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方法文章

通过基于芯片的数字PCR在新鲜冷冻胃癌组织中检测到一种罕见的CDH1转录本变异体

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DOI：

10.3791/57066

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2018年2月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

本文内容

摘要

该论文描述了一种基于芯片的数字PCR检测方法，用于检测胃癌患者新鲜冷冻的正常组织和肿瘤组织中一种罕见的CDH1转录本变异体（CDH1a）。

摘要

CDH1a 是 CDH1 基因的一种非经典转录本，已被发现表达于某些胃癌（GC）细胞系中，而在正常的胃黏膜中则无表达。近期，我们在来自胃癌患者的冷冻新鲜肿瘤组织中检测到了 CDH1a 转录变体。本文所介绍的基于芯片的数字PCR（dPCR）方法被用于检测该变体在组织样本中的表达。dPCR能够对核酸进行准确、稳健且高度敏感的定量分析，目前正被广泛应用于不同领域的多种研究中。dPCR具备检测稀有靶标的能力，同时可在无需校准品和标准曲线的情况下实现核酸的绝对定量和精确测量。实际上，反应体系的分区化可从背景中富集目标分子，从而提高扩增效率以及对抑制物的耐受性。这些特性使dPCR成为检测 CDH1a 稀有转录本的理想工具。

引言

的 CDH1 基因编码E-cadherin，该蛋白是维持正常胃上皮结构的关键因子，通过调控细胞黏附、存活、增殖和迁移发挥作用1. 由于有害的种系或体细胞改变导致 E-cadherin 蛋白丢失 CDH1 与胃癌的发生有关2,3该基因第2个内含子产生的非经典转录本也被假定在胃癌发生中发挥作用4,5特别是其中一个转录本， CDH1a，已在胃癌细胞系中被证实有表达，但在正常胃组织中缺失4我们最近检测到 CDH1a 在胃癌患者的胃癌组织样本中使用基于芯片的数字PCR5. dPCR 首次被用于评估以下物质的存在： CDH1a 肠道杯状细胞和正常组织中的基因转录本。

确定基因表达的金标准方法是实时定量PCR（qPCR）。然而，所得数据有时可能具有变异性且质量较差，尤其是当样本中靶标含量较低时。这种变异性可能由污染物引起，这些污染物会抑制聚合酶活性和引物退火，导致非特异性扩增和竞争性副反应6。

尽管数字PCR（dPCR）的基本生物化学原理与定量PCR（qPCR）相似，但dPCR具有一些优势，能够对基因组DNA（gDNA）/互补DNA（cDNA）分子进行极为精确的定量。实际上，dPCR是一种终点反应，依赖于将样品均一分割成数千个独立反应单元（微孔），使得每个微孔中包含零个或单个目标分子。扩增仅在含有目标分子拷贝的微孔中发生，并通过荧光信号进行检测。随后，通过泊松二项统计学方法计算阳性微孔数与总微孔数的比例，即可推算出原始样品中目标分子的绝对数量7。

此外，数字PCR（dPCR）技术无需构建标准曲线，从而避免了由此带来的偏差和变异性，可实现对目标分子的直接定量8,9；由于dPCR对抑制剂具有高度耐受性，其结果不受污染物和扩增效率的影响，因而具有更高的精确度和可重复性10；相比qPCR，dPCR具有更高的灵敏度和特异性，因此是检测稀有目标分子的可靠方法。最后，将样本分割为多个独立反应体系可减少背景分子的竞争，提高目标分子的检出限，使扩增成为可能，并有助于对单个基因组DNA（gDNA）或互补DNA（cDNA）分子的检测6。基于芯片的dPCR在核酸的检测与定量中应用日益广泛，尤其适用于拷贝数变异分析、DNA片段定量以及突变分析11,12,13，这得益于该方法的高精度和低样本投入需求。此外，dPCR近年来也已整合应用于微小RNA（microRNA）14和基因转录本5,15的分析中。

