本文介绍了一种经济、优化且简便的实验方案，该方案采用伊文思蓝染料法检测FVBN小鼠器官中的血浆外渗，可适用于其他品系、物种以及其他器官或组织。
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摘要
摘要
血管渗漏或血浆外渗具有多种成因，可能是炎症反应的严重后果或症状。本研究最终可能有助于揭示血浆外渗的成因，或发现新的抑制或治疗方法。研究人员必须具备适当的工具，包括目前可用的最佳方法，以研究血浆外渗。本文介绍了一种使用伊文思蓝染料法检测FVBN小鼠器官中血浆外渗的实验方案。该方案在尽可能的前提下设计得极为简便，但仍可提供高质量的数据。选择伊文思蓝染料的主要原因是其易于普通实验室操作使用。我们已利用该方案为以下假说提供了证据和支持：即酶内肽酶（neprilysin）可能保护血管系统免受血浆外渗的影响。然而，该方案在实验中可灵活调整，适用于其他品系的小鼠或其他物种，也可用于多种不同器官或组织的研究，探讨其他在理解、预防或治疗血浆外渗过程中具有重要意义的因素。本方案在现有方法基础上经过广泛优化和改进，兼具可靠性、操作简便性、经济性以及试剂与设备的普遍可获得性，使其成为普通实验室定量检测器官血浆外渗的优选方案。
引言
器官中的血管渗漏是指血液血浆通过器官内毛细血管后微静脉内皮细胞形成的间隙发生外渗的现象。这种血浆外渗或血管通透性增加可能由某种炎症反应引发，具有严重的后果。因此，研究并理解这一现象及其成因、调节因素和后果至关重要；同时，研究人员也需要具备可靠的研究工具和实验方案。内皮细胞间隙可由多种刺激产生，但通常是由肽类神经递质和/或速激肽作用于内皮细胞所致。在这一过程中，导致血浆外渗增加的主要天然介质之一是十一肽速激肽类神经肽——P 物质1。
已开发出利用伊文思蓝染料与白蛋白结合特性的方法，用于研究和测量血管通透性或血浆外渗，这些方法通常以其准确性、简便性、经济性、安全性以及可根据需要同时测定多种组织血浆外渗的能力而著称2,3,4,5,6,7,8,9。本方案在FVBN小鼠器官中评估血浆外渗时采用了上述优点，并加入了一些重要改进，使其更通用且适用于未来研究，尤其适合正在或计划开展与血浆外渗或血管通透性相关因素研究的普通实验室。在本方案中，以1 nmol/kg剂量向小鼠给予P物质，可使血浆外渗增加1.5倍。这提高了方案的灵敏度，使结果更易于观察和获取。其他影响通透性的因素，如其他多种肽类、化学物质或某些类型的毒性损伤，也可根据需要由其他实验室使用或研究。本方案采用颈静脉注射方式系统性地给予伊文思蓝和P物质，该操作需实施终末期手术。然而，尽管需考虑必要的终末期外科技术，颈静脉注射5,7,10相较于其他静脉注射方式（包括尾静脉注射4,9）更容易掌握，并能产生更一致的结果。尽管伊文思蓝可能通过眶后静脉窦注射给药，但文献中尚未发现采用此方法递送伊文思蓝的报道。至于尾静脉注射，其可重复掌握该技术所需的高程度专业技能和大量练习，极大地限制了其在成功实施伊文思蓝注射中的应用。相比之下，本方案所述的颈静脉注射替代方法提供了一种技术上更易实现的解决方案。在灌注伊文思蓝的小鼠被处死后立即进行静脉灌注是一项关键步骤，可清除过量的伊文思蓝染料，本方案已对此步骤进行了标准化。此前报道的灌注方法已被仔细审查并加以改进，以获得当前的操作流程。此处描述的其他改进措施均经过优化，操作简便且成本低廉。
伊文思蓝染料法存在一些重要局限性。例如，该方法有时灵敏度较低，可能妨碍对注射伊文思蓝动物的组织进行进一步的大体病理学和组织学检查。然而，这些及其他局限性促使了替代方法和模型的发展，而这些新方法和模型仍继续使用伊文思蓝。通过荧光光谱法（而非可见光光谱法）检测伊文思蓝可提高该方法的灵敏度。此外，已开发出伊文思蓝染色组织的荧光显微镜技术，以便更清晰地观察血管渗漏的具体位置 关键词：伊文思蓝染料法，血管渗漏，荧光光谱法，荧光显微镜，组织学检查，大体病理学11此外，对先前注射了伊文思蓝的活体动物进行全身成像和扫描12 可连续监测伊文思蓝浓度的变化，而非仅在实验预设的单一时间点进行检测。然而，该方法需要具备相应的成像设备，且成本可能较高。涉及伊文思蓝并在此基础上进行的改良方法 体外 模型类型，例如细胞培养模型或鸡胚尿囊膜模型13 （CAM）模型也已有描述。这些模型通过荧光和活体成像进行监测14 显微镜技术，并实现对血管通透性随时间变化的定量分析，但可能引发关于模型准确性的问题 体内 条件可能较为苛刻，且成本较高。
