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利用5-溴尿苷标记与免疫沉淀法研究RNA合成

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DOI：

10.3791/57056

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2018年5月3日

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1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

本文内容

摘要

该方法可用于测量RNA合成。将5-溴尿苷加入细胞中，并掺入新合成的RNA。通过标记后立即提取RNA，随后对标记的RNA进行针对5-溴尿苷的免疫沉淀，并通过逆转录和定量聚合酶链式反应分析，从而测定RNA合成水平。

摘要

当比较两种条件下RNA的稳态水平时，无法区分其变化是由RNA的生成改变还是降解改变所引起的。本实验方案描述了一种通过5-溴尿苷（5-Bromouridine）标记RNA并结合免疫沉淀技术来测量RNA生成水平的方法，该方法可用于研究短时间内（例如，1小时）新合成的RNA。与使用α-鹅膏蕈碱和放线菌素D等具有毒性的转录抑制剂相比，5-溴尿苷标记结合免疫沉淀的优势在于其在短期使用中对细胞活力几乎没有或仅有极低的影响。然而，由于5-溴尿苷免疫沉淀仅能捕获标记时间段内新生成的RNA，因此该方法在检测生成速度较慢或降解速度较快的RNA时可能存在困难。通过5-溴尿苷免疫沉淀所获得的标记RNA，可进一步用于逆转录、定量聚合酶链式反应以及高通量测序分析。该方法适用于所有类型的RNA研究，并不仅限于本示例中所展示的mRNA检测。

引言

5-溴尿苷（BrU）免疫沉淀（IP）可用于研究细胞中的RNA合成，且在短暂的标记期间对细胞生理的影响极小或几乎没有1,2。该方法基于将合成的尿苷衍生物BrU掺入新合成的RNA中，随后利用抗BrU抗体对标记的RNA进行免疫沉淀（图1）。

几十年来人们已经知道，蛋白质合成可受到转录水平的调控，且50多年前就已提出转录因子的存在3。如今已知，多种疾病是由转录过程和RNA稳定性的失调所致（参见参考文献4中的补充图S1），而检测RNA生成变化的能力对于理解疾病发展具有重要意义。

另一方面，调控RNA生成的工具为治疗因蛋白质表达过少或过多，或蛋白质异常积聚（如帕金森病（PD））引起的疾病提供了新的可能性。在PD中，主要以不溶性聚集体形式积聚的蛋白质是α-突触核蛋白，其表达水平与疾病直接相关，因为α-突触核蛋白基因的重复突变可导致家族性帕金森病5。此外，α-突触核蛋白的聚集具有浓度依赖性。因此，下调α-突触核蛋白mRNA水平是一种具有吸引力的治疗策略，已有研究通过RNA干扰技术成功降低PD啮齿类动物模型中的神经元细胞丢失6,7。

能够测量疾病或治疗干预所引起的RNA生成变化至关重要。目前用于检测RNA稳态水平的先进技术，例如逆转录后接定量聚合酶链反应（RT-qPCR），无法区分这些变化是源于转录调控还是RNA稳定性改变所致。一种广泛用于研究RNA降解速率的方法是使用α-鹅膏蕈碱或放线菌素D等化合物阻断转录机制，随后检测RNA的衰减情况。然而，对细胞内转录过程进行整体抑制存在一些问题，例如可能诱导细胞凋亡8,9。除了细胞毒性效应外，转录抑制剂还存在若干技术性问题，例如α-鹅膏蕈碱的细胞摄取速度较慢，以及放线菌素D缺乏特异性（详见参考文献10中的综述）。

为了避免整体转录受阻，已使用核苷酸类似物，例如5-乙炔基尿苷（5-EU）、4-硫代尿苷（4-TU）和溴尿苷（BrU）。这些类似物可被哺乳动物细胞快速摄取并掺入新合成的RNA中，从而实现特定时间范围内RNA的脉冲标记。BrU的毒性低于5-EU和4-TU，因此是首选的核苷酸类似物11,12。

