胰腺胰岛与小鼠分离的简单高效协议

摘要

此胰岛分离方案描述了胶原酶注射以消化外分子组织的新途径，以及从小鼠中纯化胰岛的简化梯度程序。它涉及酶消化，梯度分离/纯化，和小岛手工采摘。成功的隔离可以产生250~350个高质量和全功能的小岛每只鼠标。

摘要

胰腺胰岛，也称为兰格汉斯岛，是一组内分泌细胞，产生用于葡萄糖调节和其他重要生物功能的激素。胰岛主要由五种类型的激素分泌细胞组成:β细胞分泌胰高血糖素，β细胞分泌胰岛素，β细胞分泌生长激素，β细胞分泌ghrelin，PP细胞分泌胰腺多肽。胰岛中60%至80%的细胞是β细胞，这是研究胰岛素分泌的最重要细胞群。胰腺胰岛是研究体外胰岛素分泌的重要模型系统。获得高质量的胰岛对糖尿病研究具有重要意义。大多数小岛分离程序需要技术上难以进入胶原酶注射部位、苛刻和复杂的消化程序以及多个密度梯度纯化步骤。本文采用一种简单的高产小鼠胰岛隔离方法，具有详细的描述和真实的演示，显示了以下具体步骤:1）在Vater的ampulla注射胶原酶P，一个连接胰腺导管的小区域，常见的胆管，2）酶消化和机械分离的外分子胰腺，和3）单梯度纯化步骤。这种方法的优点是使用更易访问的 Vater ampulla 注射消化酶，使用酶和机械方法的组合进行更完整的消化，以及更简单的单梯度纯化步骤。该协议每只鼠标产生大约 250-350 个小岛;和小岛适合各种活体研究。此过程的可能警告是由于酶消化和/或长时间的梯度孵育而可能损坏的小岛，所有这些可以通过仔细说明孵育时间来避免。

引言

文献中有两种常见的胰岛隔离方法。一个要求切除胰腺，并用手术剪刀切成小块，然后消化在胶原酶溶液1，2，3。另一种更精确的方法是使用胰腺中的导管网络来引入消化酶。以下部位已用于消化酶注射:胆汁和囊性导管的结点，胆囊进入普通胆管，或普通胆管本身1，4，5。众所周知，胰岛在胰腺中分布不均匀;脾功能区域包含最多的胰岛6。虽然第二种方法使用解剖途径提供消化酶允许更完整的灌注胰腺，包括脾科区域，但此过程通常需要夹紧或缝合从技术上讲的 Vater 的 ampulla挑战。在胰岛纯化方面，使用多密度梯度以及细胞滤网和磁缩器来纯化胰岛3、7。这些梯度的利用可能非常耗时，而菲科尔梯度可能导致小^岛8的毒性损伤。

目前的协议是建立在李等人^描述的方法之上的，根据^{我们自己和其他人}的经验，增加了额外的修改。我们协议最关键的步骤是夹紧靠近肝端的普通胆管，通过Vater的ampulla注射胶原酶P来消化外分明组织，然后用摇动的水浴以机械方式加速消化1^{。 4，7}.随后，应用"STOP"溶液抑制胰岛的进一步消化;HBSS 用于洗掉剩余的胶原酶 P 和 STOP 溶液。当Ficoll方法用于纯化人类胰岛时，据报道，与使用Percoll^梯度9相比，具有更大功能能力（例如胰岛素分泌）的胰岛的产量是两倍。然而，研究已经质疑使用菲科尔梯度，由于其毒性作用的小岛1，10。据介绍，Histopaque梯度为小鼠胰岛隔离提供了最佳的纯化动力学，具有更简单的步骤和^{更低的成本，}可产生高质量的胰岛的良好产量。在我们的协议中，Histopaque-1077用于从其他残余组织8，11中纯化胰岛。收获的小岛可以在完整的RPMI-1640培养基培养，或直接用于RNA/蛋白质定量。