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方案

该方案遵循 IRST 人类研究伦理委员会的指导原则。

注意：本实验步骤专为检测人新鲜冷冻组织中极少量的cDNA分子而设计。该组织 组织切片是在干冰上、仍处于冷冻状态时，从未前已验证的患者来源的胃部肿瘤或正常组织样本中切取的。

1. RNA 的提取与纯化

  1. RNA 提取
    注意：RNA 分离在通风橱中使用特定产品进行（参见材料表）。然而，市面上有多种不同的分离试剂盒可供选择。
    1. 在 1.5 mL 离心管中加入 50 - 100 mg 细切的新鲜冷冻组织样本和 1 mL RNA 分离试剂，剧烈涡旋振荡 15 秒。将离心管在 -80 °C 下孵育过夜。
    2. 将含有样本的离心管在室温下孵育 5 分钟，并通过涡旋振荡 15 秒混匀。
    3. 将离心管置于冰上，加入 200 µL 氯仿，剧烈涡旋振荡 15 秒。
    4. 在室温下孵育离心管 60 秒，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
    5. 将水相转移至一个 1.5 mL 离心管中，并加入 20 µg 甘油原。
      注意：为减少污染，应仔细避免转移任何中间相或有机相。
    6. 加入 500 µL 异丙醇，倒置离心管混匀，在冰上孵育 10 分钟。
    7. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟以沉淀 RNA。
      注意：RNA 将以凝胶状沉淀的形式附着在离心管壁和底部，离心后通常不可见。
    8. 小心移除上清液，不要扰动沉淀，用 1 mL 75% 乙醇通过移液洗涤沉淀。
    9. 在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟，移除上清液，不要扰动沉淀。
    10. 让沉淀干燥至透明，然后将其溶解于 50 µL 无 RNase 水中。
    11. 在定量前，将样本在 -80 °C 下冷冻至少过夜。
  2. 基因组 DNA 去除与 RNA 纯化
    注意：为消化污染性 DNA，建议对低丰度靶标分析采用 DNase 消化步骤，随后进行基于离心柱的 RNA 纯化。
    1. 使用注射器将冻干的 DNase I（1,500 Kunitz 单位）溶解于 550 µL 无 RNase 水中，轻轻倒置小瓶混匀，并将复溶后的储备液分装成若干 aliquot。
    2. 在 1.5 mL 离心管中加入含 15 µg RNA 的样本体积、10 µL 试剂盒中的 DNase 消化缓冲液（见材料表）、2.5 µL DNase I 储备液以及无 RNase 水，总体积调至 100 µL。在室温下孵育 10 分钟。
    3. 加入 350 µL 组织裂解缓冲液（来自试剂盒，见材料表），通过移液混匀。
    4. 加入 250 µL 100% 乙醇，通过移液混匀。
    5. 将全部体积（700 µL）转移至新的离心柱中，在 12,000 × g 下离心 15 秒。
    6. 将滤柱转移至新的收集管中，向柱中加入 500 µL 80% 乙醇，在 12,000 × g 下离心 2 分钟。
    7. 打开离心柱盖，在 12,000 × g 下用新的收集管离心 5 分钟以干燥滤膜，然后将滤柱转移至一个 1.5 mL 离心管中。
    8. 直接向滤柱中加入 14 µL 无 RNase 水，在 12,000 × g 下离心 1 分钟。
    9. 将样本置于冰上，取 2 µL 样本使用台式分光光度计进行定量，或在 -80 °C 下储存 RNA 以备后续使用。

2. cDNA 合成

  1. 在无菌PCR管中加入1,000 ng RNA、4 µL主混合液、1 µL逆转录酶及无RNase水，调整终体积至20 µL。轻轻混匀后离心。
  2. 将反应体系置于热循环仪中孵育，程序如下：25 °C孵育5分钟，42 °C孵育30分钟，85 °C孵育5分钟。
  3. 短暂离心管子，随后进行dPCR分析，或于-20 °C保存待用。

