检测单突触连接 果蝇 利用河豚毒素抗性钠通道

摘要

本文介绍了一种利用河豚毒素和河豚毒素抗性钠通道NaChBac来检测神经元之间单突触连接的方法。

摘要

本文应用了一种名为河豚毒素抗性工程化探测突触连接（Tetrodotoxin Engineered Resistance for Probing Synapses, TERPS）的新技术，用于检测目标神经元之间的单突触连接。该方法依赖于在特定的突触前神经元中共同表达一种转基因激活因子和对河豚毒素（TTX）具有抗性的钠通道 NaChBac。通过在 TTX 存在条件下进行全细胞记录，可识别出与假定的突触后伙伴之间的连接，TTX 能够阻断未表达 NaChBac 的神经元中的电活动。该方法可经改造后结合任意激活因子或钙成像作为连接的报告系统。TERPS 拓展了可用于解析神经网络内连接关系的工具集。然而，TERPS 的独特之处在于，它还能可靠地报告体液传递（bulk 或 volume transmission）以及溢出传递（spillover transmission）。

引言

神经科学的一个主要目标是绘制神经元之间的连接图谱，以理解信息在神经回路中的传递方式。目前已有多种方法和资源可用于在多种模式系统中检测神经元之间的功能连接性^1,2。为了利用电生理学技术生成最精确的连接图谱，关键在于确定所观察到的两个细胞之间的连接是直接的单突触连接，还是间接的多突触连接。在哺乳动物神经元中区分这两者的金标准是测量突触前细胞中单个动作电位与第二个神经元中兴奋性突触后电流（EPSCs）起始之间的时间延迟。单突触连接应具有几毫秒的短潜伏期且变异性较低³。然而，在无脊椎动物神经元中，这种方法可能更为复杂，因为突触可能位于远离胞体记录位点的树突上，导致突触后电导与记录电极之间存在较长的电紧张距离，从而造成检测延迟。此类延迟可能引发对多突触与单突触贡献的判断模糊。此外，微弱的突触事件可能在到达胞体记录位点之前就已衰减，而增强突触前活动则可能诱发多突触事件。

已开发出多种技术用于检测无脊椎动物中的单突触连接。其中一种方法使用高二价阳离子溶液（Hi-Di），其中含有过量的 Mg⁺⁺ 和 Ca⁺⁺。该溶液通过降低递质释放概率并提高动作电位阈值，从而抑制多突触通路，有利于单突触输入的检测^4,5。然而，确定所需的精确 Mg⁺⁺ 与 Ca⁺⁺ 比例并非易事，即使在适度刺激下，仍可能存在多突触成分的干扰⁶。另一种称为“突触伙伴间绿色荧光蛋白重构”（GRASP）的方法，则利用突触处突触前膜与突触后膜之间的紧密邻近关系来推断单突触连接的存在⁷。在此方法中，绿色荧光蛋白（GFP）的一部分在某一神经元中表达，而该分子的互补片段则在假定的突触后伙伴神经元中表达。若出现荧光信号，则表明这两个神经元之间的距离足够接近，能够使GFP分子重构，从而提示存在突触连接。然而，当两个细胞的膜紧密相邻时（例如在神经或神经束中），GRASP可能出现假阳性结果。GRASP的改进版本通过将GFP的突触前片段直接锚定至突触小泡蛋白（synaptobrevin），使得GFP仅在活性突触部位才能重构，从而消除此类假阳性信号⁸。尽管GRASP及其变体在揭示果蝇（Drosophila）中枢神经系统功能连接方面发挥了重要作用，但若突触前与突触后细胞之间的距离相对较大，则某些连接可能无法被GRASP检测到。这一局限性在研究与神经调质作用相关的容积传递⁹或GABA能抑制¹⁰时尤为突出。