我们的协议，使用胶原酶P消化和单梯度纯化步骤的组合，比其他已公布的协议更简单。我们的方法不需要苛刻的外科手术，只有几个简单的步骤。更重要的是，正如我们报道^的12中那样，该协议始终能产生高质量的功能胰岛（250-350/鼠标）的良好产量。

方案

此处描述的所有方法均已获得得克萨斯 A&M 大学动物护理和使用委员会 （ACUC） 的批准。所需手术工具如图1所示，手术原理图如图2所示。

1. 解决方案

1. 通过将 100 mL 的 10X HBSS（从库存）添加到 900 mL 的蒸馏水，使 1 L HBSS （1X）
2. 准备停止溶液（必须新鲜，应在1小时内使用），将50 mL的100X胎儿牛血清（FBS）加入450 mL的冰冷1X HBSS;这使得 500 mL 停止解决方案。将停止溶液保持在 4°C。
3. 通过在冰冷的1X HBSS中加入1mg/mL胶原酶P，制备胶原酶P溶液（必须在使用后1小时内新鲜）;使用 6 mL/鼠标。
   1. 在胶原酶P溶液中加入0.05%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）（这为分离的小岛提供营养）。例如，在6 mL胶原酶P溶液中使用3毫克BSA。保持冰上。
   2. 在一个 50 mL 管中计算并准备所有小鼠所需的胶原酶 P 量。
4. 通过增加 10% FBS 来准备完整的 RPMI 1640 介质， 100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素，INS-1 细胞补充剂（10 mM HEPES，2 mM L-谷氨酰胺，1 mM 丙酸钠和 0.05 mM 2-汞醇）至 500 mL RPMI 1640 介质，含有 5.5 mM 葡萄糖，需使用用于隔夜培养和孵化。

2. 准备

1. 填充三个 50 mL 管 25 mL RNase 抑制溶液、70% 乙醇或蒸馏 H₂O。这些解决方案将用于手术前和手术期间的清洁。
2. 在启动协议之前，将RNase抑制溶液中工具的提示浸泡30分钟;这消除了工具上任何潜在的 RNase。
3. 预切吸收垫至 6 in x 6 大小，用于手术期间使用。
4. 提前准备 1X HBSS 溶液，并储存在 4°C 下。在手术前准备停止溶液。储存在4°C。
5. 在手术前立即制备胶原酶P溶液，并储存在冰上。
   注:应在准备后 2 小时内使用。
6. 标签50 mL管消化和纯化;为每只小鼠准备2管，一个用于消化，另一管用于小岛纯化。确保动物 ID 位于两个管上。
7. 将3 mL胶原酶P溶液加入前50 mL管中。剩余的3 mL胶原酶P将被注射。
8. 将剩余的3 mL胶原酶溶液放入3mL注射器中，针头安装30 G 1/2。将注射器放在冰上。