BrU-IP 可用于研究 RNA 合成速率和稳定性，从而区分总 RNA 变化背后的潜在原因。本文将重点介绍 RNA 合成的测定，并参见参考文献2 有关RNA稳定性研究的详细信息，请参见。为研究RNA合成，细胞用BrU进行短时间标记 例如 孵育1小时，随后进行BrU-IP1 (图1C）。这使得能够测量在短时间标记期间合成的RNA，与通过RT-qPCR检测总RNA的变化相比，所观察到的变化能更准确地反映RNA合成的调控情况。然而需要指出的是，即使标记时间仅为1小时，RNA的降解仍可能对所检测到的RNA水平产生影响。

BrU-IP 实验获得的 RNA 可用于 RT-qPCR1 或高通量测序2,13 的下游分析。其他标准的 RNA 检测方法，如 Northern 印迹或核糖核酸酶保护实验，也可能适用于某些 RNA 的检测。

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方案

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行，并将缓冲液置于冰上或冰箱中（含SDS的洗脱缓冲液除外）。本方案分为5个部分：RNA样本的制备；IP用磁珠的制备；BrU标记RNA与磁珠的结合；通过三步酚-酚/氯仿-氯仿抽提法洗脱并纯化结合的BrU标记RNA；RNA分析（本示例采用RT-qPCR）

1. RNA 样本的制备

  1. 使用自动细胞计数器计数HEK293T细胞，并将3,500,000个细胞接种至10 cm培养皿中，加入10 mL生长培养基（DMEM培养基，含10%胎牛血清和50 µg/mL青霉素/链霉素），以确保48小时后提取时获得总量>40 µg的RNA。将细胞维持在37 °C、5% CO2条件下培养。
  2. 接种48小时后，吸除8 mL生长培养基，保留2 mL以避免细胞干燥。将2 mM BrU及所需处理因素加入已吸出的8 mL生长培养基中，随后移除细胞上残留的2 mL培养基，并将含BrU的8 mL培养基重新加入。在向细胞中添加BrU时，避免使用新鲜培养基，因其可能诱导基因表达的改变。
  3. 将细胞在含BrU及处理因素的培养基中孵育1小时。用5 mL Hank's缓冲液洗涤细胞，再加入2 mL 0.05%胰蛋白酶进行消化。加入8 mL生长培养基终止反应，将细胞转移至15 mL离心管中，在1,000 × g条件下离心2分钟以收集细胞。
  4. 弃去上清液，使用RNA提取试剂盒（见材料表）或其他常用方法从细胞沉淀中提取总RNA，并用无RNase的H2O洗脱。提取后的RNA可储存于-80 °C，待后续实验时使用。

2. 免疫沉淀珠的制备

  1. 根据待检测样本数量，另加一个额外样本量，以补偿移液和涡旋混合过程中的损失，分批准备磁珠。通过涡旋充分重悬抗小鼠IgG磁珠，并在无RNase的1.5 mL离心管中每样本取20 µL磁珠。将1.5 mL离心管置于磁力架上，静置约20秒，使磁珠吸附至管壁一侧。
  2. 吸除上清液，从磁力架上取出离心管，用移液器加入400 µL 1× BrU-IP缓冲液重悬磁珠。在台式离心机中短暂离心2秒，重新放回磁力架，吸除上清液。重复洗涤一次。
  3. 使用肝素封闭磁珠上的非特异性结合位点。将磁珠重悬于1 mL 1× BrU-IP + 1 mg/mL肝素缓冲液中，旋转孵育30分钟。按步骤2.2的方法洗涤磁珠一次。
    注意：肝素是一种带负电荷的聚合物，可与RNA竞争结合位点。若下游应用非测序实验，也可使用tRNA或其他无关RNA替代。
  4. 将磁珠重悬于1 mL 1× BrU-IP缓冲液中，并按每样本加入1.25 µg抗α-溴脱氧尿苷抗体（该抗体亦可识别BrU）。旋转孵育1小时，或室温孵育过夜。
  5. 按步骤2.2的方法洗涤磁珠三次。将磁珠重悬于每样本50 µL 1× BrU-IP缓冲液（含1 mM BrU），旋转孵育30分钟，以降低磁珠上抗体的结合灵敏度，从而减少免疫沉淀过程中的非特异性结合风险。
  6. 按步骤2.2的方法洗涤磁珠三次，并将磁珠重悬于每样本50 µL 1× BrU-IP缓冲液中。

