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方法文章

一种基于延时、无标记、定量相位成像的休眠与活跃人癌细胞研究

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DOI：

10.3791/57035

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2018年2月16日

 ,  , 
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

利用定量相位成像技术对静息态和活跃态癌细胞表型进行表征。将细胞增殖、迁移和形态学检测整合于一种简便的方法中进行分析。

摘要

获得血管生成表型是肿瘤脱离休眠状态的关键环节。尽管已有多种经典 体外 检测方法（例如增殖、迁移等 体内 已开发多种模型用于研究和表征促血管生成与非促血管生成的细胞表型，但这些方法耗时且劳动密集，通常需要昂贵的试剂和仪器，以及较高的专业技术水平。在最近的一项研究中，我们采用一种新型的定量相位成像（QPI）技术，对促血管生成与非促血管生成的人骨肉瘤KHOS细胞进行了无标记、延时成像的表征分析。利用QPI技术，我们定量测量并分析了一系列细胞参数，包括细胞形态、增殖和运动性。这种新颖且定量的方法为持续、无创地研究癌细胞及其他细胞类型的相关细胞过程、行为和特征提供了可能，且操作简便、集成度高。本报告介绍了我们的实验方案，包括细胞制备、QPI数据采集及数据分析流程。

引言

实体瘤发生与进展过程中最早期的检查点之一是获得血管生成表型，这是癌症的一个标志性特征。这一进展过程涉及多种生物化学和分子过程1,2,3。在研究肿瘤进展这一关键步骤时，面临的技术挑战之一是缺乏能够以无偏倚方式对活体癌细胞的血管生成表型与非血管生成表型进行连续、定量表征和区分的工具。目前用于研究血管生成与非血管生成细胞行为的传统检测方法通常需要昂贵的试剂和仪器，例如细胞增殖/迁移实验4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14，或需进行互补的体内评估4,5,6,8,15,16，同时还要求研究人员具备较高的专业技能，并耗费大量时间和人力。

近年来，定量相位成像（QPI）作为一种新兴技术，能够对多种细胞形态和行为参数进行无标记、延时的定量分析17,18,19,20,21,22。与传统光学显微镜不同，QPI在光穿过光学样品后，逐像素量化相位偏移的变化，并重建出包含转换后的光学厚度和体积信息的全息图像，从而实现对活细胞的直接分析，并具备以下特点：（1）定量成像，（2）无创且可进行延时成像，（3）无需标记的成像，以及（4）多参数同步成像。这些特性使QPI成为在细胞水平上评估和理解病理过程的有力工具。

在最近的一项研究中，我们利用定量相位成像技术（QPI），通过结合细胞形态、增殖和运动性分析，以系统且定量的方式对人骨肉瘤细胞的血管生成型 KHOS-A 与非血管生成型 KHOS-N 表型进行了定量表征与区分23。通过图像分析软件，对血管生成型与非血管生成型人骨肉瘤细胞的多项细胞形态学及行为参数进行了定量比较，共识别出这两种表型之间的五个特征性差异。这一新方法为评估多种生物学相关的细胞特性提供了整合性且定量的分析平台。