3. 程序

1. 从RNase抑制溶液中取出所有工具，然后先用70%乙醇将其浸入管中，然后在含有蒸馏H₂O的管中，然后在干净的纸巾上风干。
2. 将鼠标放入含有 0.5 mL 的子胶室，直到小鼠被深度麻醉。
3. 将鼠标从腔室中取出，用钳子捏一脚垫，检查麻醉状态。深度麻醉是基于观察，呼吸变得稳步缓慢，小鼠对脚捏没有反应。确认小鼠已深度麻醉后，用宫颈脱位对小鼠实施安乐死，然后将鼠标放在吸水垫上。
   1. 将麻醉小鼠放在其胃上，对颈部施加压力，并通过拉尾巴使脊柱脱离大脑。
4. 将小鼠的四肢贴在吸水垫上，用70%乙醇喷洒身体，并清除多余的乙醇。
5. 使用盖玻璃钳和弯曲的手术剪刀，使切口。首先在腹部区域（±3厘米）的皮肤上做一个水平切口，拉开皮肤以暴露腹壁。然后在腹部腹膜上做一个垂直切口（+3⁄4cm），以完全暴露腹腔中的胰腺（图3）。
6. 推动肝脏的叶优暴露胆管，它会显示为淡粉色管（图3）。
7. 小心地将肠道从腹腔的右腰椎间盘/胆管区域移到右侧，露出胆管和肝动脉（图3）。
8. 使用施瓦茨微血清（图1）尽可能靠近肝脏小心地夹紧普通胆管。
9. 识别 Vater 的安拉，它位于十二指肠教皇处，由胰腺导管和普通胆管的结合组成。在解剖显微镜下观察时，Vater 的 ampulla 出现肿胀，这是普通胆管的入口点（图4）。
   注:调整解剖显微镜的光的强度/角度可以更容易地定位。
10. 将装有3 mL胶原酶P溶液的注射器插入Vater的安拉。将针头推入管道中，约1/4的常用胆管（ampulla引线进入管道）的长度，如图5所示。
11. 一旦针在ampulla中，确保针的方向与导管平行。
12. 用微Adson钳夹住针头，防止其刺穿导管（图5）。
13. 缓慢而稳定地将3 mL的胶原酶P溶液从注射器注射到普通胆管中（足以感觉到阻力），如图6所示。 目标是产生回流压力，迫使胶原酶进入胰腺导管。如果胰腺的头部、颈部、身体和尾部区域都完全膨胀，则认为注射是成功的。
    注:如果胰腺未完全充气，或脾面积未完全膨胀，胰岛产量将较低。脾面积包含最多的胰岛6。膨胀可以通过胰腺组织之间充满溶液的开放空间的出现来证实。
14. 仔细解剖膨胀的胰腺，并将其放入含有3 mL的冰冷胶原酶P溶液的50 mL消化管中。
    1. 使用 2 钳子（弯曲和微腺） 去除胰腺;参见图1）:（从脾脏开始，将胰腺从脾脏中拉出，然后继续从胃和十二指肠中取出。
       注:无需切口。
    2. 使用精细手术剪刀将胰腺切成3⁄5s，在消化管中用3mL的冰冷胶原酶P溶液（图7A）。
15. 将管子固定在 37°C 水浴的机架上，并在 100~120 rpm 转速下摇动约 12-13 分钟。
16. 孵育后，用手轻轻摇动管以破坏组织，直到胶原酶P消化溶液变得均匀（图7B）。胰腺细颗粒的沙状外观证实了同质性。约30s温柔的握手通常就足够了。将管子保持至光，检查组织是否很好地均匀化;如果需要，摇动另一个 ±15 s。
17. 一旦消化，立即将管子放在冰上，加入40 mL的冰冷停止溶液，以终止酶消化。
    注:此时，如果对多只小鼠进行锻炼，消化管可以在冰上长达 2 小时。
18. 在 300 x g的摇杆离心机中将管离心 30 s（离心机的温度是灵活的）。
    注:使用摆动桶离心机，使组织颗粒形成在50 mL管的底部，而不是管壁上;这对提高小岛产量至关重要。
19. 使用 STOP 溶液再进行 2 次离心并重复离心，每次旋转后将溶液递解。每次后续清洗时，使用 20 mL 的 STOP 溶液。
    1. 每次旋转前，在 20 mL STOP 溶液中轻轻摇动 50 mL 管中的组织颗粒，破坏颗粒。
20. 用40 mL的冰冷HBSS重新悬浮组织颗粒，在300 x g下用离心机30s。