3. 数字PCR反应体系的建立

  1.  dPCR 反应体系配制与样品准备
    1. 将预混液和探针在室温下解冻至少 20 分钟。
    2. 将 cDNA 样品稀释至 6 µL 水中，浓度为 300 ng。
    3. 轻轻涡旋混匀预混液，并在无菌离心管中配制反应体系：加入 8.7 µL 预混液、0.87 µL 自行设计的 CDH1a 探针引物以及 1.83 µL 无核酸酶水，最终体积为 11.4 µL。
      注：有关 CDH1a 自行设计探针引物的详细信息，请参见材料表。
    4. 将 11.4 µL 配制好的反应体系转移至已稀释的 cDNA 样品中，轻轻混匀后短暂离心。
      注：所列体积已包含 20% 的过量，以补偿移液过程中的损耗。为所有样品及无模板对照（NTC）配制反应体系。
  2. 芯片准备
    注意：为获得最佳结果，请尽快加载芯片。
    1. 接通芯片加载仪电源，等待指示灯变为绿色。
    2. 轻轻向后拉动浸没液注射器活塞 1–2 mm 后松开，以便取下注射器帽，然后安装上针头。
    3. 取一枚新芯片，记录盖板上的编码，以便与样品对应。
    4. 小心握住盖板边缘，撕去保护膜，并将粘性面朝上按正确方向放置盖板。
    5. 小心拿起芯片，避免接触内部区域，通过按下杠杆打开夹具，将芯片正确放入芯片托座中。
    6. 将新的加载刀片安装到加载仪上，并轻轻推入以确保其牢固就位。
    7. 将 14.5 µL dPCR 反应体系转移至加载刀片上，避免产生气泡或使刀片弯曲，随后按下黑色加载按钮，将液体分配至芯片上。
    8. 使用浸没液注射器向芯片表面滴加约 20 滴液体，注意针头不要接触芯片表面。
      注：必须完全覆盖整个表面，同时避免液体溢出边缘。
    9. 旋转加载臂，使盖板与芯片接触，并压下 15 秒。
    10. 按下盖板释放按钮，取出芯片并将机械臂复位。
    11. 将组装好的芯片以 45° 角持握，通过注液口用注射器小心加入浸没液，轻微旋转芯片以确保无气泡残留，并用无菌擦拭纸去除多余液体。
    12. 轻轻撕去芯片盖板顶部的标签，将密封贴片覆盖注液口并按压至少 5 秒，完成芯片密封。
    13. 将芯片避光保存，待放入热循环仪时使用。
      注：制备好的芯片应在 2 小时内使用。
  3. dPCR 反应
    1. 打开热循环仪盖板，为两个温控模块均安装适配器，即使仅使用一个模块也需如此操作。
    2. 将芯片按正确位置放置在样品模块上。
      注：注液口必须朝向热循环仪前方并处于抬高位置，以便任何气泡可上浮至顶部，而不影响芯片观察窗区域。使用空芯片平衡两个模块。
    3. 将导热垫放置在样品模块上，完全覆盖所有芯片。
    4. 关闭盖板并启动 PCR 程序，设置如下条件：96 °C 持温 10 分钟；进行 45 个循环（60 °C 延伸 2 分钟，98 °C 变性 30 秒）；60 °C 持温 2 分钟；4 °C 持温。关闭热循环仪，将芯片在室温下静置解冻至少 10 分钟。
      注：芯片分析必须在 1 小时内完成。
  4. 芯片分析
    1. 打开仪器盖板，取下导热垫，然后从适配器中取出芯片。
      注：在分析前，将芯片存放于避光、洁净的环境中。
    2. 使用异丙醇和无菌擦拭纸清洁芯片表面。
      注：检查每枚芯片是否存在泄漏或其他潜在问题。
    3. 将 USB 插入检测系统以保存数据。
    4. 打开检测系统的芯片托盘，将芯片正面朝上按正确位置放入，然后关闭托盘。
    5. 等待 30 秒进行处理，随后取出芯片并插入下一张。
    6. 等待所有已处理芯片的分析完成后，将 USB 插入计算机以传输文件。
      注：每张芯片的分析总时间约为 2 至 3 分钟。