本文展示了一种互补且新颖的技术，用于检测果蝇（Drosophila）中枢神经系统中的直接单突触连接。该方法被称为“利用河豚毒素抗性工程探测突触”（Tetrodotoxin Engineered Resistance for Probing Synapses, TERPS），其原理是在突触前细胞中共同表达对河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）具有抗性的钠通道NaChBac和一种光遗传学激活因子，同时记录假定的突触后细胞的反应⁹。在TTX存在的情况下，除表达NaChBac的细胞外，所有其他细胞的动作电位介导的活动均被抑制。NaChBac通道可选择性地恢复目标突触前细胞的兴奋性，从而实现光诱导的突触传递。该方法能够强烈激活突触前神经元，使得通过胞体记录可在突触后清晰地检测到连接信号，同时降低多突触环路被激活的可能性。尤为重要的是，该技术可用于研究体积性传递（volume transmission），揭示单个神经元释放的神经递质在整个神经环路中的扩散情况。此外，TERPS还可结合传统药理学手段揭示突触连接的化学性质。TERPS适用于任何能够实现TTX不敏感钠通道转基因表达的模式系统。

方案

1. 准备果蝇并鉴定GAL4启动子品系

1. 选择一个GAL4启动子品系，并将其与携带UAS-NaChBac转基因和一种用于激活的光遗传学转基因的果蝇进行杂交。
   注意：UAS-CsChrimson¹¹ 由于其高电导性以及激活NaChBac介导的动作电位的便捷性，因而被选用。UAS-NaChBac和UAS-CsChrimson均可从Bloomington Stocks Repository获得。
2. 将全反式视黄醛溶于乙醇中配制成35 mM的储备液，并于-20℃冰箱中保存 °C.
3. 混合 28 µ将该储备液 L 加入约 5 mL 复水的马铃薯片培养基中，并将此混合物加至常规小瓶的顶部 果蝇 培养基
4. 将表达 csChrimson 的成年果蝇置于含有 0.2 mM 全反式视黄醛的食物中饲养 1–3 天¹¹.

2. 准备河豚毒素（TTX）储备液

1. 用蒸馏水或去离子水配制 1 mM 的河豚毒素（TTX）储备液。将该溶液储存于实验室冰箱中，可保存数月。请查阅所在机构关于 TTX 储存的相关规定，因为许多机构将 TTX 划分为危险品或管制物质。

3. 为电生理实验准备果蝇

1. 收集饲喂含全反式视黄醛食物的1–3日龄成年果蝇。
   注：有关膜片钳技术的详细描述，请参阅2013年Murthy和Turner的研究文献。 果蝇 神经元^12,13.
2. 将果蝇放入玻璃闪烁瓶中。将瓶子置于冰上1分钟，以使果蝇 immobilize（固定）。
3. 使用粗镊子将一只果蝇放入定制的记录室。该记录室由一个3 ½" 从1/16英寸材料中圆形激光切割" 丙烯酸酯。切割一个 ¾" 孔位于中心，通过双组分环氧树脂将定制的金属箔固定在该位置。金属箔上有一个三角形的小孔，用于插入果蝇。
4. 在动物周围涂抹石蜡或紫外光固化环氧树脂，以将其牢固固定在记录室中。
5. 使用鹅颈式光纤在体视显微镜下对样本进行照明以便观察。通过调节鹅颈光纤的位置，使其从侧面斜向照射果蝇，实现斜射照明。
6. 将光照强度调节至能够清晰观察果蝇的最低水平。该光照强度在不同实验间可能有所差异。
   注意：本方案可通过使用体内或体外的诱导系统进行调整 原位脑 器官培养法¹⁴.
7. 获取外部记录用灌流液。该灌流液（单位：mM）包含：103 NaCl、3 KCl、5 N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸、8 海藻糖、10 葡萄糖、26 NaHCO₃₃, 1 NaH₂PO₄，1.5 CaCl₂，以及 4 MgCl₂ （调整至270–275 mΩ）。生理盐水用95% O₂₂/5% CO₂₂ （碳合气体）且 pH 值调节至 7.3¹⁵.
8. 在果蝇制备样本上滴加4-6滴细胞外记录用生理盐水。此时，提高解剖显微镜的光照强度以获得更清晰的视野。
9. 使用电解法 sharpen 一根钨丝。制备该钨丝时，先配制饱和 KNO₃ 溶液。₃ 施加约20 V的交流电流，同时将钨丝尖端浸入溶液中20次，每次100 ms，直至尖端变尖锐。使用 sharpened 钨丝去除果蝇头部的角质层，从而暴露其脑组织。
10. 通过移除环绕脑部的气管和脂肪体进一步暴露脑组织。若需接触触角叶，可使用弯曲的钨丝或类似工具将触角轻轻拨至箔制记录室下方，以增加视野可见度。使用尖头镊子轻轻撕除记录区域表面覆盖的胶质鞘膜。
11. 将记录室转移至电生理装置上。立即开始灌流经碳合气饱和的外部记录液，以维持脑组织活性。将灌流液储液瓶置于显微镜载物台上方，利用重力将液体输送至标本。使用真空管路和2 L锥形瓶收集废液。

