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一种简便的定点乙酰化蛋白质制备方案 大肠杆菌

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DOI：

10.3791/57061

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2017年12月9日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

本文内容

摘要

遗传密码子扩展是一种研究多种生物过程（包括蛋白质乙酰化）的强大工具。本文展示了一种简便的实验方案，利用该技术在大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中实现特定位点的均一乙酰化蛋白质生成。

摘要

发生在蛋白质特定位置的翻译后修饰已被证明在多种细胞过程中发挥重要作用。其中，可逆的赖氨酸乙酰化是生命所有领域中分布最广泛的修饰之一。尽管已开展了大量基于质谱的乙酰化蛋白质组学研究，但对这些假定乙酰化靶点的进一步表征仍受到限制。一个可能的原因是，大多数经典的生物化学方法难以在目标位置生成完全乙酰化的蛋白质。为克服这一挑战，研究人员应用了遗传密码子扩展技术，利用工程化的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶变体及其来自Methanosarcinaceae科物种的配对tRNA，实现将乙酰赖氨酸在翻译过程中定点插入目标蛋白质的特定位点。该方法最初应用于组蛋白乙酰化研究后，已推动了多种蛋白质乙酰化机制的研究。在本研究中，我们展示了一种利用模式细菌Escherichia coli作为宿主，制备位点特异性乙酰化蛋白质的简便方案。本研究以苹果酸脱氢酶作为示范实例。

引言

蛋白质的翻译后修饰（PTMs）发生在翻译过程之后，由功能基团共价添加到氨基酸残基上而形成，在几乎所有生物学过程中都发挥着重要作用，包括基因转录、应激反应、细胞分化和代谢1,2,3。迄今为止，已鉴定出约400种不同的翻译后修饰4。蛋白质PTMs极大地增加了基因组和蛋白质组的复杂性，因为它们能够调控蛋白质的活性和定位，并影响其与其他分子（如蛋白质、核酸、脂质和辅因子）之间的相互作用5。

在过去二十年中，蛋白质乙酰化一直处于翻译后修饰（PTMs）研究的前沿6,7,8,9,10,11,12。赖氨酸乙酰化最早于50多年前在组蛋白中被发现13,14，此后得到了深入研究，目前已知存在于80多种转录因子、调控因子及各类蛋白质中15,16,17。关于蛋白质乙酰化的研究不仅加深了我们对其调控机制的理解，也为多种因乙酰化功能失调所致疾病的治疗提供了指导18,19,20,21,22,23。人们曾认为赖氨酸乙酰化仅发生于真核生物中，但近年来的研究表明，蛋白质乙酰化在细菌生理过程中也发挥着关键作用，包括趋化性、耐酸性、致病岛的激活与稳定以及其他毒力相关蛋白的调控24,25,26,27,28,29。

一种常用于生化表征赖氨酸乙酰化的方法是位点定向诱变。由于谷氨酰胺与乙酰化赖氨酸在大小和极性上相似，因此被用作乙酰赖氨酸的模拟物。精氨酸则被用作非乙酰化赖氨酸的模拟物，因为它在生理条件下能保持正电荷，但不能被乙酰化。然而，这两种模拟物并非真正的等排体，也不总能产生预期的结果30。最严谨的方法是在特定赖氨酸残基上生成均一乙酰化的蛋白质，但由于天然状态下赖氨酸乙酰化的化学计量比极低，大多数经典方法难以甚至无法实现这一目标7,11。这一难题已通过遗传密码子扩展策略得以解决，该策略利用来自Methanosarcinaceae科物种的工程化吡咯赖氨酰-tRNA合成酶变体，将乙酰赖氨酸加载到tRNAPyl上，借助宿主的翻译机制抑制mRNA中的UAG终止密码子，并引导乙酰赖氨酸插入目标蛋白的指定位置31。最近，我们通过优化EF-Tu结合型tRNA32和升级乙酰赖氨酰-tRNA合成酶33，进一步改进了该系统。此外，我们已将这一增强的插入系统应用于苹果酸脱氢酶34和酪氨酰-tRNA合成酶35的乙酰化研究中。本文中，我们以我们深入研究过的示范性实例苹果酸脱氢酶（MDH）为例，展示从分子克隆到生化鉴定的全流程，用于制备完全乙酰化的蛋白质。

