本文介绍了一种经济、优化且简便的实验方案，该方案采用伊文思蓝染料法检测FVBN小鼠器官中的血浆外渗，可适用于其他品系、物种以及其他器官或组织。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
血管渗漏或血浆外渗具有多种成因，可能是炎症反应的严重后果或症状。本研究最终可能有助于揭示血浆外渗的成因，或发现新的抑制或治疗方法。研究人员必须具备适当的工具，包括目前可用的最佳方法，以研究血浆外渗。本文介绍了一种使用伊文思蓝染料法检测FVBN小鼠器官中血浆外渗的实验方案。该方案在尽可能的前提下设计得极为简便，但仍可提供高质量的数据。选择伊文思蓝染料的主要原因是其易于普通实验室操作使用。我们已利用该方案为以下假说提供了证据和支持：即酶内肽酶（neprilysin）可能保护血管系统免受血浆外渗的影响。然而，该方案在实验中可灵活调整，适用于其他品系的小鼠或其他物种，也可用于多种不同器官或组织的研究，探讨其他在理解、预防或治疗血浆外渗过程中具有重要意义的因素。本方案在现有方法基础上经过广泛优化和改进，兼具可靠性、操作简便性、经济性以及试剂与设备的普遍可获得性，使其成为普通实验室定量检测器官血浆外渗的优选方案。
引言
器官中的血管渗漏是指血液血浆通过器官内毛细血管后微静脉内皮细胞形成的间隙发生外渗的现象。这种血浆外渗或血管通透性增加可能由某种炎症反应引发，具有严重的后果。因此，研究并理解这一现象及其成因、调节因素和后果至关重要；同时，研究人员也需要具备可靠的研究工具和实验方案。内皮细胞间隙可由多种刺激产生，但通常是由肽类神经递质和/或速激肽作用于内皮细胞所致。在这一过程中，导致血浆外渗增加的主要天然介质之一是十一肽速激肽类神经肽——P 物质1。
已开发出利用伊文思蓝染料与白蛋白结合特性的方法，用于研究和测量血管通透性或血浆外渗，这些方法通常以其准确性、简便性、经济性、安全性以及可根据需要同时测定多种组织血浆外渗的能力而著称2,3,4,5,6,7,8,9。本方案在FVBN小鼠器官中评估血浆外渗时采用了上述优点，并加入....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中所述实验均遵循所有适用的国际、国家和/或机构关于动物（小鼠）护理与使用的指南。
本方法采用16至20周龄的FVBN成年小鼠，该年龄段被证明最适合本研究的目的。第1天包括步骤1至5，第2天包括步骤6至7（图1）。
1. 仪器设备准备
- 若使用氯胺酮/赛拉嗪作为麻醉剂（推荐方案），需准备充足的一次性无菌注射器和针头。若使用异氟烷作为麻醉剂，实验开始前应检查氧气瓶及异氟烷液体水平，确保实验所需物资充足。同时，组装鼻罩呼吸回路并连接至诱导箱；将新的活性炭罐连接至呼吸回路。打开氧气，调节至第二级压力表读数约为50 psi，以完成诱导箱的准备工作。
- 将加热垫调至37 °C。
- 为手术准备直肠温度探头。
2. 小鼠准备
该步骤包括麻醉、脱毛和体位固定（成年FVBN小鼠，年龄16至20周）。
- 称量小鼠并记录体重。
- 麻醉小鼠。
- 腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为 80 - 100 mg/kg 和 7.5 - 16 mg/kg）。然而，建议起始剂量采用较低水平的氯胺酮和赛拉嗪（分别约为 30 mg/kg 和 6 mg/kg）....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在图1中展示了该实验流程的示意图，该方法已被证实可从FVBN小鼠器官中获得最可靠且一致的P物质诱导的血浆外渗值。该流程通常需要两天的实验操作，中间至少间隔48小时。如果所有待比较的实验均保持一致，也可进一步延长操作间隔时间。例如，在第1天分离器官后，可将器官在液氮中速冻并保存于-80 °C；在仔细解冻器官（数天至一周内）后，可在继续后续步骤前用PBS洗涤并吸干。此外，尽管组织干燥步骤应按所述条件进行（150 °C下干燥48小时），但将组织半份在甲酰胺中提取伊文思蓝的时间可延长至48–72小时，前提是所有实验在甲酰胺中的提取时间保持一致。
图2 和 表1 显示了P物质诱导的FVBN野生型（WT）和中性内肽酶基因敲除（NEP KO）小鼠膀胱血浆外渗的数据17.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
如上所述，对血浆外渗的研究最终可能带来关于其成因的新认识，或发现抑制或治疗血浆外渗的新方法。本论文已成功验证了上述使用伊文思蓝染料的血浆外渗实验方案。尽管实验数据支持NEP可能保护血管系统免受血浆外渗这一假设，但目前这仅为次要目标，主要目标是提供一种优化后的实验方案，以便普通实验室能够方便地在今后的血浆外渗研究中直接采用。本文所报告的方案注重适应未来不同研究目标、动物种类、器官及其他实验条件的研究需求，尤其具有优势的是，该方案操作简便、结果可靠、经济实惠，并充分考虑了常规实验材料、试剂和合格实验人员的普遍可及性。然而需要注意的是，为获得具有统计学意义的结果，每组动物需要进行相当数量的重复实验（建议8至12次重复）。
已有大量研究和报告详细描述了测量血管通透性和血浆外渗的各种尝试。迄今为止，大多数报告所涉及的方法均为伊文思蓝染料法的变体，用于研究血浆外渗和血管通透性2,3,6,.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Andy Poczobutt和Jori Leszczynski博士对本文稿提供的宝贵帮助和修改意见。 本研究得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI RO1 HL078929、PPG HL014985 和 RO3 HL095439）以及退伍军人事务部（Merit Review）资助项目的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Vet One | 200-070 | 吸入麻醉剂 |
| 氯胺酮 | Vet One | 200-055 | 可注射麻醉剂 |
| 赛拉嗪 | Lloyd Laboratories | 139-236 | 可注射麻醉剂 |
| 注射器（10,3 &和 1 cc） | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| 针头（20G1，23G1） && 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| 异氟烷诱导室 | VetEquip | 941443 | 1 升 |
