该论文描述了一种基于芯片的数字PCR检测方法，用于检测胃癌患者新鲜冷冻的正常组织和肿瘤组织中一种罕见的CDH1转录本变异体（CDH1a）。
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本文内容
摘要
摘要
CDH1a 是 CDH1 基因的一种非经典转录本，已被发现表达于某些胃癌（GC）细胞系中，而在正常的胃黏膜中则无表达。近期，我们在来自胃癌患者的冷冻新鲜肿瘤组织中检测到了 CDH1a 转录变体。本文所介绍的基于芯片的数字PCR（dPCR）方法被用于检测该变体在组织样本中的表达。dPCR能够对核酸进行准确、稳健且高度敏感的定量分析，目前正被广泛应用于不同领域的多种研究中。dPCR具备检测稀有靶标的能力，同时可在无需校准品和标准曲线的情况下实现核酸的绝对定量和精确测量。实际上，反应体系的分区化可从背景中富集目标分子，从而提高扩增效率以及对抑制物的耐受性。这些特性使dPCR成为检测 CDH1a 稀有转录本的理想工具。
引言
的 CDH1 基因编码E-cadherin，该蛋白是维持正常胃上皮结构的关键因子，通过调控细胞黏附、存活、增殖和迁移发挥作用1. 由于有害的种系或体细胞改变导致 E-cadherin 蛋白丢失 CDH1 与胃癌的发生有关2,3该基因第2个内含子产生的非经典转录本也被假定在胃癌发生中发挥作用4,5特别是其中一个转录本， CDH1a，已在胃癌细胞系中被证实有表达，但在正常胃组织中缺失4我们最近检测到 CDH1a 在胃癌患者的胃癌组织样本中使用基于芯片的数字PCR5. dPCR 首次被用于评估以下物质的存在： CDH1a 肠道杯状细胞和正常组织中的基因转录本。
确定基因表达的金标准方法是实时定量PCR（qPCR）。然而，所得数据有时可能具有变异性且质量较差，尤其是当样本中靶标含量较低时。这种变异性可能由污染物引起，这些污染物会抑制聚合酶活性和引物退火，导致非特异性扩增和竞争性副反应
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方案
该方案遵循 IRST 人类研究伦理委员会的指导原则。
注意：本实验步骤专为检测人新鲜冷冻组织中极少量的cDNA分子而设计。该组织 组织切片是在干冰上、仍处于冷冻状态时，从未前已验证的患者来源的胃部肿瘤或正常组织样本中切取的。
1. RNA 的提取与纯化
- RNA 提取
注意：RNA 分离在通风橱中使用特定产品进行（参见材料表）。然而，市面上有多种不同的分离试剂盒可供选择。- 在 1.5 mL 离心管中加入 50 - 100 mg 细切的新鲜冷冻组织样本和 1 mL RNA 分离试剂，剧烈涡旋振荡 15 秒。将离心管在 -80 °C 下孵育过夜。
- 将含有样本的离心管在室温下孵育 5 分钟，并通过涡旋振荡 15 秒混匀。
- 将离心管置于冰上，加入 200 µL 氯仿，剧烈涡旋振荡 15 秒。
- 在室温下孵育离心管 60 秒，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
- 将水相转移至一个 1.5 mL 离心管中，并加入 20 µg 甘油原。
注意：为减少污染，应仔细避免转移任何中间相或有机相。 - 加入 500 µL 异丙醇，倒置离心管混匀，在冰上孵育 10....
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结果
使用本文所述方法，我们检测了稀有转录变体的表达情况 CDH1a 在胃部新鲜冷冻组织中。采用数字PCR（dPCR）对21对配对的正常与癌组织样本以及11个额外的肿瘤样本进行了分析。 CDH1a 在32个肿瘤样本中，有15个（47%）可检测到该稀有转录本，而所有正常组织样本均未检出5在我们的分析中，数据点少于13,000的芯片以及加样不均匀的芯片均被剔除。 图1 显示两种可评估的芯片视图（图1A）以及不可评估（图1B，C）样品。对于后者情况，由于存在多个气泡，芯片必须弃用（图1B），一个大气泡（图1C），或由于阈值以上的数据点数量不足（
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讨论
数字PCR（dPCR）最初是为DNA分子检测而开发的10,11,12,13，随后该技术被改进用于微小RNA和RNA转录本的定量分析5,14,15。在本实验方案中，我们进一步拓展了其应用范围，实现了对新鲜冷冻组织样本中稀有转录本的检测。为此，我们使用了相对较高量的cDNA（300 ng）。尽管该用量并非dPCR可允许的上限，但已足以建立标准化条件，用于所有样本间的比较。通过将荧光信号阈值设定为6,000，并仔细观察芯片及散点图上阳性扩增信号的位置，我们成功在胃癌肿瘤组织样本中检测到了这一稀有靶标。
由于目标分子含量极低，我们无法通过数字PCR（d.......
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披露
作者报告本研究无利益冲突。
致谢
作者感谢Gráinne Tierney提供的编辑协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TRIazol 试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| 糖原 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute 纯化试剂盒 | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA 合成试剂盒 | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D 数字 PCR 主混合液 v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT 定制设计检测 | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR 优化检测浓度：900 nM (F)， 900 nM (R)，250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D 数字 PCR 20K 芯片试剂盒 v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| 热循环仪（Labcycler） | Sensocquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR 系统 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| 双平块样品模块 | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| 用于双平块 GeneAmp PCR 系统 9700 的 QuantStudio 3D 倾斜底座 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| 用于平块热循环仪的 QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片适配器套件 | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片加载器 | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| 带电源线的 QuantStudio 3D 数字 PCR 仪器 | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
参考文献
- van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
- Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Le....
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重印与许可