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方案

本文所述所有方法均已获得波士顿儿童医院机构生物安全委员会的批准。

1. 细胞制备

  1. 解冻KHOS-A和KHOS-N细胞
    1. 预热培养基， 即，添加10%（体积/体积）胎牛血清（FBS）和1%（体积/体积）青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基。
    2. 从液氮罐中取出冻存细胞的冻存管，将冻存管底部浸入37 °C水浴中的温水中，并轻轻摇动冻存管以加速解冻过程。注意保持冻存管管盖不接触水，以避免污染。细胞一旦完全解冻，立即用70%乙醇溶液喷洒并擦拭冻存管表面进行消毒。
    3. 在超净工作台中，立即吸出冻存管中的细胞悬液，并轻轻悬浮于10 mL预热的培养基（见1.1.1）中。将细胞悬液在约200 × g条件下离心5–7分钟。
    4. 用10 mL预热的培养基重悬细胞沉淀，并转移至T75培养瓶中。使用10 mL移液管轻轻吹打数次，使细胞均匀悬浮。
    5. 将培养瓶置于含5%（体积/体积）CO₂的37 °C培养箱中2 并置于湿润的培养环境中。让细胞贴壁至少12小时。
    6. 将细胞培养约3至7天，直至汇合度达到80%–100%。每2至3天更换一次培养基。
  2. 分离 KHOS-A 和 -N 细胞
    1. 从培养瓶中移除培养基。
    2. 用5 mL无钙、无镁的无菌PBS（1×）洗涤细胞，以去除未贴壁的细胞或组分。
    3. 加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液至培养瓶中，并轻轻晃动培养瓶，确保胰蛋白酶-EDTA溶液均匀分布。
    4. 在37 °C培养箱中孵育2 - 3分钟，或在室温下孵育3 - 5分钟。在显微镜下以约400倍放大观察细胞 放大镜检以确认细胞已变圆并脱落。
    5. 细胞脱落后，加入10 mL培养基，用10 mL移液管轻轻吹打数次，将细胞团块分散成单细胞悬液。
    6. 使用细胞计数器计数细胞。将细胞悬液以 2 × 10⁵ 个/mL 的密度接种至新的 T75 培养瓶中。6 细胞或 1:4 的比例。
    7. 在进行QPI实验前，让细胞生长至80%–100%汇合度。
  3. 接种KHOS-A和KHOS-N细胞用于QPI
    1. 将KHOS-A和KHOS-N细胞以50,000 - 300,000个细胞/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入5 mL培养基，接种前使用细胞计数仪进行计数。
      注意：接种密度取决于细胞增殖速率以及成像时间周期，以确保在成像期间获得适宜的细胞密度。 <成像采集期间达到100%汇合度。
    2. 孵育细胞至少12小时，以促进贴壁。
    3. 在进行QPI之前，更换为新鲜培养基。

2. QPI 采集

  1. 盖玻片准备
    1. 用流动的去离子水冲洗盖玻片数次以清洁，并将其浸入75%乙醇溶液中消毒15分钟。将盖玻片放入无菌超净工作台中晾干。
    2. 小心地将盖玻片放置于6孔板上，避免产生明显气泡。确保盖玻片底部浸没在培养基中（每孔至少5 mL）。
    3. 将6孔板放入培养箱（37 °C、5% CO2、饱和湿度环境）中平衡至少15分钟。若盖玻片表面产生雾气，使用无菌棉签擦拭干净。
  2. 使用显微镜成像细胞
    1. 打开软件以初始化系统，包括自动校准曝光时间、图案对比度和全息噪声。确保各项数值处于可接受范围（显示为绿色或黄色）。
    2. 将6孔板放置于QPI显微镜的载物台上。
    3. 点击 "Live Capture"，在 "Software focus" 中选择 "Manual"。通过在 "Microscope setting" 中调节工作距离，粗略聚焦细胞的相位图像，以获得细胞在相位图像中的轮廓。随后将 "Software focus" 切换至 "Automatic"。
    4. 点击 "New experiment" 创建新实验。使用鼠标或数字小键盘上的方向键选择图像采集位置。每次选择后点击 "Remember" 保存位置。通常每个样本选择3至5个位置。
    5. 在 "Timelapse" 部分设置成像时间间隔和总时长。
      注意：为清晰追踪癌细胞，时间间隔应短于5分钟。联合QPI分析的总时长设定为48小时。
    6. 点击 "Capture" 开始实验，系统将自动在设定的时间点进行聚焦并采集图像。