已有其他方法被开发用于测定和量化血管渗漏或通透性，这些方法无需使用伊文思蓝。这些方法可采用适当的荧光分子（如白蛋白或荧光素），或同位素标记或其他标记的分子，施用于活体动物（或细胞培养或绒毛尿囊膜（CAM）模型13，随后进行非侵入性成像（如PET扫描、MRI、活体显微成像、全身扫描）或侵入性成像（如荧光显微成像）3,12,15。尽管这些技术相较于其他伊文思蓝方法可能具有多种优势，但它们也存在一些缺点，可能包括操作复杂性高、需要专业技术、资源投入大以及高昂的经济成本。
有研究提示，中性内肽酶16（即肽酶NEP，也称为CD10、MME或脑啡肽酶）可能通过酶促代谢和灭活内源性P物质，在一定程度上参与抑制血浆外渗。因此，在细胞表面肽酶NEP表达的组织中，NEP的肽酶活性可能减弱P物质的作用。
最初，我们采用这种改良的伊文思蓝方法，利用FVBN野生型（WT）和NEP基因敲除（KO）小鼠检测P物质诱导的血浆外渗。从这些初步研究中推测，NEP可能参与了P物质增强的血浆外渗过程，本文描述了这些研究以及进一步探讨NEP在血浆外渗中作用的实验。然而，本论文的重点并非NEP或其在血浆外渗中的作用，而是血浆外渗实验本身。NEP相关结果代表了通过使用该改良方案可能获得的一类典型结果。用于测量血浆外渗的伊文思蓝方法已得到优化和改进，下文将针对FVBN小鼠详细描述该方法。
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方案
本研究中所述实验均遵循所有适用的国际、国家和/或机构关于动物（小鼠）护理与使用的指南。
本方法采用16至20周龄的FVBN成年小鼠，该年龄段被证明最适合本研究的目的。第1天包括步骤1至5，第2天包括步骤6至7（图1）。
1. 仪器设备准备
- 若使用氯胺酮/赛拉嗪作为麻醉剂（推荐方案），需准备充足的一次性无菌注射器和针头。若使用异氟烷作为麻醉剂，实验开始前应检查氧气瓶及异氟烷液体水平，确保实验所需物资充足。同时，组装鼻罩呼吸回路并连接至诱导箱；将新的活性炭罐连接至呼吸回路。打开氧气，调节至第二级压力表读数约为50 psi，以完成诱导箱的准备工作。
- 将加热垫调至37 °C。
- 为手术准备直肠温度探头。
2. 小鼠准备
该步骤包括麻醉、脱毛和体位固定（成年FVBN小鼠，年龄16至20周）。
- 称量小鼠并记录体重。
- 麻醉小鼠。
- 腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为 80 - 100 mg/kg 和 7.5 - 16 mg/kg）。然而，建议起始剂量采用较低水平的氯胺酮和赛拉嗪（分别约为 30 mg/kg 和 6 mg/kg）。
- 在整个手术过程中，以初始剂量的约 0.1 - 0.25 倍追加氯胺酮/赛拉嗪以维持麻醉。 本研究中选用氯胺酮和赛拉嗪作为麻醉剂，因其表现出更高的可重复性和存活率。其他研究中所选用的麻醉剂可能有所不同。 若使用异氟烷，先将小鼠置于诱导室中，开启异氟烷至 5%，直至小鼠完全失去意识。随后在整个手术其余过程中使用鼻罩维持 1.5 - 2.5% 的异氟烷。
- 每 2 - 3 分钟通过夹捏脚趾的方式监测小鼠，以评估麻醉深度是否合适。
- 剃除小鼠颈部腹侧区域的毛发。
- 将小鼠仰卧位放置于预热垫上，并用胶带将其四肢和足部固定在手术台面上。
- 在小鼠眼部涂抹人工泪液软膏，以防止手术期间眼睛干燥。
3. 手术细节
- 在右侧腹侧颈部颈静脉上方做一个1 cm的切口。
- 在切口区域滴加一至两滴利多卡因（1 - 2%），以缓解疼痛并促进血管扩张。等待2分钟，使利多卡因发挥作用。
- 通过钝性分离暴露并游离右侧颈内静脉。用4-0缝线结扎静脉，并用止血钳轻轻牵拉血管的头端。使用精细剪刀在结扎点下方约3 mm处（即尾侧方向），沿静脉直径约一半的位置剪一个小孔。
- Mark a 将PV-1聚乙烯导管从末端起1.5 cm处插入，并通过穿刺孔利用血管扩张器将其插入颈静脉，然后将导管沿血管向尾端推进约1.5 cm。
- 用4-0丝线将导管牢固结扎于血管尾侧部分（切口下方）。利用3.3步骤中用于结扎头侧颈静脉的缝线的游离端，将血管头侧部分结扎固定于导管外侧。
- 用4-0丝线将导管周围的皮肤 loosely 缝合，以帮助防止体温流失和组织干燥。
- 将导管连接至含有肝素化生理盐水（10 U/mL）的注射器，并冲洗导管。
4. 注射