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方案

1. 目标基因的定点突变

注意：MDH 在 pCDF-1 载体中由 T7 启动子驱动表达，该载体含有 CloDF13 复制起点，拷贝数为 20 至 4034。

  1. 根据定点突变试剂盒的说明，使用引物在基因的第140位引入琥珀终止密码子（正向引物：GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG；反向引物：GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC）。
  2. 以含有野生型苹果酸脱水酶基因的模板质粒进行扩增，并通过聚合酶链式反应（PCR）插入终止密码子突变。反应体系中包含：12.5 µL 2X DNA聚合酶酶混合液、1.25 µL 10 µM 正向引物、1.25 µL 10 µM 反向引物、1 µL 模板DNA（20 ng/µL）（含野生型MDH基因的pCDF-1质粒）以及9 µL无核酸酶水。
    1. PCR反应参数如下：98 °C预变性30秒；进行25个循环，每循环包括98 °C变性10秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸3分钟；最后72 °C终延伸3分钟。PCR结束后，将扩增产物直接加入试剂盒提供的Kinase-Ligase-DpnI酶混合液中，室温孵育1小时，以实现质粒环化并去除模板DNA。
      注意：该反应体系包含1 µL PCR产物、5 µL 2X反应缓冲液、1 µL 10X Kinase-Ligase-DpnI酶混合液以及3 µL无核酸酶水。
  3. 取5 µL反应混合物加入试剂盒提供的25 µL已解冻的感受态E. coli DH5α细胞中。轻轻弹击离心管混匀，冰上放置30分钟。42 °C热激30秒后，再置于冰上5分钟。
    1. 向混合物中加入600 µL试剂盒提供的室温SOC培养基（含分解代谢物抑制的超级优化肉汤），37 °C、250 rpm振荡培养60分钟，取100 µL涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板，37 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。
  4. 挑取4–6个单菌落接种至6 mL含相应抗生素的新鲜LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡过夜培养。按照质粒提取试剂盒说明书提取各过夜培养物中的质粒DNA，并将质粒送测序服务单位进行DNA测序，依据其操作流程确认终止密码子突变是否位于正确位置。
  5. 将序列正确的菌株于-80 °C保存：取1 mL过夜培养物与300 µL 100% DMSO混合后冻存。

2. 乙酰化蛋白的表达

  1. 将优化的乙酰赖氨酰-tRNA合成酶基因33和优化的tRNAPyl 32插入到pTech质粒中。将tRNA合成酶基因置于组成型lpp启动子下游，将tRNA基因置于组成型proK启动子下游34。
    1. 通过热激法（42 °C，10 s）将含有突变TAG密码子的苹果酸脱氢酶基因的表达载体34以及携带优化乙酰赖氨酸整合系统的质粒共同转化至25 µL解冻的感受态E. coli BL21(DE3)细胞中，随后冰浴5 min。
    2. 向混合物中加入600 µL室温SOC培养基，37 °C、275 rpm振荡培养60 min，取100 µL涂布于含100 µg/mL链霉素和50 µg/mL氯霉素的平板上，37 °C、275 rpm振荡过夜培养。
  2. 从平板上挑取单菌落，接种于50 mL离心管中含100 µg/mL链霉素和50 µg/mL氯霉素的15 mL新鲜LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡过夜培养。将15 mL过夜培养物转移至1 L锥形瓶中含抗生素的300 mL新鲜LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养。
  3. 用水溶解乙酰赖氨酸，配制成100 mM储存液，4 °C保存。当培养物在600 nm处吸光度达到0.5时，向培养基中添加5 mM乙酰赖氨酸和20 mM烟酰胺（去乙酰化酶抑制剂）。
    1. 继续在37 °C、250 rpm振荡培养1 h，然后加入0.5 mM IPTG以诱导蛋白表达，并在25 °C、180 rpm振荡条件下过夜培养。
      注意：不同蛋白的表达条件可能需要优化。
  4. 在4 °C、3,000 × g条件下离心15 min收集细胞，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，含10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、137 mM NaCl、2.7 mM KCl）洗涤菌体沉淀。在4 °C、10,000 × g条件下离心5 min收集洗涤后的细胞，弃去上清液，将菌体沉淀保存于-80 °C。

