C融化病毒，分别向NIH/3T3细胞中加入1、5、10、50、100和500 µL病毒，阴性对照孔不加病毒。37 °C共培养48小时。
    3. 使用30 µL胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液（PBS中含0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA）消化收集NIH/3T3细胞，将细胞悬液转移至含250 µL PBS的FACS（荧光激活细胞分选）管中。
    4. 通过流式细胞术检测各样本中GFP+细胞的比例24。加入活细胞染料（如Hoechst 33258）以排除死细胞。
    5. 根据接种细胞数和GFP+细胞百分比，计算各孔中GFP+细胞总数，并将其对病毒感染体积作图。
      注：（重要）当使用高剂量病毒时，感染效率趋于平台期。因此，应基于感染效率呈线性关系的病毒浓度范围估算滴度（参见表1示例）。GFP+细胞数量反映特定体积病毒中功能性病毒颗粒的数量（TU，转化单位）。据此重新计算每毫升病毒中的TU数。
  5. 含嘌呤霉素报告基因的病毒滴度测定
    1. 将5 × 104个NIH/3T3细胞接种于6孔板中，每孔加入3 mL含10% FBS的DMEM，每种病毒滴定需使用6个孔。37 °C过夜培养。
    2. 次日，按表2所示稀释病毒。使用预热的含10% FBS的DMEM进行稀释，勿涡旋震荡。
    3. 吸除NIH/3T3细胞原有培养基，每孔加入1 mL稀释后的病毒液。
    4. 37 °C孵育过夜。
    5. 轻柔吸除含病毒的培养基，每孔加入2 mL预热的含10% FBS的DMEM，继续37 °C孵育过夜。
    6. 轻柔吸除NIH/3T3细胞培养基，每孔加入2 mL预热的含嘌呤霉素（2 µg/mL）的DMEM 10% FBS。
    7. 37 °C继续培养，每3天或当培养基变黄时，小心更换含嘌呤霉素的新鲜培养基。
    8. 感染后10–12天，吸除各孔培养基，用PBS轻柔洗涤一次。
    9. 每孔加入1 mL结晶紫溶液（0.5%结晶紫溶于20%乙醇和dH2O），室温染色2分钟，随后用PBS小心洗涤两次。
    10. 在显微镜下（×4放大）计数各孔中蓝色克隆数。阴性对照孔中不应观察到克隆。
    11. 根据稀释倍数计算每毫升病毒的TU总数。

2. 32D/G-CSF-R 细胞的扩增与维持

  1. 若32D/G-CSF-R细胞处于冷冻状态，取一份样品在37 °C水浴中解冻1分钟，并将细胞直接从冻存管转移至含有10%胎牛血清（FBS）的10 mL预温RPMI 1640培养基中，置于15 mL离心管内。轻轻颠倒混匀3次后，在400 × g条件下离心沉淀细胞。弃去上清液，将细胞重悬于含IL-3的培养基中，调整细胞浓度为0.3 × 106 个细胞/mL。
  2. 细胞最佳生长浓度为0.25–0.5 × 106 个细胞/mL。每2天传代一次，将细胞稀释至0.1–0.2 × 106 个细胞/mL。
    注意：（重要）若32D/G-CSF-R细胞培养浓度超过1 × 106 个细胞/mL，可能部分丧失其分化能力。因此，务必及时传代32D/G-CSF-R细胞。
  3. 根据需要，可将细胞分装后长期保存于-80 °C或液氮中。取3 × 106 个细胞离心沉淀，弃去上清液，加入1 mL冻存液重悬细胞。将离心管放入-80 °C冻存盒中。如需长期保存，应将细胞转移至液氮中储存。