4. 获得全细胞记录

1. 使用商用移液管拉制仪制备膜片电极。参考仪器说明书设置参数，以获得尖端电阻接近 7 mΩ 的合适电极。
2. 向膜片电极中加入 4 µL 胞内记录液。胞内灌注液成分（单位：mM）为 140 钾天冬氨酸盐、10 HEPES、4 MgATP、0.5 Na₃GTP、1 EGTA 和 1 KCl。
3. 设置膜片钳放大器以进行全细胞记录。将放大器的偏移调零，并设置放大器输出测试脉冲。此处使用 AM Systems 公司的 2400 型膜片钳放大器。
4. 通过电极施加正压并接近细胞。使用显微操作器引导电极接触细胞，随后释放正压。将膜电位钳制在 -60 mV。当保持电流降至亚皮安水平时，表明电极与细胞膜之间已形成吉欧姆封接。
   注意：若采用 GFP 引导的细胞靶向方法，应尽量减少落射荧光照明的使用，以避免激活 ChR2 并可能导致突触抑制。此外，在执行步骤 5 前应等待数分钟。
5. 将放大器设置为从 -50 mV 到 -60 mV 输出测试脉冲。此设置为膜片钳放大器的标准配置。测试脉冲将显示一个较大的电容性瞬变，代表为充电膜片电极所需的电流。通过调节 AM 2400 或类似放大器上的电容补偿旋钮，消除电容性瞬变。
6. 施加短暂的负压脉冲以击穿细胞膜，获得全细胞构型。
   注意：当电容性瞬变显著增大，反映出神经元电容时，表明已建立全细胞构型。通常还可观察到保持电流（基线）小幅上升。将放大器切换至电流钳模式，并调节细胞电位至 -50 至 -60 mV。