3. 数据分析

  1. 细胞形态学分析
    1. 点击 "鉴定细胞。调整数字设置以 "背景阈值" 使细胞区域与背景噪声充分分离。调整设置数值以 "物体大小" 确保每个细胞只有一个细胞核。对于需要进行比较的样本，应保持参数一致，因为这些参数可能影响最终的面积和体积测量结果。通过使用 "手动更改（如需要）。
    2. 使用 "分析数据" 使用软件中的功能分析细胞。通过点击开始新的数据分析 "新分析。将选定的图像拖入 "源帧" 细胞面积（µm2），光学厚度（µm）和体积（µm3为每个单个细胞获取数据。选择散点图或直方图模式，并将数据导出为表格或图像。
  2. 细胞增殖分析
    1. 选择至少5张不同时期的图像例如，初始、12 小时、24 小时、36 小时和 48 小时）。记录软件提供的细胞数量。
    2. 为估算倍增时间，将细胞数量相对于初始数量进行归一化后作图，并拟合指数生长曲线。
  3. 细胞运动分析
    1. 使用 "追踪细胞" 软件中的功能。点击 "新分析" 开始新的数据分析。拖拽选定时间段的一系列图像（例如，24小时孵育后4小时）加入到 "源帧" 点击下方细胞随机选择 10 - 30 个细胞 "加入细胞" 选择模式。排除视野边缘的细胞以及移出视野的细胞。
    2. 仔细检查图像序列中的追踪情况。如果系统丢失了某个细胞的追踪或追踪到了错误的细胞，可通过点击手动调整该细胞的追踪 "识别" 用于识别细胞或点击 "修改位置" 在……之下 "选择" 模式以修改细胞位置。
    3. 选择细胞轨迹的玫瑰图 "绘制运动轨迹" 或其他与运动相关的参数的图表 "绘图特征，例如运动速度（µm/h）、运动距离（µm）、迁移距离（µm）和迁移方向性。将数据导出为表格或图表。

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结果

图1展示了一个典型的细胞形态学表征。图像以全息图（图1A-B）和二维图像（图1C-D）的形式呈现。通过线轮廓或全细胞测量方法对光学细胞厚度（根据折射率和光程差计算）进行量化。KHOS-A和KHOS-N细胞的全细胞测量面积与厚度的散点图如图1E-G所示，这两种表型表现出不同的分布模式。直方图（图1H-M）中的平均数值或导出文件数据显示，KHOS-A细胞的细胞面积较小，但厚度大于KHOS-N细胞。

使用细胞计数功能，获得了细胞增...

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讨论

在本研究中，我们描述了一种 体外，一种利用定量相位成像（QPI）无创、无标记地对人体骨肉瘤细胞的血管生成性与非血管生成性表型进行定量表征的方法。该集成化高通量方法可同时分析多种细胞参数，包括细胞面积、细胞厚度、细胞体积、增殖率、倍增时间、迁移方向性、运动速度、迁移能力及运动能力。

与评估细胞形态和细胞行为的传统检测方法相比，该方法不仅节省了时间和人力，还提供了更准确和详细的信息。例如，QPI系统位于细胞培养箱内部，可减少因在常温常压环境（室温及大气环境）下成像所引起的环境变化干扰23。此外，通过相位偏移可转换获得光学细胞厚度和体积，而传统的细胞成像过程仅能测量细胞面积。QPI的这一特性为不同细胞表型的定量比较提供了更详尽的信息。

目标细胞的适当接种密度在本方法中至关重要。在成像采集阶段，由于该相干定量相位成像（QPI）技术的局限性，成像只能通过单一焦平面进行，可能导致z方向部分信息丢失，因此要求细胞密度低于完全汇合的单层状态。即，重叠的细胞）。...

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致谢

作者们衷心感谢乳腺癌研究基金会和先进医学研究基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
T75 培养瓶美国纽约州康宁353136
6孔板 美国纽约州康宁3506
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国11965092
胎牛血清（FBS） 美国佐治亚州亚特兰大生物公司S11550
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国10010023
Beckman Z1 Coulter计数器Beckman Coulter, IN, 美国Z1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB，瑞典隆德M4显微镜
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB，瑞典隆德PHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB，瑞典隆德HStudioM4软件

参考文献

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