3. 32D/G-CSF-R 细胞的转导

  1. 将32D/G-CSF-R细胞以0.3 × 106 个细胞/mL的浓度接种至6孔板中。
  2. 加入适量病毒，使感染复数（MOI）在10至40之间。
    注意：较高的MOI将导致GFP+细胞比例增加，以及目的基因表达水平升高。示例：以MOI为10感染0.3 × 106个细胞，需向32D/G-CSF-R细胞中加入3 × 106 TU病毒。
  3. 加入polybrene至终浓度为8 µg/mL，于37 °C孵育6小时。或者，可采用离心接种法：在培养板中使用水平转子，于30 °C以1200 × g离心90分钟，随后于37 °C孵育3小时。
  4. 收集细胞，转移至15 mL离心管中，于450 × g离心5分钟（4 °C）。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL培养基中，转移至T25细胞培养瓶，并于37 °C培养。
  6. 48小时后，收集细胞并于450 × g离心5分钟（4 °C），弃去上清液。
  7. 若使用GFP报告系统：将细胞重悬于500 µL PBS中，利用流式细胞分选仪分选GFP+细胞。若载体含有嘌呤霉素（puromycin）抗性基因：将细胞置于含2 µg/mL嘌呤霉素的培养基中培养。
  8. 根据后续分析和实验需要扩增细胞。
    注意：（可选）转导后的细胞可置于冻存液中，使用冻存盒于-80 °C冻存，之后转移至液氮中长期保存。

4. 32D/G-CSF-R 细胞增殖实验

  1. 为评估细胞增殖速率，将 0.2 × 106 个细胞接种于 1 mL 培养基中，并在 37 °C 条件下过夜培养。
  2. 次日计数细胞数量，并用培养基将其重新稀释至浓度为 0.2 × 106 个细胞/mL。在 37 °C 条件下过夜培养。使用 表 3 记录每日培养物的细胞浓度及所进行的稀释倍数。
  3. 根据需要评估增殖的时间长短，重复步骤 4.2 多天。
    注意：增殖实验的持续时间取决于目的基因的作用效果。若表型显著，8–9 天可能已足以观察到明显效应（见 图 3A）；然而，若表型较温和，则可能需要更长的培养时间。
  4. 按照 表 3 所示方法绘制增殖曲线，以评估细胞生长情况。

5. 32D/G-CSF-R 细胞分化实验

  1. 用不含细胞因子的 RPMI 培养基将 0.2 × 106 个 32D/G-CSF-R 细胞洗涤两次。
    注意：在向培养体系中加入 G-CSF 前的洗涤步骤非常重要，因为残留的 IL-3 可能会抑制细胞分化。
  2. 将细胞置于含有 100 ng/mL G-CSF 的 1 mL 分化培养基中，接种于 24 孔板，使细胞浓度达到 0.2 × 106 个细胞/mL（第 0 天）。在 37 °C 下过夜培养。
  3. 按照上述方法（步骤 1.2.1）计数每毫升的细胞数量。
  4. 使用配备适当适配器的离心机，在 20 × g 条件下，将 2–5 × 104 个细胞通过细胞离心涂片仪沉降到载玻片（76 mm × 26 mm）上。
  5. 更换新鲜的分化培养基，并将细胞以 0.2 × 105 个细胞/mL 的浓度重新接种至新的 24 孔板中（第 1 天）。弃去旧的培养板，并于次日使用新板进行步骤 5.6。
  6. 在第 2 至第 7 天，重复执行步骤 5.3 至 5.5。按照步骤 4 所述方法评估 G-CSF 存在下的细胞增殖情况。
    注意：（重要）在分化过程中，细胞增殖速度减慢，因此在加入 G-CSF 3 至 4 天后，将细胞以较高浓度培养即可满足实验需求。
  7. 根据细胞形态评估 32D/G-CSF-R 细胞的分化状态。
    1. 将步骤 5.4 中获得的细胞用甲醇在室温下固定 5 分钟，然后让载玻片自然干燥。
      注意：第 0 天至第 7 天的载玻片可在室温下保存，并在后续统一进行固定；同样，固定后的载玻片也可在室温下长期保存。
    2. 按照制造商说明书使用 May-Grünwald Giemsa 染色法对细胞进行染色。
    3. 使用显微镜在 40 倍放大倍数下观察染色后的细胞。
    4. 参照图 1中的示例图片及表 4中的描述，定量分析原始细胞、中间分化阶段细胞和成熟粒细胞的数量。