5. 检测突触连接性

1. 配置数据采集（DAQ）系统，以触发光驱动器产生光脉冲。此处使用 National Instruments 的 DAQ 系统与 Matlab 向光驱动器输出模拟信号。通过该模拟信号调节 LED 的光强。所用 LED 的波长为 620–630 nm。
2. 将高功率红光 LED 直接置于样本下方。调节光强，使照射到果蝇的光强达到 0.238 mW/mm²。
3. 在记录目标突触后细胞的同时激活突触前神经元。可通过光遗传学、药理遗传学或神经刺激实现细胞激活。此处使用 csChrimson 并施加短暂的红光脉冲。
   注意：突触连接可在电流钳模式下以兴奋性突触后电位（EPSP）或在电压钳模式下以兴奋性突触后电流（EPSC）进行监测。在施加河豚毒素（TTX）前，应对 40 ms 的光脉冲产生可见的突触连接反应。若未观察到连接，则这些神经元之间很可能不存在单突触或多个突触的连接。可根据需要调整钳制电位，以突出兴奋性或抑制性连接。
4. 若在正常生理盐水中观察到连接，则向灌流系统中加入 TTX，使其终浓度达到 1 µM。使用循环泵收集并重复利用生理盐水，以节约 TTX。蠕动泵将从浴槽中吸取盐水溶液并回流至盐水储液罐。
5. 调节泵速，以提供稳定而较强的负压，防止浴槽内盐水液面波动。
   注意：施加 TTX 后，应导致全细胞记录中被监测神经元的动作电位活动停止。这表明盐水中已加入足量的 TTX。
6. 再次施加短暂的红光脉冲（每次脉冲持续 40 ms）。此时，任何仍存在的突触连接很可能为单突触连接。向循环盐水中添加药理学拮抗剂，以检测在 TTX 存在下仍保留的突触连接的化学性质。
   注意：当结合使用光遗传学与神经元荧光标记时，在尝试建立记录期间，应避免持续激活突触前神经元群体。这可能导致突触衰减，从而难以观察到连接。由于 csChrimson 的激发光谱较宽，广泛延伸至绿色荧光蛋白的激发范围，因此可使用红色荧光蛋白标记神经元，并使用通道视紫红质2（Ch2R）激活细胞群体。此方法需要特定的遗传背景和定制的滤光片组。为获得合适的果蝇品系，需构建在 LexA 或 Q 系统二元表达系统下表达红色荧光蛋白（RFP 或 mCherry）的果蝇，并将其与表达 Gal4 启动子以及 UAS-Ch2R 和 UAS-NaChBac 效应基因的果蝇进行杂交。用于落射荧光的最优滤光片组应具有窄带激发滤光片，以激发红色荧光蛋白但不激发 Ch2R；此外，滤光片组应包含长通发射滤光片，以尽可能收集发射光。我们使用了 Chroma 公司的定制滤光片组，包含型号 et580/25x 和 t600lpxr（来自 49306 系列），并搭配 et610lp 障碍/发射滤光片。

结果

TERPS 用于区分神经元之间突触连接的单突触与多突触成分。虽然对细胞进行弱刺激可用于检测直接连接，但增强突触前活动通常会招募到多突触连接（图 1A）。TERPS 通过共表达对河豚毒素（TTX）不敏感的钠通道 NaChBac 和一种光遗传学激活剂，并在 TTX 存在下检测连接，从而消除多突触连接的影响（图 1B）。TTX 能有效阻断果蝇（Drosophila）脑中的动作电位，因此非常适合用于 TERPS 实验（图 2A）。转基因表达 NaChBac 钠通道可恢复神经元的兴奋性，并产生显著的平台电位（图 2B）。

嗅觉刺激下，触角叶中的局部中间神经元（LN）表现出强烈的反应（

讨论

TERPS 分析通过实现对已鉴定神经元之间突触的检测，补充了当前用于神经回路解析的技术。具体而言，该方法利用河豚毒素（TTX）广泛抑制动作电位，同时在特定神经元群体中表达对 TTX 不敏感的钠离子通道 NaChBac 以恢复其兴奋性，从而揭示单突触连接。通过光遗传学刺激诱发突触释放，同时采用全细胞记录监测突触后事件。与 GRASP 等其他方法相比，TERPS 的优势在于能够检测远距离诱导的体液传递或容积传递，并可进行药理学干预。该技术操作相对简便，仅需一个记录电极和一个用于光遗传学刺激的光源，相较于同时在突触前和突触后成分上进行双全细胞记录更为可行。TERPS 的基本要求是所研究系统中的动作电位可被 TTX 有效阻断。但由于 TTX 可作用于广泛分类群的神经元，因此 TERPS 很可能广泛适用于哺乳动物和无脊椎动物模型系统。

TERPS 可通过多种方式轻松改造，以促进对假定的突触前群体的刺激，或便于记录突触后靶细胞。此处使用了光遗传学工具来刺激靶向细胞群体，但也可通过多种其他机制实现激活。例如，在研究来自触角神经的感觉轴突传递时，对感觉轴突进行神经刺激是常规操作。 果蝇