- 通过颈静脉导管注射伊文思蓝溶液（50 μL 的 30 mg/mL 溶液，溶于 0.9% 生理盐水，未肝素化，或约 50 mg/kg），随后注入少量肝素化生理盐水以冲洗导管。
- 2 分钟后，注射 P 物质（100 μL 的 0.3 μM 溶液，溶于 0.9% 生理盐水，未肝素化，或 1 nmol/kg），随后同样用少量肝素化生理盐水冲洗导管。P 物质可增强血浆蛋白通过内皮层的外渗；在本实验方案中，其通常可使血浆外渗值增加约 1.5 倍，从而更便于测量血浆外渗水平。
- 在注射 P 物质后等待 18 分钟。在此期间，伊文思蓝染料将完成平衡并循环分布。
- 在注射 P 物质后 18 分钟（即注射伊文思蓝后 20 分钟）结束实验，通过颈椎脱臼法处死小鼠。由于小鼠在手术后可能仍处于良好麻醉状态，因此可能无需额外给予过量麻醉剂即可直接进行颈椎脱臼。然而，如有必要，可先给予过量的氯胺酮/赛拉嗪、异氟烷或戊巴比妥钠麻醉剂，再行颈椎脱臼。
5. 器官的分离
- 打开小鼠胸腔，并进行重力灌注（从约51 cm或20英寸高度）"用50 mL pH 3.5的50 mM柠檬酸钠溶液灌注心脏和血管。pH 3.5可能有助于维持伊文思蓝与白蛋白的结合。
- 用解剖刀切除1-5个相关器官（组织）例如 膀胱、肾脏、胃、肝脏、胰腺、近端或远端结肠、回肠、十二指肠、 flank 皮肤、耳朵、尾巴、心脏和/或肺），并清除任何残留内容物（如有）。
- 用室温（RT）磷酸盐缓冲液（PBS；1.44 g NaCl）冲洗器官2HPO4，0.24 克 KH2PO4、8.0 g NaCl 和 0.20 g KCl 溶于 1 L 水中，pH 7.4。
- 用滤纸吸干器官表面，将每个器官切成两半，称量每半部分的质量（湿重，单位为 g）。
- 将组织的一半置于铝箔上，在150 °C的干燥箱中干燥48 h。
- 将另一份组织样本放入含有固定体积（最多200 µL）甲酰胺的微量离心管中，孵育48小时（最长可达72小时），以提取伊文思蓝。
6. 组织光密度的测定
- 从微量离心管中取出 50 µL 经伊文思蓝染色的甲酰胺溶液（室温孵育 48 - 72 小时后），加入 96 孔聚苯乙烯板的一个孔中。注意避免将组织碎片随甲酰胺一同转移。
- 向 96 孔板的另外两个空孔中各加入 50 µL 新鲜的纯甲酰胺，作为空白对照。
- 使用吸光度酶标仪测定 96 孔板中每个孔的 OD620 值并记录。620 nm 是伊文思蓝的最大吸收波长。
7. 血浆外渗的计算
- 称量已在烘箱中干燥48小时的组织半块。
- 计算每只小鼠目标器官的湿重/干重比值，即用该组织半块的湿重（步骤5.4中获得）除以同一组织半块的干重（步骤7.1中获得）。
- 计算组织半块在甲酰胺中的干重（单位：g），即用该组织半块放入甲酰胺前的湿重（步骤5.4中获得）除以目标器官的湿重:干重比值（步骤7.2中计算得出）。
- 计算校正后的OD620值。以96孔板中每个实验孔的OD620值（含有来自各组织的伊文思蓝浸提甲酰胺溶液，步骤6.3中获得）为基础，从每个实验值中减去空白孔的OD620值（步骤6.2中制备的两个含纯甲酰胺孔的平均OD620值，其OD620值于步骤6.3中测得）。
- 通过将校正后的OD620值（步骤7.4中计算得出）除以组织半块在甲酰胺中的干重（步骤7.3中计算得出），计算血浆外渗值。血浆外渗的单位为OD620/g干重。
- 分析数据并以均值±标准误（SEM）表示。根据情况采用t检验或单因素方差分析及Scheffé多重比较 检验进行组间统计学比较（lycofs01.lycoming.edu）。
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结果
在图1中展示了该实验流程的示意图，该方法已被证实可从FVBN小鼠器官中获得最可靠且一致的P物质诱导的血浆外渗值。该流程通常需要两天的实验操作，中间至少间隔48小时。如果所有待比较的实验均保持一致，也可进一步延长操作间隔时间。例如，在第1天分离器官后，可将器官在液氮中速冻并保存于-80 °C；在仔细解冻器官（数天至一周内）后，可在继续后续步骤前用PBS洗涤并吸干。此外，尽管组织干燥步骤应按所述条件进行（150 °C下干燥48小时），但将组织半份在甲酰胺中提取伊文思蓝的时间可延长至48–72小时，前提是所有实验在甲酰胺中的提取时间保持一致。
图2 和 表1 显示了P物质诱导的FVBN野生型（WT）和中性内肽酶基因敲除（NEP KO）小鼠膀胱血浆外渗的数据17...
