利用5-溴尿苷标记与免疫沉淀法研究RNA合成

摘要

该方法可用于测量RNA合成。将5-溴尿苷加入细胞中，并掺入新合成的RNA。通过标记后立即提取RNA，随后对标记的RNA进行针对5-溴尿苷的免疫沉淀，并通过逆转录和定量聚合酶链式反应分析，从而测定RNA合成水平。

摘要

当比较两种条件下RNA的稳态水平时，无法区分其变化是由RNA的生成改变还是降解改变所引起的。本实验方案描述了一种通过5-溴尿苷（5-Bromouridine）标记RNA并结合免疫沉淀技术来测量RNA生成水平的方法，该方法可用于研究短时间内（例如，1小时）新合成的RNA。与使用α-鹅膏蕈碱和放线菌素D等具有毒性的转录抑制剂相比，5-溴尿苷标记结合免疫沉淀的优势在于其在短期使用中对细胞活力几乎没有或仅有极低的影响。然而，由于5-溴尿苷免疫沉淀仅能捕获标记时间段内新生成的RNA，因此该方法在检测生成速度较慢或降解速度较快的RNA时可能存在困难。通过5-溴尿苷免疫沉淀所获得的标记RNA，可进一步用于逆转录、定量聚合酶链式反应以及高通量测序分析。该方法适用于所有类型的RNA研究，并不仅限于本示例中所展示的mRNA检测。

引言

5-溴尿苷（BrU）免疫沉淀（IP）可用于研究细胞中的RNA合成，且在短暂的标记期间对细胞生理的影响极小或几乎没有^1,2。该方法基于将合成的尿苷衍生物BrU掺入新合成的RNA中，随后利用抗BrU抗体对标记的RNA进行免疫沉淀（图1）。

几十年来人们已经知道，蛋白质合成可受到转录水平的调控，且50多年前就已提出转录因子的存在³。如今已知，多种疾病是由转录过程和RNA稳定性的失调所致（参见参考文献⁴中的补充图S1），而检测RNA生成变化的能力对于理解疾病发展具有重要意义。

另一方面，调控RNA生成的工具为治疗因蛋白质表达过少或过多，或蛋白质异常积聚（如帕金森病（PD））引起的疾病提供了新的可能性。在PD中，主要以不溶性聚集体形式积聚的蛋白质是α-突触核蛋白，其表达水平与疾病直接相关，因为α-突触核蛋白基因的重复突变可导致家族性帕金森病⁵。此外，α-突触核蛋白的聚集具有浓度依赖性。因此，下调α-突触核蛋白mRNA水平是一种具有吸引力的治疗策略，已有研究通过RNA干扰技术成功降低PD啮齿类动物模型中的神经元细胞丢....

方案

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行，并将缓冲液置于冰上或冰箱中（含SDS的洗脱缓冲液除外）。本方案分为5个部分：RNA样本的制备；IP用磁珠的制备；BrU标记RNA与磁珠的结合；通过三步酚-酚/氯仿-氯仿抽提法洗脱并纯化结合的BrU标记RNA；RNA分析（本示例采用RT-qPCR）

1. RNA 样本的制备

1. 使用自动细胞计数器计数HEK293T细胞，并将3,500,000个细胞接种至10 cm培养皿中，加入10 mL生长培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和50 µg/mL青霉素/链霉素），以确保48小时后提取时获得总量>40 µg的RNA。将细胞维持在37 °C、5% CO₂条件下培养。
2. 接种48小时后，吸除8 mL生长培养基，保留2 mL以避免细胞干燥。将2 mM BrU及所需处理因素加入已吸出的8 mL生长培养基中，随后移除细胞上残留的2 mL培养基，并将含BrU的8 mL培养基重新加入。在向细胞中添加BrU时，避免使用新鲜培养基，因其可能诱导基因表达的改变。
3. 将细胞在含BrU及处理因素的培养基中孵育1小时。用5 mL Hank's缓冲液洗涤细胞，再加入2 mL 0.05%胰蛋白酶进行消化。加入8 mL生长培养基终止反应，将细胞转移至15 mL离心管中，在1,000 × g条件下离心2分钟以收集细胞。
4. 弃去上清液，使用RNA提取试剂盒（见