3. 乙酰化蛋白的纯化

  1. 将冻存的细胞沉淀置于冰上解冻，加入15 mL裂解缓冲液（50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）pH 7.8，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，20 mM 烟酰胺）、5 µL β-巯基乙醇和1 µL 苯并酸酶核酸酶（250单位），重悬细胞。
  2. 使用40 kHz超声在70%输出功率下进行细胞破碎，共10个循环，每个循环超声10秒，间隔30秒冷却，以获得粗提物。将粗提物在4 °C下以20,000 × g离心25分钟。用0.45 µm膜过滤器过滤上清液，并上样至已用20 mL水和20 mL裂解缓冲液平衡的1 mL镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）树脂柱中。
    注意：若无超声设备，也可使用温和的去污剂裂解细胞。
  3. 用20 mL洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.8，300 mM NaCl，50 mM 咪唑，20 mM 烟酰胺）洗涤柱子，然后用2 mL洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.8，300 mM NaCl，150 mM 咪唑，20 mM 烟酰胺）进行洗脱。
  4. 按照生产商说明书，使用PD-10脱盐柱并以脱盐缓冲液（25 mM Tris pH 7.8，10 mM NaCl）对洗脱组分进行脱盐。根据Bradford蛋白检测试剂说明书测定洗脱蛋白的浓度。脱盐后的蛋白即可用于后续实验。
    注意：将蛋白配制成50%甘油溶液，于-80 °C保存。

4. 乙酰化蛋白的生化表征

  1. SDS-PAGE 和质谱分析。
    1. 在 2 mL 离心管中，用十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（5 µL 蛋白样品与 2 µL 4X SDS 上样缓冲液）于 105 °C 变性蛋白 5 分钟，2000 × g 离心 10 秒，将样品上样至 4–20% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶，200 V 电泳 30 分钟。
    2. 用蒸馏水洗涤凝胶，轻轻振荡 5 分钟，重复该过程 3 次。弃去水，加入考马斯亮蓝染色液染色 1 小时并轻轻振荡。用蒸馏水脱色，轻轻振荡 30 分钟，重复脱色步骤 3 次。
    3. 从考马斯亮蓝染色的 SDS-PAGE 凝胶上切下 33 kDa 处的条带，送至质谱分析机构或公司，以确认乙酰赖氨酸已整合至设计位置。
      注：质谱分析方案参照先前实验34。
  2. 蛋白质印迹（Western Blotting）
    1. 按照步骤 4.1 的相同方案进行 SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，将凝胶浸入转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，pH 8.3，含 20% 甲醇）中 15 分钟。
    2. 将一块 0.2 µm、7 cm × 8.5 cm 的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用甲醇活化 1 分钟，然后用转移缓冲液冲洗，再准备转移夹心结构。
      注意：甲醇在皮肤接触、眼睛接触、摄入或吸入时具有危害性。严重暴露可导致死亡。
    3. 从阴极到阳极构建转移夹心结构（海绵、滤纸、SDS-PAGE 凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵）。将夹心结构放入转移槽中，以恒定电流 350 mA 转移 45 分钟。
      注意：转移时间可能需要优化。
    4. 用 25 mL 含 0.1% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）（137 mM NaCl，20 mM Tris，0.1% Tween-20，pH 7.6）缓冲液轻轻振荡洗涤 PVDF 膜 5 分钟。用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST 缓冲液在室温下封闭膜 1 小时。
    5. 将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的乙酰赖氨酸抗体在含 5% BSA 的 TBST 中稀释至终浓度 1 µg/mL，4 °C 轻轻振荡孵育过夜。
      注意：为加快实验进程，此步骤可在室温下进行 1 小时。抗体稀释比例可能需要优化。
    6. 用 20 mL TBST 缓冲液轻轻振荡洗涤膜 5 分钟，重复该步骤 4 次。按照制造商说明将化学发光底物加入膜上。使用基于电荷耦合器件（CCD）相机的成像系统捕获信号。