3. BrU标记RNA与磁珠的结合

  1. 使用紫外-可见分光光度法测定步骤 1.3 中提取的 RNA 样品的浓度，并将每个样品中的 40 µg RNA 用无 RNase 的 H2O 稀释至终体积为 200 µL。
  2. 将 RNA 样品在 80 °C 下加热 2 分钟以变性 RNA，随后在台式离心机中短暂离心。向每个样品中加入 200 µL 2x BrU-IP+BSA/RNase 抑制剂。
  3. 向每个样品中加入步骤 2.6 中重悬并制备好的 50 µL 磁珠，旋转孵育 1 小时。按照步骤 2.2 的方法洗涤磁珠四次。

4. 通过三步苯酚-苯酚/氯仿-氯仿抽提法洗脱并纯化 RNA

  1. 洗脱 RNA 并进行苯酚抽提
    1. 用 200 µL 洗脱缓冲液重悬磁珠以洗脱 RNA，随后立即加入 200 µL pH 6.6 的苯酚（注意：有毒，参见第 4.1.2 步下方说明），以去除样品中非 RNA 分子。
    2. 涡旋混匀样品，在台式离心机中以 25,000 × g 离心 3 分钟。
      注意：苯酚有毒，应在通风橱内操作并佩戴皮肤防护装备。略微酸性的 pH 值可确保仅提取 RNA 而非 DNA。由于电荷的亲水性，RNA 将保留在上层水相中；而蛋白质的疏水核心会结合苯酚并进入下层有机苯酚相。
  2. 进行苯酚-氯仿抽提
    1. 尽可能吸取上层水相（约 200 µL 中的 190 µL，具体体积取决于操作经验），转移至含有 200 µL pH 6.6 苯酚/氯仿（注意：有毒，参见说明）的离心管中。确保各样品间吸取体积一致。
    2. 涡旋混匀样品，在 25,000 × g 条件下离心 3 分钟。
      注意：氯仿有毒，应在通风橱内操作并佩戴皮肤防护装备。加入氯仿可去除苯酚，因为苯酚可能通过抑制逆转录14和聚合酶链式反应15而影响后续 RNA 分析。
  3. 如前所述，吸取水相上层（现约 180 µL），转移至含有 200 µL 氯仿的离心管中。涡旋混匀样品，在 25,000 × g 条件下离心 3 分钟。
  4. 如前所述吸取上层水相（现约 170 µL），转移至含有 17 µL（1/10 体积）3 M CH3COONa（pH 6.0）的离心管中。为中和并从水溶液中沉淀 RNA，加入 2 µL 甘油（20 mg/mL），其将与 RNA 共同沉淀，使 RNA 沉淀更易观察。
  5. 加入 500 µL 96% 乙醇，以增强盐离子与 RNA 之间的结合，通过反复倒置离心管数次进行混匀。将离心管置于 -20 °C 过夜或置于干冰中 15 分钟。
  6. 在 25,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟。弃去上清液，注意勿扰动沉淀，用 185 µL 75% 乙醇洗涤沉淀以去除残留盐分。在 25,000 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。
  7. 彻底弃去上清液，勿扰动沉淀，将沉淀在开盖条件下干燥 5–10 分钟。加入 10 µL 无 RNase 的 H2O，沿管壁加入以避免扰动沉淀，重悬 RNA。

5. RNA 分析

  1. 使用cDNA反转录试剂盒（参见材料表）或其他首选方法，以2 µL RNA样品和1 µg酵母总RNA作为载体RNA进行cDNA合成反应（若cDNA用于下一代测序，则无需使用载体RNA）。对应输入样本的cDNA制备应使用1 µg RNA，不添加酵母RNA。
  2. 将cDNA按1:25稀释，取9 µL稀释后的cDNA与10 µL qPCR预混液及1 µL荧光探针混合，qPCR预混液和荧光探针均见材料表。
    注意：cDNA的稀释倍数取决于所采用的cDNA制备方法和qPCR方法。
  3. 运行以下qPCR程序（例如，在7500 Fast实时荧光定量PCR系统或同等仪器上）：50 °C下2 min，95 °C下20 s，随后进行40个循环（每个循环为95 °C下3 s和60 °C下30 s）。