| 鼻锥式呼吸回路 | VetEquip | RC2 | 啮齿类动物神经环路控制器 2 |
| 氧气瓶 | Airgas | UN 1072 | 100% 医用 |
| 加热垫 | CWE 公司 | TC-1000 | 温度控制器 |
| 直肠温度探头 | CWE 公司 | 10-09012 | 小鼠 |
| 平衡（用于啮齿类动物） | Ohaus | CS 2000 | |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 15000-00 | Vannas弹簧剪，3毫米直刃（用于切割血管） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11151-10 | Graefe超细镊子（用于分离小鼠血管） |
| 手术器械-止血钳 | 精细科学工具 | 13009-12 | 哈尔斯泰德-蚊式止血钳（钝头解剖，用于夹持组织） |
| 手术工具 - 缝合驱动器 | 精细科学工具 | 12502-12 | Olsen-Hegar 持针器（缝合） |
| 手术器械-镊子 | 精细科学工具 | 11627-12 | 阿德森-布朗鳄嘴钳（用于组织抓取缝合，大鼠） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14110-15 | 梅奥粗剪刀 15 厘米（外科、解剖、骨骼、大鼠） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 18025-10 | 缝合打结钳（用于Millar导管） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14078-10 | Lexer 婴儿直剪（手术用，小鼠） |
| 手术工具-镊子 | 精细科学工具 | 11254-20 | Dumont #5 细尖镊子（大鼠血管，解剖） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14082-09 | 12毫米解剖剪（手术用，大鼠小鼠） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11051-10 | 10 cm 格雷夫镊子（组织抓取，大鼠小鼠） |
| 手术器械-镊子 | 精细科学工具 | 11251-35 | Dumont 5/45 镊子（血管导入用） |
| 外科手术器械—牵开器 | 精细科学工具 | 17012-11 | Weitlaner拉钩 2/3齿（大鼠外科用） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11294-00 | Dumont #4 镊子（用于大鼠、小鼠的血管分离） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11297-00 | Dumont #7 镊子（用于组织抓取与解剖） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14058-11 | 坚韧剪刀（小鼠解剖，骨骼） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11009-13 | 锯齿状、弯曲的Semken镊子（用于抓取组织，小鼠、大鼠） |
| 手术器械-止血钳 | 精细科学工具 | 13003-10 | 哈特曼弯止血钳（钝性分离，夹持组织） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11006-12 | Adson 带齿镊（用于夹持组织） |
| 剪毛器 | Oster | A5 | |
| 胶带 | Fisherbrand | 159015G | |
| 人工泪液软膏 | Akorn公司 | 13985-600-03 | |
| 利多卡因 | Hospira | 0409-4277-01 | 2% 注射用 |
| 聚乙烯导管 | Tygon | PV-1 | |
| 伊文思蓝 | Sigma Aldrich | E2129 | |
| P 物质 | Bachem | H-1890 | |
| 肝素 | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| 生理盐水 | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% 氯化钠 |
| 苯巴比妥 | Vortech | 0298-9373-68 | |
| 柠檬酸钠 | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| 用于吸印的Kimwipes纸巾 | Fisher Scientific | 06-666A | |
| 甲酰胺 | Sigma Aldrich | 47670 | |
| 微量天平 | 丹佛仪器 | APX-60 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| 聚苯乙烯96孔板 | Becton Dickinson | 351172 | |
| 吸光度酶标仪 | BioTek | Synergy 2 | |
| 聚丙烯酰胺凝胶 | Bio-Rad | 3450014 | |
| 蛋白质分子量标准品 | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran 支持型硝酸纤维素膜 | Amersham (GE) | 10600015 | |
| 凝胶电泳槽 | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-1 | |
| 初级NEP多克隆抗体 | R & D Systems | AF1182 | |
| 强力霉素饲料 | Teklad（HARLAN） | TD.130750 | |
| FVB/NJ野生型小鼠 | Jackson | 001800 | |
| 二抗（山羊抗兔） | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL溶液-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| 薄膜 | 皮尔斯 | 34091 |
参考文献
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig s....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