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结果

32D/G-CSF-R 细胞的增殖与分化

为了评估32D/G-CSF-R细胞在促增殖和促分化条件下的增殖情况，将32D/G-CSF-R细胞分别培养在含有IL-3和G-CSF的培养基中。观察发现，培养在含IL-3（10 ng/mL）培养基中的细胞大约每24小时分裂一次（图2A）。当用G-CSF（100 ng/mL）替代IL-3后，细胞增殖逐渐减慢，并在4天后停止（图2A）。此外，通过May-Grünwald Giemsa染色的细胞涂片评估了在G-CSF存在下培养的细胞的分化状态。结果显示，在第0天（G-CSF处理开始前），细胞呈现未成熟的类似原粒细胞的形态，其特征为细胞核较大、细胞质呈深色（图2B）。随着处理时间的延长，细胞核体积减小，核形态逐渐变为月牙形或环形；同时，细胞质体积增大...

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讨论

实验模型的选择是研究中的主要问题之一。尽管原代动物和人类细胞被认为能够产生最具生物学相关性的数据，但这些模型可能涉及伦理问题，并且通常伴随着昂贵和/或复杂的分离/培养步骤。原代细胞数量有限，且难以进行遗传操作。此外，原代细胞代表由多种细胞类型组成的异质性群体，这可能会使数据分析变得复杂29。相比之下，细胞系可提供近乎无限的生物材料来源，成本较低，并可避免伦理问题。然而，重要的是需要认识到，细胞系被视为一种人工实验系统，其在基因和表型上可能与其来源组织存在差异。尽管如此，当细胞系与其他实验方法结合使用时，仍可作为生成可重复且具有生物学相关性数据的有价值模型。

32D/G-CSF-R 细胞系以及 32D cl-3 细胞是研究小鼠嗜中性粒细胞分化的成熟且广泛应用的细胞培养模型14,15,24,30<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Ruud Delwel 教授和 Ivo Touw 教授提供了 32D/G-CSF-R 细胞系，感谢 Daniel G. Tenen 教授提供了 Bosc23 细胞系。本研究得到了捷克科学基金会（GACR 15-03796S 和 GACR 17-02177S）向 MA-J 提供的资助，捷克科学院分子遗传学研究所（RVO 68378050）向 MA-J 提供的支持，以及布拉格查理大学 GA UK 奖学金（项目编号 341015）向 MK 提供的资助和 GA UK 奖学金（项目编号 1278217）向 PD 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640 粉末培养基Merck, Kenilworth, NJ, USAT 121-10不含 NaHCO3，含 L-谷氨酰胺
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Opti-MEM I 低血清培养基Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA31985-047含 L-谷氨酰胺、酚红
胎牛血清（FBS）PAA Laboratories (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)MT35011CV用于 32D/G-CSF-R 细胞的分化
胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270用于 HEK293T、NIH3T3、BOSC23 细胞的培养
青霉素Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)P3032
链霉素Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137硫酸链霉素盐粉末
庆大霉素Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)G1914
小鼠 IL-3PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA213-13
人 G-CSFPeproTech, Rocky Hill, NJ, USA300-23
聚乙烯亚胺Polyscience, Warrington, PA, USA23966线性，分子量 25,000（PEI 25000）
聚凝胺Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
胰蛋白酶VWR Chemicals, Radnor, PA, USA0458
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
结晶紫Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)C0775
台盼蓝Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)T6146
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)D2650
May-Grünwald GiemsaDiaPath, Martinengo, BG, Italy10802

参考文献

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