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
UAS-csChrimson	布卢明顿果蝇品系中心	55135	用作神经激活剂
UAS-NaChBac	布卢明顿果蝇品系中心	9466	在河豚毒素（TTX）存在下恢复细胞的兴奋性
河豚毒素	Tochris	1078	购买TTX可能需要特殊许可，因为其属于管制物质
全反式视黄醛	Sigma-Aldrich 全反式视黄醛	R2500	通道视紫红质需要辅因子
可焊接321不锈钢 表格， 0.002" 厚的， 10" 宽视野	McMaster Carr	3254K7	用于制作定制的果蝇固定装置。可根据提供的 PDF 文件在 pololu.com 进行定制箔片的激光切割。
解剖显微镜	蔡司	Stemi 2000-C	用于制备的解剖
石蜡	Almore	Eectra Waxer 66000	解剖过程中用于将果蝇固定在锡箔上
石蜡	Joann	4917217	与蜡化器联用
5号镊子	精细科学工具	#5CO	用于解剖和去鞘
解剖剪	精细科学工具	15001-08	用于在解剖过程中去除部分角质层
钨丝	A-M Systems	797500	结合电解法用于制备解剖用的尖锐针头
循环式蠕动泵	Simply Pumps（亚马逊）	PM200S	用于TTX的循环
蠕动泵速度控制器	Zitrades（亚马逊）	N/A	LED灯或灯带PWM调光控制器，12伏8安，可调亮度开关调光器，直流12V 8A 96W，适用于LED灯带
Versa-Mount 精密压缩空气调压器	McMaster Carr	1804T1	贴附过程中施加正压
玻璃毛细管	世界精密仪器公司	TW150F-3	用于膜片钳电极
多功能测量仪	McMaster Carr	3846K431	压力调节器量规
电生理学相机	Dage MTI	IR-1000	任何能在红外范围（850 nm）工作的相机均可使用。请勿使用红光照明，因为这可能激活csChrimson。
红外LED	Thorlabs	M850F2	用于斜照明
用于红外LED的光纤	Thorlabs	M89L01	与红外发光二极管（IR LED）耦合
物镜	奥林巴斯 40X	LUMPlanFLN	这可用于大多数显微镜，并且在可视化果蝇神经元方面效果良好。
琥珀色LED	Thorlabs	M590L3d	用于 RFP 和 mCherry 的可视化
蓝色LED	Thorlabs	M470L3d	用于观察 GFP
GFP滤光片组	Chroma	49011	用于观察GFP或刺激ChR2（channelrhodopsin-2）
定制 mCherry 滤光片组	Chroma	et580/25x 和 t600lpxr（来自 49306 套件），但配有 et610lp 激发/发射滤光片	仅在希望对已鉴定的神经元使用 channel2rhodopsin 进行膜片钳记录时使用
用于合并琥珀色与蓝色 LED 的二向色镜	Thorlabs	DMLP550R	仅在 mCherry 下使用膜片钳，并用蓝光激发 channel2rhodopsin。
红光LED	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	用于驱动 csChrimson
LED驱动器	LEDSupply	3021-D-E-1000	用于驱动发光二极管以进行光遗传学刺激
显微操作仪	Sutter Instruments	MP-225	用于在记录过程中定位移液管
膜片钳放大器	A-M Systems	Model 2400	等效的放大器是合适的
贝塞尔滤波器	华纳仪器	LPF 202A	用于膜片钳记录期间过滤电流信号至示波器的辅助滤波器。
数据采集系统	国家仪器	NI PCIe-6321       781044-01	用于将数据从放大器记录到计算机
连接器模块 - BNC端子 BNC-2090A	国家仪器公司	779556-01	用于连接放大器与数据采集卡。
钢箔	McMaster Carr	3254K7	用于定制记录室的钢箔
磁铁	K&&J Magnetics	D42	将记录室固定到铁架台上
1/16" 细胞培养用丙烯酸透明板	Pololu		用于制作定制记录室。可使用提供的PDF文件在pololu.com进行亚克力激光切割。