一种基于延时、无标记、定量相位成像的休眠与活跃人癌细胞研究

摘要

利用定量相位成像技术对静息态和活跃态癌细胞表型进行表征。将细胞增殖、迁移和形态学检测整合于一种简便的方法中进行分析。

摘要

获得血管生成表型是肿瘤脱离休眠状态的关键环节。尽管已有多种经典 体外 检测方法（例如增殖、迁移等 体内 已开发多种模型用于研究和表征促血管生成与非促血管生成的细胞表型，但这些方法耗时且劳动密集，通常需要昂贵的试剂和仪器，以及较高的专业技术水平。在最近的一项研究中，我们采用一种新型的定量相位成像（QPI）技术，对促血管生成与非促血管生成的人骨肉瘤KHOS细胞进行了无标记、延时成像的表征分析。利用QPI技术，我们定量测量并分析了一系列细胞参数，包括细胞形态、增殖和运动性。这种新颖且定量的方法为持续、无创地研究癌细胞及其他细胞类型的相关细胞过程、行为和特征提供了可能，且操作简便、集成度高。本报告介绍了我们的实验方案，包括细胞制备、QPI数据采集及数据分析流程。

引言

实体瘤发生与进展过程中最早期的检查点之一是获得血管生成表型，这是癌症的一个标志性特征。这一进展过程涉及多种生物化学和分子过程^1,2,3。在研究肿瘤进展这一关键步骤时，面临的技术挑战之一是缺乏能够以无偏倚方式对活体癌细胞的血管生成表型与非血管生成表型进行连续、定量表征和区分的工具。目前用于研究血管生成与非血管生成细胞行为的传统检测方法通常需要昂贵的试剂和仪器，例如细胞增殖/迁移实验^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,}

方案

本文所述所有方法均已获得波士顿儿童医院机构生物安全委员会的批准。

1. 细胞制备

1. 解冻KHOS-A和KHOS-N细胞
   1. 预热培养基， 即，添加10%（体积/体积）胎牛血清（FBS）和1%（体积/体积）青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基。
   2. 从液氮罐中取出冻存细胞的冻存管，将冻存管底部浸入37 °C水浴中的温水中，并轻轻摇动冻存管以加速解冻过程。注意保持冻存管管盖不接触水，以避免污染。细胞一旦完全解冻，立即用70%乙醇溶液喷洒并擦拭冻存管表面进行消毒。
   3. 在超净工作台中，立即吸出冻存管中的细胞悬液，并轻轻悬浮于10 mL预热的培养基（见1.1.1）中。将细胞悬液在约200 × g条件下离心5–7分钟。
   4. 用10 mL预热的培养基重悬细胞沉淀，并转移至T75培养瓶中。使用10 mL移液管轻轻吹打数次，使细胞均匀悬浮。
   5. 将培养瓶置于含5%（体积/体积）CO₂的37 °C培养箱中₂ 并置于湿润的培养环境中。让细胞贴壁至少12小时。
   6. 将细胞培养约3至7天，直至汇合度达到80%–100%。每2至3天更换一次培养基。
2. 分离 KHOS-A 和 -N 细胞
   1. 从培养....

结果

图1展示了一个典型的细胞形态学表征。图像以全息图（图1A-B）和二维图像（图1C-D）的形式呈现。通过线轮廓或全细胞测量方法对光学细胞厚度（根据折射率和光程差计算）进行量化。KHOS-A和KHOS-N细胞的全细胞测量面积与厚度的散点图如图1E-G所示，这两种表型表现出不同的分布模式。直方图（图1H-M）中的平均数值或导出文件数据显示，KHOS-A细胞的细胞面积较小，但厚度大于KHOS-N细胞。

使用细胞计数功能，获得了细胞增.......

讨论

在本研究中，我们描述了一种 体外，一种利用定量相位成像（QPI）无创、无标记地对人体骨肉瘤细胞的血管生成性与非血管生成性表型进行定量表征的方法。该集成化高通量方法可同时分析多种细胞参数，包括细胞面积、细胞厚度、细胞体积、增殖率、倍增时间、迁移方向性、运动速度、迁移能力及运动能力。

与评估细胞形态和细胞行为的传统检测方法相比，该方法不仅节省了时间和人力，还提供了更准确和详细的信息。例如，QPI系统位于细胞培养箱内部，可减少因在常温常压环境（室温及大气环境）下成像所引起的环境变化干扰²³。此外，通过相位偏移可转换获得光学细胞厚度和体积，而传统的细胞成像过程仅能测量细胞面积。QPI的这一特性为不同细胞表型的定量比较提供了更详尽的信息。

目标细胞的适当接种密度在本方法中至关重要。在成像采集阶段，由于该相干定量相位成像（QPI）技术的局限性，成像只能通过单一焦平面进行，可能导致z方向部分信息丢失，因此要求细胞密度低于完全汇合的单层状态。即，重叠的细胞）。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T75 培养瓶	美国纽约州康宁	353136
6孔板	美国纽约州康宁	3506
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国	11965092
胎牛血清（FBS）	美国佐治亚州亚特兰大生物公司	S11550
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国	10010023
Beckman Z1 Coulter计数器	Beckman Coulter, IN, 美国	Z1
HoloMonitor M4	Phase Holographic Imaging Phi AB，瑞典隆德	M4	显微镜
Hololid	Phase Holographic Imaging Phi AB，瑞典隆德	PHI 8020
HStudioM4	Phase Holographic Imaging Phi AB，瑞典隆德	HStudioM4	软件