4. 数据分析与解释

  1. 连接到执行所有下游分析所需的基于云的软件平台。
  2. 创建一个项目并导入所有目标芯片的数据文件。
  3. 输入样本名称；选择所用的染料和检测方法 "定义芯片" 表。
  4. 通过可视化检测芯片是否可接受 "审查数据" 标签，检查样本在芯片上的加载程度以及可评估的数据点数量。
    注意：拒绝评估数量少于13,000个的有效芯片 数据点。
  5. 转到屏幕右侧所选芯片的散点图；对所有芯片的荧光素酰胺（FAM）报告染料信号（Y轴）应用6,000的阈值。
    注意：设定的阈值可能因所用检测方法的不同而有所差异。
  6. 使用套索工具在散点图上选择相应斑点并按下，以去除可疑的阳性信号，防止出现假阳性结果 "未确定"所有剩余的阳性斑点表明所分析稀有靶标cDNA拷贝的存在。

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结果

使用本文所述方法，我们检测了稀有转录变体的表达情况 CDH1a 在胃部新鲜冷冻组织中。采用数字PCR（dPCR）对21对配对的正常与癌组织样本以及11个额外的肿瘤样本进行了分析。 CDH1a 在32个肿瘤样本中，有15个（47%）可检测到该稀有转录本，而所有正常组织样本均未检出5在我们的分析中，数据点少于13,000的芯片以及加样不均匀的芯片均被剔除。 图1 显示两种可评估的芯片视图（图1A）以及不可评估（图1B，C）样品。对于后者情况，由于存在多个气泡，芯片必须弃用（图1B），一个大气泡（图1C），或由于阈值以上的数据点数量不足（

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讨论

数字PCR（dPCR）最初是为DNA分子检测而开发的10,11,12,13，随后该技术被改进用于微小RNA和RNA转录本的定量分析5,14,15。在本实验方案中，我们进一步拓展了其应用范围，实现了对新鲜冷冻组织样本中稀有转录本的检测。为此，我们使用了相对较高量的cDNA（300 ng）。尽管该用量并非dPCR可允许的上限，但已足以建立标准化条件，用于所有样本间的比较。通过将荧光信号阈值设定为6,000，并仔细观察芯片及散点图上阳性扩增信号的位置，我们成功在胃癌肿瘤组织样本中检测到了这一稀有靶标。

由于目标分子含量极低，我们无法通过数字PCR（d...

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披露

作者报告本研究无利益冲突。

致谢

作者感谢Gráinne Tierney提供的编辑协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
TRIazol 试剂Thermo Fisher Scientific15596018
糖原 20 mg/mlROCHE10901393001
RNeasy MinElute 纯化试剂盒QIAGEN74204
iScript cDNA 合成试剂盒BioRad1708891
QuantStudio 3D 数字 PCR 主混合液 v2Thermo Fisher ScientificA26358
CDH1a IDT 定制设计检测Integrated DNA Technologies (IDT)NAF) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG
(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG
(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/
[dPCR 优化检测浓度：900 nM (F)，        900 nM (R)，250 nM (P)]
QuantStudio 3D 数字 PCR 20K 芯片试剂盒 v2Thermo Fisher ScientificA26316
Heraeus Biofuge FrescoThermo  Scientific75002402
热循环仪（Labcycler）Sensocquest011-103
GeneAmp PCR 系统 9700Thermo Fisher ScientificN805-0200
双平块样品模块Thermo Fisher Scientific4425757
用于双平块 GeneAmp PCR 系统 9700 的 QuantStudio 3D 倾斜底座Thermo Fisher Scientific4486414
用于平块热循环仪的 QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片适配器套件Thermo Fisher Scientific4485513
QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片加载器Thermo Fisher Scientific4482592
带电源线的 QuantStudio 3D 数字 PCR 仪器Thermo Fisher Scientific4489084

参考文献

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