结果

我们最初在 AsPC-1 细胞中测试了 BrU 标记时间。细胞分别用 BrU 处理 0、1、2 和 4.5 小时，随后提取总 RNA 并进行 BrU-IP。在 BrU-IP 获得的 RNA 中检测 GAS5 和 GAPDH，结果显示，与背景值（0 小时）相比，GAPDH 和 GAS5 分别达到约 9 倍和 44 倍的变化，表明 1 小时标记已足够。

BrU-IP 及上述分析方法被用于探究 Polo 样激酶 2（PLK-2）抑制后观察到的 α-突触核蛋白 mRNA 稳态水平变化是否由 mRNA 合成变化所致¹选择1 h的标记时间，是因为与背景相比，该时间可提供足够的标记效果（图2）同时也使处理时间得以发挥作用。2 mM BrU处理在1小时或较长的4小时处理中，均未诱导HEK293T细胞产生任何形态学变化（图.......

讨论

本方案描述了使用BrU-IP方法测定RNA生成的过程：通过BrU标记新合成的RNA 1小时，随后立即提取RNA并进行BrU标记RNA的免疫沉淀。该方法此前已在参考文献¹⁶中描述，本文在此基础上增加了一些额外步骤以提高免疫沉淀的特异性和RNA纯度，包括使用低浓度BrU预处理磁珠，以及在免疫沉淀后增加苯酚-氯仿纯化步骤以提高RNA纯度。此外，我们还提供了数据，通过比较从BrU处理和未用BrU处理的细胞中捕获的RNA，展示BrU-IP方法的特异性。苯酚-氯仿纯化成本较低，但考虑到BrU标记的RNA量较少，下游分析中若使用RNA纯化试剂盒可能获得更强的信号。然而，我们的经验表明，采用苯酚-氯仿纯化法可在不同样本间实现最均一的RNA提取效果。

与总RNA水平分析相比，BrU标记和免疫沉淀（IP）能够探究稳态RNA水平变化的潜在原因。该方法对细胞生理的影响很小或几乎没有，而转录抑制剂（如α-鹅膏蕈碱和放线菌素D）则具有较明显的影响。已有研究提出，通过比较新合成的RNA与稳态水平，可用来计算RNA降解速率¹⁷

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
核糖锁RNase抑制剂	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 羊抗小鼠IgG磁珠	Life Technologies	11202D
α-溴脱氧尿苷小鼠抗体	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		紫外-可见分光光度法
水饱和酚，pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
High Pure RNA提取试剂盒	Roche	11828665001
高容量cDNA反转录试剂盒	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR预混液
Taqman RNA探针	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	荧光探针
7500 Fast实时荧光定量PCR系统	Applied Biosystems
HEK293T细胞系	ATCC
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Lonza	BE12-604F
胎牛血清	Biochrom	S0115
青霉素/链霉素	Biochrom	A2213
汉克缓冲液			5.3 mM KCl，0.44 mM KH2PO4，0.2 mM Na2HPO4 和 136.8 mM NaCl，pH 6.77，经高压灭菌处理。
DEPC-H2O			0.1%焦碳酸二乙酯处理的H2O
2xBrU-IP缓冲液			含40 mM Tris-HCl（pH 7.5）和500 mM NaCl的DEPC H2O溶液
2xBrU-IP+BSA/RNase抑制剂			在2xBrU-IP缓冲液中添加1 μg/μL BSA和80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL肝素			将2xBrU-IP缓冲液用DEPC-H2O按1:1稀释，并添加1 mg/mL肝素
1xBrU-IP			将2xBrU-IP缓冲液用DEPC-H2O按1:1稀释，并添加0.5 μg/μL BSA和20 U/mL Ribolock
洗脱缓冲液			含0.1% SDS的无RNase水溶液