21. 使用带有 HBSS 溶液的回转桶离心机再进行两次离心和重复离心，每次旋转后将溶液倒转。每次洗涤时使用 20 mL 的 HBSS。
    1. 每次旋转前，通过轻轻摇动含有 20 mL HBSS 溶液的管，破坏颗粒，将其从管底部分离。
22. 最后一次离心后，删除所有哈佛商学院。
23. 然后向包含颗粒的 50 mL 管中加入 5 mL 的室温密度梯度。低速短暂涡旋，直到均质化。
24. 在 50 mL 管中再添加 5 mL 的室温密度梯度。不要涡旋/混合。
    注:保持稳定和保持平稳至关重要，以便在不中断的情况下形成更好的渐变。
25. 移液器10 mL的室温HBSS缓冲液进入管（包含密度梯度），滴滴轻轻地和缓慢，让梯度形成。使用带 10 mL 移液器的移液器喷枪，以添加 HBSS 滴落。
26. 使用回旋桶离心机，在1700 x g下旋转管15分钟。确保将加速/减速的速度更改为最低设置，以保持梯度（图7C）。
27. 旋转后，小心地拆下管，不要干扰梯度。使用预湿的移液枪与冷 HBSS（移液器 HBSS 上下），移液器在密度梯度和 HBSS 之间形成的胰岛层 （5-10 mL） 进入新的 50 mL 胰岛收集管。
    注意:在移液胰岛之前用冷 HBSS 将移液器弄湿，以防止小岛粘在移液器的内壁上，这很有帮助。
    1. 如果分离不完整，胰岛在密度梯度层中可见，移液器将整个 10 mL 的密度梯度（底层）与在界面上形成的胰岛层一起移移（仅留下大约 8~10 mL 的 HBSS 顶层）。
       注: 收集小岛层和密度梯度层（底层）可能会导致碎片的收集，从而延长小岛拾取时间，但不会更改其他步骤。当小岛层形成良好时，不需要收集这两个层。
28. 将 20 mL 的冷冷 HBSS 添加到含有胰岛的新 50 mL 管中，然后在 350 x g的摇杆离心机中 3 分钟进行离心机。
29. 旋转后，小心移液器（不要滴管）出上清液（在底部留下±3 mL），而不会干扰底部含有胰岛的颗粒。丢弃上清液。
30. 重复洗涤和离心至少3次。每次加入 20 mL 的 HBSS，并确保在每次旋转前暂停颗粒。
31. 使用前，将 RPMI-1640 完整介质瓶加热到 37°C 的水浴中。上次离心后，取出所有HBSS，并在颗粒中加入4 mL先前准备的完整RPMI-1640介质（含有FBS、INS-1细胞补充剂和青霉素/链霉素）。
32. 通过轻轻旋转管，并立即将 RPMI-1640 介质倒入 100 mm 培养皿中，将颗粒移开。再向管子中加入 5 mL 的 RPMI-1640 介质，轻轻旋转，将其洗掉任何剩余的小岛，然后将介质倒入同一个培养皿中。
    1. 在解剖显微镜下，使用 20 μL 移液器从培养皿中挑选健康的胰岛，并将其放入包含 10 mL 完整 RPMI 1640 介质的新培养皿中。在解剖显微镜下观察时，胰岛应呈现球形/长方形和金黄色，表面光滑，与相对透明、细小的外骨组织相比。
       注:解剖显微镜的放大倍数通常设定为12.5~16倍。岛产量会因各种因素而异，包括小鼠的应变、年龄和性别。此协议通常产生 250-350 个健康的胰岛从健康的 C57BL/6J 小鼠年龄 4- 10 个月大。
33. 在37°C的无菌培养箱中孵育胰岛，在5%CO₂输注和95%加湿空气中孵育过夜，以进行第二天的实验，或冻结胰岛，以便稍后进行所需的分析。
    1. 一旦胰岛被冷冻，它们不能用于分泌测定，只能进行RNA或蛋白质定量。要收集细胞进行冷冻，将其放入HBSS缓冲液中，收集所有胰岛在200~500μL的缓冲液中，转移到1.5 mL管，离心350×g1⁄2分钟，去除上清液不超过30~40μL溶液，置于-20°C进行短期储存（ 几天）或-80°C长期储存。