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讨论
如上所述，对血浆外渗的研究最终可能带来关于其成因的新认识，或发现抑制或治疗血浆外渗的新方法。本论文已成功验证了上述使用伊文思蓝染料的血浆外渗实验方案。尽管实验数据支持NEP可能保护血管系统免受血浆外渗这一假设，但目前这仅为次要目标，主要目标是提供一种优化后的实验方案，以便普通实验室能够方便地在今后的血浆外渗研究中直接采用。本文所报告的方案注重适应未来不同研究目标、动物种类、器官及其他实验条件的研究需求，尤其具有优势的是，该方案操作简便、结果可靠、经济实惠，并充分考虑了常规实验材料、试剂和合格实验人员的普遍可及性。然而需要注意的是，为获得具有统计学意义的结果，每组动物需要进行相当数量的重复实验（建议8至12次重复）。
已有大量研究和报告详细描述了测量血管通透性和血浆外渗的各种尝试。迄今为止，大多数报告所涉及的方法均为伊文思蓝染料法的变体，用于研究血浆外渗和血管通透性2,3,6,...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Andy Poczobutt和Jori Leszczynski博士对本文稿提供的宝贵帮助和修改意见。 本研究得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI RO1 HL078929、PPG HL014985 和 RO3 HL095439）以及退伍军人事务部（Merit Review）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Vet One | 200-070 | 吸入麻醉剂 |
| 氯胺酮 | Vet One | 200-055 | 可注射麻醉剂 |
| 赛拉嗪 | Lloyd Laboratories | 139-236 | 可注射麻醉剂 |
| 注射器（10,3 &和 1 cc） | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| 针头（20G1，23G1） && 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| 异氟烷诱导室 | VetEquip | 941443 | 1 升 |
| 鼻锥式呼吸回路 | VetEquip | RC2 | 啮齿类动物神经环路控制器 2 |
| 氧气瓶 | Airgas | UN 1072 | 100% 医用 |
| 加热垫 | CWE 公司 | TC-1000 | 温度控制器 |
| 直肠温度探头 | CWE 公司 | 10-09012 | 小鼠 |
| 平衡（用于啮齿类动物） | Ohaus | CS 2000 | |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 15000-00 | Vannas弹簧剪，3毫米直刃（用于切割血管） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11151-10 | Graefe超细镊子（用于分离小鼠血管） |
| 手术器械-止血钳 | 精细科学工具 | 13009-12 | 哈尔斯泰德-蚊式止血钳（钝头解剖，用于夹持组织） |
| 手术工具 - 缝合驱动器 | 精细科学工具 | 12502-12 | Olsen-Hegar 持针器（缝合） |
| 手术器械-镊子 | 精细科学工具 | 11627-12 | 阿德森-布朗鳄嘴钳（用于组织抓取缝合，大鼠） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14110-15 | 梅奥粗剪刀 15 厘米（外科、解剖、骨骼、大鼠） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 18025-10 | 缝合打结钳（用于Millar导管） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14078-10 | Lexer 婴儿直剪（手术用，小鼠） |