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结果

我们最初在 AsPC-1 细胞中测试了 BrU 标记时间。细胞分别用 BrU 处理 0、1、2 和 4.5 小时，随后提取总 RNA 并进行 BrU-IP。在 BrU-IP 获得的 RNA 中检测了 GAS5 和 GAPDH 的水平，结果显示，与背景值（0 小时）相比，GAPDH 和 GAS5 分别达到约 9 倍和 44 倍的变化，表明 1 小时标记已足够。

BrU-IP 及上述分析方法被用于探究在稳态水平中发现的变化是否 αPLK-2 抑制后 α-突触核蛋白 mRNA 的变化是由mRNA合成改变引起的1. 选择1小时的标记时间是因为与背景相比，该时间可提供足够的标记效果（图2）并允许处理时间发挥作用。2 mM BrU处理在1小时或较长的4小时处理中均未引起HEK293T细胞的任何形态学变化（图...

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讨论

本方案描述了使用BrU-IP方法测定RNA生成的过程：通过BrU标记新合成的RNA 1小时，随后立即提取RNA并进行BrU标记RNA的免疫沉淀。该方法此前已在参考文献16中描述，本文在此基础上增加了一些额外步骤以提高免疫沉淀的特异性和RNA纯度，包括使用低浓度BrU预处理磁珠，以及在免疫沉淀后增加苯酚-氯仿纯化步骤以提高RNA纯度。此外，我们还提供了数据，通过比较从BrU处理和未用BrU处理的细胞中捕获的RNA，展示BrU-IP方法的特异性。苯酚-氯仿纯化成本较低，但考虑到BrU标记的RNA量较少，下游分析中若使用RNA纯化试剂盒可能获得更强的信号。然而，我们的经验表明，采用苯酚-氯仿纯化法可在不同样本间实现最均一的RNA提取效果。

与总RNA水平分析相比，BrU标记和免疫沉淀（IP）能够探究稳态RNA水平变化的潜在原因。该方法对细胞生理的影响很小或几乎没有，而转录抑制剂（如α-鹅膏蕈碱和放线菌素D）则具有较明显的影响。已有研究提出，通过比较新合成的RNA与稳态水平，可用来计算RNA降解速率17

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了伦德贝克基金会、奥胡斯大学、Dandrite 以及灵北制药公司的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
核糖锁RNase抑制剂ThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 羊抗小鼠IgG磁珠Life Technologies11202D
α-溴脱氧尿苷小鼠抗体BD Bioscience555627
Nanodrop 1000Thermo Fisher紫外-可见分光光度法
水饱和酚，pH 6.6ThermoFisherAM9712
酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，pH 6.6ThermoFisherAM9732
High Pure RNA提取试剂盒Roche11828665001
高容量cDNA反转录试剂盒ThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR预混液
Taqman RNA探针ThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1荧光探针
7500 Fast实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems
HEK293T细胞系ATCC
杜尔贝科改良伊格尔培养基LonzaBE12-604F
胎牛血清BiochromS0115
青霉素/链霉素BiochromA2213
汉克缓冲液5.3 mM KCl，0.44 mM KH2PO4，0.2 mM Na2HPO4 和 136.8 mM NaCl，pH 6.77，经高压灭菌处理。
DEPC-H2O0.1%焦碳酸二乙酯处理的H2O
2xBrU-IP缓冲液含40 mM Tris-HCl（pH 7.5）和500 mM NaCl的DEPC H2O溶液
2xBrU-IP+BSA/RNase抑制剂在2xBrU-IP缓冲液中添加1 μg/μL BSA和80 U/mL Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/mL肝素将2xBrU-IP缓冲液用DEPC-H2O按1:1稀释，并添加1 mg/mL肝素
1xBrU-IP将2xBrU-IP缓冲液用DEPC-H2O按1:1稀释，并添加0.5 μg/μL BSA和20 U/mL Ribolock
洗脱缓冲液含0.1% SDS的无RNase水溶液

参考文献

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标签

RNA RNA HEK293T RNA IP RNA

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