结果

正确完成这个程序需要一些了解在腹腔的小鼠解剖。这允许正确识别 Vater 的安拉和夹紧公共胆管。整个过程通常需要 1⁄2 小时。同时从4-6只小鼠中分离胰岛更为有效，因此可以将多个样品离心在一起。胰岛采摘的时间因胰岛数量和消化效率而异;从 1 只鼠标中选取 250-350 个小岛可能需要大约一个小时。

本文包括一些非常逼真的图像:图3显示了小鼠的腹腔，暴露了常见的胆管和肝动脉。图 4显示了普通胆管的整个长度（看起来是较浅的颜色），以及 Vater 的 ampulla，在胰腺和十二指肠之间的关头（将插入针头）附近更大、更亮。在普通胆管和肝动脉束靠近肝脏处夹，以阻止胶原酶P流入肝脏。未能正确或足够紧地夹紧胆管会导致胰腺泄漏和不完全灌注。图 5显示了插入普通胆管的 Vater 的 ampulla 的针。一旦针在共管中，钳子用于稳定针头，以防止它在注射时刺穿导管。一旦注射开始，胰腺将开始从近端膨胀到远端;在胶原酶...

讨论

该协议包括胶原酶灌注和消化，然后是胰岛纯化。该协议最关键的步骤是有效的注射和完全灌注胰腺1，4，7。该协议的传递方法允许酶穿过解剖途径，以更好地消化胰^岛1周围的外分子组织。此外，该技术非常适合完全消化脾功能区域，其中胰岛浓度^{最高，为4，6。}该协议，具有良好的消化时间和精心执行的纯化步骤，可以产生250-350个健康的胰岛。从该协议中分离出来的小岛已经成功地用于研究葡萄糖刺激胰岛素分泌体前12。根据我们的经验，胰岛素分泌在高葡萄糖刺激（22.2 mM）下增加4倍，而基线（3.3 mMM）在5.5m M含葡萄糖RPMI-1640完整培养基过夜后增加4倍。长期孵育（2~7天）小岛的生存能力/功能尚未测试。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 注射器	BD	309657	Hoding 胶原酶 P
盖玻片镊子	VWR	82027-396	固定小鼠皮肤以辅助切口手术
弯曲镊子	Sigma-Aldrich	Z168696	在胰腺切除期间固定组织
异氟醚	Piramal	B13B16A	手术前麻醉小鼠
100 毫米培养皿	VWR	30-2041	用于胰岛培养
30 G. ½ 英寸针	BD	305106	用于渗透瓦特壶腹以输送胶原酶 P - 使用这种量规是因为它非常适合大多数 CBD 50
毫升管	VWR	89039-658	容纳消化的胰腺组织、胶原酶 P 和纯化的胰岛
带防水防潮层的吸水垫	VWR	82020-845	从手术过程中吸收血液
5810R 带摆动桶和减速能力	Eppendorf	5811FJ478114	用于组织沉淀，在锥形管底部形成沉淀 - 需要摆动桶离心机。此外，减速功能对于形成渐变层也很重要。
胶原酶 P- 1g	罗氏诊断	11249002001	用于消化胰腺外分泌
弯曲手术剪刀	Fisher-Scientific	13-804-21	用于切割开放小鼠腹部
解剖显微镜	奥林巴斯	SZX16	用于识别关键解剖结构，以准确将胶原酶输送到胰腺
中 Hank's 平衡盐溶液 10x	康宁	20-023-CV	洗涤细胞
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	用于梯度形成
光源	Leeds	LR92240	提高显微镜的可见度
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	用于去除 RNase
RPMI-1640 培养基，不含 L-谷氨酰胺	康宁	15-040-CV	培养胰岛
Schwartz micro serrefines （Microvascular clamp）	精细科学工具	18052-01	夹紧胆总管和肝动脉
摇动水浴	Boekel/Grant	8R0534008	对外分泌组织的机械消化很重要
小型手术剪刀	VWR	82027-578	切割到胰腺的组织