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结果

乙酰化MDH蛋白的产率为每升培养液15 mg，而野生型MDH为每升培养液31 mg。纯化后的蛋白质通过SDS-PAGE进行分析，结果如图1所示。野生型MDH作为阳性对照34。从含有乙酰赖氨酸（AcK）插入系统和突变型mdh基因但培养基中不含AcK的细胞中纯化的蛋白质用作阴性对照。使用乙酰赖氨酸抗体通过蛋白质印迹法检测纯化蛋白的赖氨酸乙酰化，结果如图2所示。通过串联质谱分析确认了苹果酸脱氢酶中第140位赖氨酸残基的乙酰化，结果如图3所示。

MDH 蛋白的蛋白序列（用于串联质谱分析的片段以粗体显示）：

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讨论

非天然氨基酸（ncAAs）的遗传编码整合依赖于对指定密码子（主要是琥珀终止密码子UAG36,37,38,39）的抑制，该过程由携带相应反密码子且负载ncAA的tRNA实现。已知在细菌中，UAG密码子可被释放因子-1（RF1）识别，同时也可被宿主中携带天然氨基酸（cAAs）（如赖氨酸和酪氨酸）的近似匹配tRNA所抑制40,41。因此，ncAA在UAG密码子处的整合效率取决于负载ncAA的tRNA与RF1之间的竞争，而ncAA整合的纯度则依赖于负载ncAA的tRNA与负载cAA的近似匹配tRNA之间的竞争。目标乙酰化蛋白产量低和纯度不足可能是由于引入宿主细胞的正交对整合效率较低所致。该问题可通过提高培养基中乙酰赖氨酸（AcK）的浓度，以及使用近期优化的乙酰赖氨酸整合系统来...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号AI119813）、阿肯色大学启动资金以及阿肯色生物科学研究所奖项的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bradford 蛋白测定法Bio-Rad5000006蛋白浓度
4x Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad1610747SDS 样品缓冲液
Coomassie G-250 染色液Bio-Rad1610786SDS-PAGE 凝胶染色
4-20% SDS-PAGE 预制胶Bio-Rad4561093蛋白质检测
Ac-K-100 (HRP 偶联物)Cell Signaling6952抗体
IPTGCHEM-IMPEX194表达诱导剂
Nε-乙酰-L-赖氨酸CHEM-IMPEX5364非天然氨基酸
PD-10 脱盐柱GE Healthcare17085101脱盐
Q5 定点突变试剂盒NEBE0554引入终止密码子
BL21 (DE3) 感受态细胞NEBC2527表达菌株
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒QIAGEN27106质粒提取
Ni-NTA 树脂QIAGEN30210亲和纯化树脂
烟酰胺Sigma-AldrichN3376去乙酰化酶抑制剂
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250还原剂
BugBuster 蛋白提取试剂Sigma-Aldrich70584细胞裂解
苯甲酸酶核酸酶Sigma-AldrichE1014DNase
ECL 蛋白印迹底物ThermoFisher32106化学发光
预混 LB 肉汤VWR97064细胞生长培养基
牛血清白蛋白VWR97061-416蛋白印迹封闭

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tRNA BL21 DE3

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