| 手术工具-镊子 | 精细科学工具 | 11254-20 | Dumont #5 细尖镊子（大鼠血管，解剖） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14082-09 | 12毫米解剖剪（手术用，大鼠小鼠） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11051-10 | 10 cm 格雷夫镊子（组织抓取，大鼠小鼠） |
| 手术器械-镊子 | 精细科学工具 | 11251-35 | Dumont 5/45 镊子（血管导入用） |
| 外科手术器械—牵开器 | 精细科学工具 | 17012-11 | Weitlaner拉钩 2/3齿（大鼠外科用） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11294-00 | Dumont #4 镊子（用于大鼠、小鼠的血管分离） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11297-00 | Dumont #7 镊子（用于组织抓取与解剖） |
| 手术器械-剪刀 | 精细科学工具 | 14058-11 | 坚韧剪刀（小鼠解剖，骨骼） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11009-13 | 锯齿状、弯曲的Semken镊子（用于抓取组织，小鼠、大鼠） |
| 手术器械-止血钳 | 精细科学工具 | 13003-10 | 哈特曼弯止血钳（钝性分离，夹持组织） |
| 手术器械—镊子 | 精细科学工具 | 11006-12 | Adson 带齿镊（用于夹持组织） |
| 剪毛器 | Oster | A5 | |
| 胶带 | Fisherbrand | 159015G | |
| 人工泪液软膏 | Akorn公司 | 13985-600-03 | |
| 利多卡因 | Hospira | 0409-4277-01 | 2% 注射用 |
| 聚乙烯导管 | Tygon | PV-1 | |
| 伊文思蓝 | Sigma Aldrich | E2129 | |
| P 物质 | Bachem | H-1890 | |
| 肝素 | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| 生理盐水 | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% 氯化钠 |
| 苯巴比妥 | Vortech | 0298-9373-68 | |
| 柠檬酸钠 | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| 用于吸印的Kimwipes纸巾 | Fisher Scientific | 06-666A | |
| 甲酰胺 | Sigma Aldrich | 47670 | |
| 微量天平 | 丹佛仪器 | APX-60 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| 聚苯乙烯96孔板 | Becton Dickinson | 351172 | |
| 吸光度酶标仪 | BioTek | Synergy 2 | |
| 聚丙烯酰胺凝胶 | Bio-Rad | 3450014 | |
| 蛋白质分子量标准品 | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran 支持型硝酸纤维素膜 | Amersham (GE) | 10600015 | |
| 凝胶电泳槽 | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-1 | |
| 初级NEP多克隆抗体 | R & D Systems | AF1182 | |
| 强力霉素饲料 | Teklad（HARLAN） | TD.130750 | |
| FVB/NJ野生型小鼠 | Jackson | 001800 | |
| 二抗（山羊抗兔） | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL溶液-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| 薄膜 | 皮尔斯 | 34091 |
参考文献
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